乙二醛酶基因的全基因组分析和表达分析家庭在燕麦(燕麦属漂白亚麻纤维卷非生物压力)显示他们的反应在种子萌发

1介绍

活性二羰基化合物,包括甲基乙二醛(毫克),乙二醛(去),和3-deoxyglucosone (3-DG),是主要的有毒代谢物自发产生的各种代谢途径在植物暴露于压力,和这些化合物会阻碍正常的生长和发育Chinchansure et al ., 2015;Ramu矿et al ., 2020)。毫克,这是最普遍的活性二羰基化合物,非酶的反应的副产品是通过糖酵解和卡尔文循环,通过蛋白质和脂肪酸代谢和酶通路(Kaur et al ., 2014;高木涉et al ., 2014)。高浓度的毫克可以作为他们自发形成细胞毒性,细胞晚期糖化终产物(年龄)与核酸相互作用时,蛋白质和脂质(Kaur et al ., 2014;Singla-Pareek et al ., 2020)。然而,尽管其潜在细胞毒性在高浓度时,MG还充当一个重要的信号分子参与各种生物过程(Singla-Pareek et al ., 2020)。因此,维护MG体内平衡是至关重要的对植物的正常生长和发育。

植物通过乙二醛酶系统维护MG体内平衡和non-glyoxalase系统。前者主要是由三个酶,即乙二醛酶(GLX1, GLXI或GLYI),也称为lactoylglutathione裂合酶(EC 4.4.1.5);乙二醛酶II (GLX2 GLXII或GLYII),也称为hydroxyacylglutathione水解酶(EC 3.1.2.6);和乙二醛酶III (GLX3 GLYIII或DJ-1) (李,2016)。谷胱甘肽与MG自发反应形成hemithioacetal (HTA),然后转换成S-D-lactoylglutathione GLX1 (SLG)。GLX2水解SLG D-lactate生产谷胱甘肽,然后回收到系统(Thornalley 1990)。的功能这两个GSH-dependent乙二醛酶已广泛探索植物和回顾了MG解毒、细胞衰老、信号转导、细胞分裂和分化,淀粉合成、授粉,营养反应和应激反应(Singla-Pareek et al ., 2020)。其中,压力反应被认为是他们的主要功能(Kaur et al ., 2014;Hasanuzzaman et al ., 2017)。GLX1和GLX2变化显著的表达和活动在不同的压力条件下,如缺氧、盐、干旱、炎热,寒冷,和重金属(Kaur et al ., 2014;Sankaranarayanan领导et al ., 2017)。GLX3,小说DJ-I乙二醛酶酶的蛋白质家族,直接催化转换MG D-lactate (Ghosh et al ., 2016)。只有少数研究调查GLX3在植物和谷类作物模型,证明其参与应激反应(Jana et al ., 2021;Kumar et al ., 2021;Gambhir et al ., 2023)。最近的研究表明,GLX1和GLX2也参与调节种子活力栽培稻和拟南芥(施密茨et al ., 2017;刘et al ., 2022),但他们的角色在种子开发、存储和萌发仍知之甚少。

乙二醛酶基因的鉴定和功能分析家庭成员获得了显著的关注由于乙二醛酶酶的不同功能。虽然GLX1和GLX2基因已经被全基因组中确定模型植物和重要的农作物,如拟南芥(Mustafiz et al ., 2011),o .漂白亚麻纤维卷(Mustafiz et al ., 2011),高粱二色的(Bhowal et al ., 2020),大豆(Ghosh和伊斯兰教,2016年),芸苔属植物拉伯(燕et al ., 2018),全基因组鉴定GLX3是有限的(李et al ., 2019;Jana et al ., 2021;燕et al ., 2023)。值得注意的是,这两个GLX1和GLX2这些物种基因在不同亚细胞本地化(有多个成员李,2016)。GLX1s分为两种类型:倪^{2 +}端依赖和锌^{2 +}端依赖(施密茨et al ., 2018),而GLX2s属于beta-lactamase蛋白家族和铁组成的双核的金属中心^{3 +}、锌^{2 +}、锰^{2 +}(先令et al ., 2003)。GLX3s属于DJ-1 / PfpI总科,不需要金属离子的最佳活动(Ghosh et al ., 2016)。的识别和分析GLX1,GLX2,GLX3基因是理解的关键调节植物生长、发展,应激反应。

燕麦(答:漂白亚麻纤维卷)是一个重要的粮食和饲料作物,最近它的基因组发布的数据(Rasane et al ., 2015;Kamal et al ., 2022;彭et al ., 2022),但还没有被广泛的研究GLX1,GLX2,GLX3基因。因此,这些基因的识别和表达分析在全基因组水平将有助于迅速推进抗灾燕麦育种和种子活力提高。在先前的研究中,我们发现了一个密切联系GSH-dependent乙二醛酶和AsA-GSH周期与燕麦种子活力,在谷胱甘肽含量作为潜在的种子发芽率的标志(太阳et al ., 2022 b)。我们还进行了全基因组的谷胱甘肽还原酶(GR)在AsA-GSH周期的基因和分析其表达模式在压力条件下种子萌发(太阳et al ., 2022 a)。本研究的目的是确定的GLX1,GLX2,GLX3基因在燕麦全基因组水平,进行染色体映射,系统发育分析,同线性分析,守恒的域分析,独联体监管元素和亚细胞定位预测,和组织分析。此外,这些成员在种子萌发的作用在压力条件下将使用qPCR进行分析。乙二醛酶基因家族在oat的综合分析将大大有助于基因增强抗压力和种子活力的重要作物。

2材料和方法

2.1识别和染色体映射AsGLX1, AsGLX2和AsGLX3基因

隐马尔可夫模型HMM()文件的保守域GLX1, GLX2, GLX3蛋白质,包括守恒的乙二醛酶域(PF00903),金属-β-内酰胺酶域(PF00753)和DJ-1 / PfpI域(PF01965),得到的数据库(包含了Mustafiz et al ., 2011;Ghosh et al ., 2016;Bhowal et al ., 2020)。TBtools软件的简单的嗯搜索模块是用来执行的一致性嗯文件oat基因组(PepsiCo_OT3098_v2_genome,https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)最初确定燕麦GLX1,GLX2,GLX3基因。蛋白质序列被提交的网站包含了个人确认守恒的域,并最终确定GLX1的成员,GLX2, GLX3家庭。

TBtools软件也使用可视化的染色体分布燕麦GLX1,GLX2,GLX3基因(陈et al ., 2020)。燕麦的命名法GLX1,GLX2,GLX3基因跟着国际小麦基因命名规则(http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/98/intro.htm),这可能反映了这些基因的染色体位置在oat subgenomes。

2.2系统树,基因重复,同线性分析AsGLX1, AsGLX2, AsGLX3成员

确定AsGLX1、AsGLX2 AsGLX3成员与乙二醛酶成员保持一致拟南芥和o .漂白亚麻纤维卷使用ClustalX (v2.1)和默认设置(拉金et al ., 2007)。的蛋白质序列o .漂白亚麻纤维卷和拟南芥GLX1s、GLX2s GLX3s用于系统发育分析来自以前公布的全基因组鉴定研究Mustafiz et al ., 2011;Ghosh et al ., 2016)。系统发育树构建使用neighbor-joining方法在大型6.0中,用10000引导程序测试和支持值表示为基于1000复制(百分比田村et al ., 2013)。基因重复事件进行了分析使用多重共线性扫描工具包(MCScanX)使用默认参数(王et al ., 2012)。说明的种间syntenic关系GLX1,GLX2,GLX3基因之间的燕麦,拟南芥,o .漂白亚麻纤维卷阴谋,同线性分析构造使用双同线性绘图仪MC ScanX TBtools (陈et al ., 2020)。

2.3理化性质和亚细胞定位的AsGLX1s, AsGLX2s, AsGLX3s

在线程序ExPaSy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)是利用分析AsGLX1的物理和化学性质,AsGLX2, AsGLX3蛋白质,包括氨基酸(AA)数量、分子量(MW),和理论等电点(π),不稳定指数(II),带负电荷的残留物(协助),和带正电的残留物(pcr)。蛋白质亚细胞定位预测使用在线工具,包括狼PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/),CELLov.2.5 (http://CELLO.life.nctu.edu.tw/)和Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)。

2.4域架构AsGLX1s, AsGLX2s, AsGLX3s

TBtools软件被用于分析蛋白质域AsGLX1s,对齐AsGLX2s, AsGLX3s嗯文件(陈et al ., 2020)。

2.5识别独联体监管在启动子元素AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因

全面调查潜在的反应AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因对压力,我们提取的一个假定的2 kb上游的启动子区域基因从oat基因组序列和识别独联体监管元素使用PlantCARE在线工具(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。这可能有助于进一步探索乙二醛酶基因的转录调控机制,揭示其角色在植物开发和应激反应。

2.6不同组织在oat的抽样

执行组织表达分析AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因,燕麦(cv挑战者)样本收集的种子,根、叶、茎,小花,前题。种子样本收集在自吸阶段(0 h、12 h和24 h)和开发阶段(8、15和30天开花后,DAF)。在开花阶段,年轻的叶子,前题,收集和小花,而老叶子从植物获得30 DAF)。根系研究中使用来自10天大的植物。在这项研究中使用的所有种子发芽率为100%。

2.7压力治疗在燕麦种子萌发和取样

种子萌发是植物生长室中进行使用塑料培养皿(11.5厘米×11.5厘米)包含三层滤纸和50个黑暗种子在16小时和8小时光周期根据国际种子检验协会的指导方针(ISTA 2019)。正常种子吸胀在蒸馏水20°C是用作控制(CK),而盐、干旱、和MG压力治疗采用150 mM氯化钠的解决方案(徐et al ., 2021),20% PEG6000 (谢et al ., 2021)和10毫米毫克(霍克et al ., 2012),分别。冷处理是由吸入种子在蒸馏水10°C。种子在30天也喝蒸馏水在20°C。种子老化治疗是基于夏et al。(描述的方法夏et al ., 2020)。种子样本收集0 h后6 h, 12 h, 24小时,36 h和72 h(自吸,每次治疗组成的三个生物复制,和20种子收集作为一个复制。

2.8存在的基因表达分析和统计分析

从燕麦提取的总RNA组织样本使用快速RNA隔离设备(Huayueyang生物技术有限公司,中国)。1的合成第一链cDNAμg使用EasyScript RNA^®一体化的第一链cDNA合成SuperMix qPCR工具包(TransGen生物技术,中国)。CFX96实时系统的执行中存在使用2×RealStar快速SYBR qPCR混合(Genstar,中国)AsEIF4A参考基因(杨et al ., 2020)。热循环程序如下:95°C的初始步骤3分钟,其次是40 95°C的周期为15秒和60°C 30年代。使用2的相对表达水平确定^-ΔΔCt方法。

不同组织之间的相对表达水平的比较分析采用方差分析和邓肯的测试在SPSS统计22和可视化使用GraphPad Prism 8.0版。的表达式的热图AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因在种子萌发在压力下使用TBtools创建。使用学生的重要表达变化进行了计算t测试。中使用的引物的细节中存在化验中列出表S1。

3的结果

3.1识别和燕麦乙二醛酶基因的染色体映射

通过全基因组排列在oat, 26岁AsGLX1基因,14AsGLX2基因,和15AsGLX3基因被确定。显示所有26个染色体映射AsGLX1基因是均匀分布的,与10 C和D subgenomes subgenome和8 C和D subgenomes。AsGLX1基因在染色体组1 9基因,但只有一个基因在染色体组5。至于14AsGLX2基因,他们也在subgenomes均匀分布,与5 A和C subgenomes,和4 D subgenome。AsGLX2每个染色体上基因只出现一次。关于AsGLX35基因,基因位于subgenome, 4 C subgenome、6 D subgenome。AsGLX3基因在染色体组1和2不存在,但高度代表在染色体组3和7中,两个基因位于每个3 a, 3 c, 3 d, 7和7 d染色体。此外,一些基因的GLX1和燕麦GLX3家庭是相邻的染色体上(图1)。

3.2系统发育分析AsGLX1s AsGLX2s, AsGLX3s

阐明oat GLX家庭的成员之间的系统发育关系,氨基酸抗酸系统发育树构建使用GLX1s序列,GLX2s,和GLX3s燕麦,拟南芥,o .漂白亚麻纤维卷(图2)。值得注意的是,GLX1成员的数量超过GLX2和GLX3答:漂白亚麻纤维卷,o .漂白亚麻纤维卷,拟南芥。26 AsGLX1s被分为两个演化支。进化枝我由11 AsGLX1s 4 AtGLX1s和5 OsGLX1s,虽然进化枝二包含16 AsGLX1s 7 AtGLX1s, 6 OsGLX1s (图2一个)。14 AsGLX2s分为四个演化支,我和二分化枝只包含AsGLX2s进化枝,分别与2和6成员。进化枝III包括1 AtGLX2 1 OsGLX2s和3 AsGLX2s,而第四进化枝组成3 AsGLX2s 4 AtGLX2s, 2 OsGLX2s (图2 b)。此外,15 AsGLX3 (AsDJ-1)成员也分为四个演化支,进化枝我包含3 AtDJ-1s AsDJ-1s 2 OsDJ-1s, 3。进化枝II包括1 OsDJ-1和3 AsDJ-1s,进化枝III包括1 AtDJ-1s AsDJ-1s 1 OsDJ-1s, 3。进化枝IV AtDJ-1最多的成员,包括2 AtDJ-1s 2 OsDJ-1s, 6 AsDJ-1s (图2 c)。

3.3基因重复和同线性分析GLX1,GLX2,GLX3基因

基因重复分析显示,某些基因成对的GLX1和GLX3基因家族,即AsGLX1-3A1和AsGLX1-3A2,AsDJ-1-3A1和AsDJ-1-3A2,AsDJ-1-3D1和AsDJ-1-3D2串联重复的结果,他们相邻的染色体。然而,没有证据表明节段重复的基因被发现在GLX1, GLX2, GLX3家庭(图1)。

燕麦和水稻之间的同线性分析,以及拟南芥显示,没有燕麦和之间的共线性拟南芥乙二醛酶基因家族。然而,观察燕麦和水稻之间的共线性GLX1,GLX2,GLX3基因家族。具体地说,18AsGLX1基因与8显示共线性o .漂白亚麻纤维卷基因,9AsGLX2基因与4显示共线性o .漂白亚麻纤维卷基因,和8AsDJ-1基因与3显示共线性o .漂白亚麻纤维卷基因(图3 a - c)。其中共线基因对,OsGLYI6在oat同源基因的数量最多,有六个同源基因(AsGLX1-1A3,AsGLX1-1C3,AsGLX1-1D3,AsGLX1-3A1,AsGLX1-3C,AsGLX1-3D1)。第二个最高的是OsGLYI1有五个燕麦同源基因(AsGLX1-1A3,AsGLX1-1D3,AsGLX1-3A1,AsGLX1-3C,AsGLX1-3D1)。OsGLYII3有三个燕麦同源基因包括AsGLX2-5A,AsGLX2-5C,AsGLX2-5D。同样的,OsDJ-1A有三个同源基因(AsDJ-1-3A2,AsDJ-1-3C2,AsDJ-1-3D2),OsDJ-1E也有三个燕麦同源基因(AsDJ-1-4C,AsDJ-1-7A1,AsDJ-1-7D1)。

3.4理化性质和亚细胞定位的AsGLX1s, AsGLX2s, AsGLX3s

在线的亚细胞定位预测AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因显示,这些基因主要表达在细胞质中,叶绿体和线粒体(表S2)。预测结果的基础上两个或三个在线服务器,13 AsGLX1家族的基因被发现在细胞质中表达,17日在叶绿体中,线粒体和4。同时,5 AsGLX2家族的基因被发现在细胞质中表达,7 8在叶绿体和线粒体。此外,5 AsGLX3家族的基因被发现在细胞质中表达,13在叶绿体、线粒体和3。此外,AsGLX1-2A在线预测的所有三个服务器在细胞核中表达。其他成员,包括6AsGLX1s6AsGLX2s和4AsGLX3s预测,由一个程序可能在细胞核中表达,表明这些成员对维护核稳定很重要。

通过氨基酸的计算长度,分子量,等电点,理论不稳定指数,并指控AsGLX1残留物,AsGLX2, AsGLX3蛋白质,发现在26 AsGLX1成员,分子量范围从15.219到94.136 kDa,氨基酸的长度范围从140至834 AA AA,和π从4.81到8.98不等。其中,12个蛋白质的不稳定指数小于40岁和20个蛋白质丰富的带负电荷的残留物。AsGLX2的14名成员,分子量范围从32.495到143.432 kDa,氨基酸的长度范围从297至1300 AA AA,和π从5.87到9.12不等。其中,4蛋白质的不稳定指数小于40岁和11个蛋白是丰富的带负电荷的残留物。至于AsGLX3的15个成员国,分子量范围从41.235到76.399 kDa,氨基酸的长度范围从395至723 AA AA,和π从4.90到9.26不等。其中,5蛋白质的不稳定指数小于40岁和11蛋白质丰富的带负电荷的残留物(表S2)。

3.5域分析AsGLX1s, AsGLX2s, AsGLX3s

乙二醛酶家庭的保守域分析显示,所有AsGLX1s拥有守恒的乙二醛酶域,AsGLX2s拥有守恒metallo-β-lactamase域,AsGLX3s拥有两个守恒DJ-1 / PfpI域(图4)。AsGLX1成员之间、AsGLX1-1A1 AsGLX1-1C1、AsGLX1-1D1 AsGLX1-6C, AsGLX1-6A2, AsGLX1-7A, AsGLX1-7C1, AsGLX1-7D拥有两个守恒的乙二醛酶域,与第一个域组成的120 aa和第二个域组成的115年AsGLX1-1A1 aa, AsGLX1-1C1, AsGLX1-1D1, AsGLX1-6C, AsGLX1-6A2,而第一个域是121 aa和第二个域是120年AsGLX1-7A aa, AsGLX1-7C1, AsGLX1-7D。这八个成员,连同AtGLYI-3、AtGLYI-6 OsGLYI2, OsGLYI7, OsGLYI11,属于进化枝我和倪^{2 +}端依赖GLX1s。AsGLX1-5D AsGLX1-6A1只包含一个乙二醛酶域,长度141 aa,和属于同一分支进化枝我AtGLYI-2 OsGLYI8,表明他们是锌^{2 +}端依赖GLX1s。AsGLX1-1A2、AsGLX1-1D2 AsGLX1-1C2,域长度115 aa,属于进化枝我但不是倪^{2 +}端依赖GLX1s。13个AsGLX1s功能域从108年到295年aa在进化枝II可能GLX1-like蛋白质。此外,AsGLX1-1C3一个逆转录酶域(RVT_1)和AsGLX1-2A NADH脱氢酶复杂我亚基域(NdhM)密切相关,其预测叶绿体定位(图2一个,4)。

AsGLX2-5A、AsGLX2-5C AsGLX2-5D属于进化枝IV GLX2家族,由一个内酰胺酶的存在特征域(148 aa)和B HAGH_C域(hydroxyacylglutathione水解酶c端)与84 aa。这三个成员共享一个守恒金属ion-binding网站(THHHYDH)。进化枝三世GLX2家族的成员包括包含内酰胺酶B的域with169 aa,而内酰胺酶B 6 AsGLX2s域进化枝二世是154 aa。AsGLX2s进化枝我,包括AsGLX2-2C AsGLX2-2A,内酰胺酶B域名156 aa和158 aa的长度,分别。的活性位点AsGLX2-5A、AsGLX2-5C AsGLX2-5D, AsGLX2-3A, AsGLX2-3C, AsGLX2-3D, AsGLX2-2C,碧残渣和AsGLX2-2A所有功能,对催化活性至关重要。除了内酰胺酶B域和HAGH_C域,有些AsGLX2s还包含其他领域如Pre-mRNA 3 '端处理酶聚腺苷酸化因子c项域(cpsf73 - 100 _c) Beta-Casp域,Zn-dependent metallo-hydrolase RNA特异性域(RMMBL) GAG-pre-integrase域,和4 fe-4s单一集群域的铁氧还蛋白(Fer4_13) (图2 b,4 b)。

尽管所有AsDJ-1s有两个DJ-1 / PfpI域,在氨基酸的长度有差异,这些成员之间连接两个领域。氨基酸的数量两个域之间的进化枝我AsDJ-1家族成员较短,从11至14 aa,而两个域之间的氨基酸在其他三个成员的演化支长,从39到41 aa,除了AsDJ-1-3C2, 15 aa。此外,AsDJ-1-3A2和AsDJ-1-3D2各有一个Helix-loop-helix DNA结合域(通过),AsDJ-1-6A有一盒相关领域(FBA_3)和AsDJ-1-5D有一盒域(盒)(图2 c,4摄氏度)。

3.6摄氏度是乙二醛酶基因启动子区域的监管元素

分析上游2 kb的启动子区域AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因显示基本CAAT-box真核生物启动子元素和着重广泛分布于这些基因的启动子区域。其他独联体监管主要元素相关激素响应能力,无氧感应,国防和应力响应,光响应性,胚乳表达,MYB结合位点,分生组织表达和seed-specific监管(图5)。激素响应元素主要包括ABA、GA、惩罚、SA和IAA的响应能力。压力反应主要是低温、厌氧感应,国防和压力响应。除了核心元素、激素响应中最丰富的元素AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3推广者,占47%,46%,和53%的所有元素,分别是(表S3)。光响应性也存在高比例的元素AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因启动子,分别占32%、24%和23%。在激素响应元素,ABA反应中最丰富的元素AsGLX1基因启动子,约占50%,而惩罚响应中最丰富的元素AsGLX2和AsGLX3基因启动子,分别占46%和55%。元素与不利条件下存在数量降序排列AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因启动子,即厌氧感应、低温反应,国防和应激反应(表S3)。这三个基因家族与seed-specific监管元素包含三个基因的启动子区域,即AsGLX1-1A3,AsGLX1-3A1,AsGLX1-4C,AsGLX2-2A,AsGLX2-3A,AsGLX2-4D,AsDJ-1-3A1,AsDJ-1-3D1,AsDJ-1-3D2。此外,MYB绑定网站元素也广泛分布在三个基因家族基因的启动子,尤其是AsGLX2,每个成员的基因启动子区域包含MYB结合位点的元素(图5)。

3.7组织表达分析AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因

从每个的三名成员AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因家族是随机选择在不同的演化支不同的域成分和蛋白质独联体有效成分调查他们的组织表达。AsGLX1-1A1和AsGLX2-2D显示,叶子高表达水平,尤其是在老叶子,并预测在叶绿体本地化,表明其重要性在叶功能和开发(图6 a, D,表S2)。AsGLX1-7A和AsGLX1-3D2表现出最高的表达水平在干燥的种子,种子开发期间与表达水平增加,表明他们的角色在种子发展潜力和脱水(图6 b, C)。AsGLX2-3C发芽种子和根中高度表达,但表达水平较低的树叶,这是符合其预测线粒体定位(图6 e,表S2)。AsDJ-1-3D2,AsDJ-1-4C,AsDJ-1-5D显示高表达水平的叶子,颖片,干种子,期间与表达水平逐渐提高和发展种子,种子开发(图6胃肠道)。总的来说,AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因表现出相对较高的表达水平在叶子和种子,暗示他们潜在的角色在维持叶功能和种子活力。

3.8表达分析AsGLX1基因在压力下种子萌发

的表达模式AsGLX1-1A1和AsGLX1-7A在种子萌发显示类似的减少和增加的趋势,AsGLX1-3D2发芽过程中表现出明显的趋势逐渐减少。时效处理后,的表达水平AsGLX1-1A1和AsGLX1-7A在种子显著减少,而表达的水平AsGLX1-3D2显示无显著变化(图7,补充表4)。

控制相比,AsGLX1-1A1显示0-36 h吸水时的年龄差别明显对这些种子,它显示相对较小的变化在吸取早期阶段(他一直h)冷,挂钩,盐,和MG治疗。然而,治疗24小时后,AsGLX1-1A1表达显著诱导,特别是下盐,寒冷,MG治疗72 h(自吸(图7)。AsGLX1-3D2表现出了相对较小的改变在冷处理,没有显著区别控制和治疗在24 h和72 h。AsGLX1-3D2最多是调节自吸时间点挂钩和MG治疗期间,在岁的种子,指示其解毒作用在盯住下种子萌发和MG压力和时效处理后(图7 b)。AsGLX1-7A显著诱导期间为0 - 72 h自吸钉治疗,与最重要的upregulation发生在72 h。然而,表达水平的AsGLX1-7A岁干种子显著下降,明显高于控制在早期自吸(6 - 12 h),但明显低于不显著不同的控制在24 - 72 h(自吸,暗示潜在作用初期老化种子的萌发。此外,AsGLX1-7A显著诱导下冷,盐,和MG治疗自吸时间点除了24 h在寒冷和盐治疗或36 h MG治疗(下图7 c)。总的来说,AsGLX1基因表现出特异性,以应对不同的压力,AsGLX1-3D2和AsGLX1-7A可能发挥重要的解毒作用在压力条件下种子萌发。

3.9表达分析AsGLX2基因在压力下种子萌发

这三个的反应AsGLX2基因治疗压力相对较小的测试相比AsGLX1基因。时效处理后,两者兼而有之AsGLX2-3C和AsGLX2-5D展出,差别明显对这些AsGLX2-2D2显示与CK相比无显著差异(图8,补充表4)。

AsGLX2-2D2在表达显著上调自吸在冷处理,除了12 h,并显示明显反应在24 h和36 h。种子,岁AsGLX2-2D2显示几乎没有明显的反应。AsGLX2-2D2差异在24 h和36 h(自吸在盐胁迫下,在72 h时上调MG治疗(图8)。AsGLX2-3C显示弱反应不同的吸入治疗在早期阶段,,只是表达显著上调下钉治疗12 h和显著下调6 h岁自吸的种子。在24-36 h(自吸,AsGLX2-3C差异在不同的治疗,除了明显的下调在年龄在36 h(自吸种子。在吸入72 h,的表达AsGLX2-3C相比没有显著差异控制在不同治疗(图8 b)。AsGLX2-5D也显示出强烈的反响在冷处理,并上调历史点除了36 h(自吸。在挂钩和盐治疗,AsGLX2-5D显示,表达水平无显著差异控制在大多数时间点相比,除了明显的下调在72 h钉治疗。AsGLX2-5D表达显著上调2倍以上在年龄12 h(自吸种子,和它的表达水平明显高于控制在6 h(自吸下MG治疗(图8 c)。总的来说,AsGLX2基因显示出更重要的冷处理,来显示他们的重要作用保持种子活力或冷应激下促进种子萌发。

3.10表达分析AsDJ-1基因在压力下种子萌发

的AsDJ-1基因表现出多样的种子吸水时应对各种压力,AsDJ-1-5D显示更明显对压力的反应,而反应AsDJ-1-4C和AsDJ-1-3D2是相对次要的。时效处理后,所有三个测试AsDJ-1(差别基因显示出实质性的对这些图9,补充表4)。

AsDJ-1-3D2显示最重要的反应在MG治疗,显著upregulation相比控制三十六小时,和最重要的反应发生在6 h。在冷处理,AsDJ-1-3D2显著调节在12 h和显著下调72 h。显著调节在6日到24日h钉治疗,并显示一个重要反应在12 h和72 h的自吸盐治疗。在种子岁显著调节吸入早期阶段(6 - 12 h) (图9)。AsDJ-1-4C没有任何明显的反应在盐治疗。在寒冷和钉治疗,早期吸水时表现出显著的反应阶段,和冷治疗显著诱导其表达6 h(自吸。在种子的表达水平AsDJ-1-4C显著调节吸入早期阶段(6 - 12小时),然后显示明显降低。此外,在MG治疗,其表达水平显著调节6 h, 36 h, 72 h的自吸(图9 b)。AsDJ-1-5D显著调节下的自吸钉治疗期间,特别是在早期自吸阶段(6 - 12 h)。没有明显的反应在冷治疗24小时,下盐治疗h。72在其他时间点,冷和盐治疗显著诱导的表达吗AsDJ-1-5D。自吸过程中种子,岁AsDJ-1-5D在6日到24日,h显著调节最重要的反应观察到6 h,增加超过5折。MG治疗下,其表达水平只是显著调节6 h (图9 c)。总的来说,AsDJ-1-5D有一个相对强劲的解毒作用早期老化种子的萌发阶段,在钉治疗。

4讨论

乙二醛酶参与各种植物的生物过程(Singla-Pareek et al ., 2020),如应激反应(Kaur et al ., 2014),种子萌发(施密茨et al ., 2017)、植物衰老(Singla-Pareek et al ., 2009)、营养调控(Borysiuk et al ., 2022),信号转导(Sankaranarayanan领导et al ., 2017)、淀粉合成(你et al ., 2019),和花粉的开发(Sankaranarayanan领导et al ., 2015)。它们在植物中的主要作用是解毒毫克,这是自然生产的植物和显著积累在非生物胁迫如盐度、干旱、重金属,和较低的温度,从而阻碍植物生长与发展(Kaur et al ., 2014;Hasanuzzaman et al ., 2017;Sankaranarayanan领导et al ., 2017)。高等植物通常包含多个成员GLX1,GLX2,GLX3基因家族,展示他们的亚细胞定位的变化,不同成员表达模式和功能角色(Ghosh和伊斯兰教,2016年;施密茨et al ., 2017;Singla-Pareek et al ., 2020)。因此,一个全面的全基因组乙二醛酶基因家族的识别和理解他们的染色体分布、进化关系,守恒的域,独联体监管元素,和基因表达模式是探索乙二醛酶的功能多样性的关键基因和提高植物抗逆性。

GSH-dependent通路由GLX1清算MG的主要途径,GLX2酶,导致植物乙二醛酶先前的研究主要集中在这两个酶。然而,GSH-independent GLX3最近才收到关注。全基因组的识别和分析GLX1 GLX2家庭已经完成在各种各样的植物。在拟南芥,共11所示GLX1基因和5GLX2基因被确定,而11GLX1基因和3GLX2基因被发现o .漂白亚麻纤维卷(Mustafiz et al ., 2011)。在g·马克斯,24岁GLX1基因和12GLX2基因被确定(Ghosh和伊斯兰教,2016年)。在美国二色的,15GLX1基因和6GLX2基因被发现(Bhowal et al ., 2020)。然而,广泛的全基因组乙二醛酶的识别家庭忽视了GLX3基因,只有少数的植物,如Medicago truncatula和诉酿酒用葡萄,系统地确定了GLX1 GLX2, GLX3家庭(Ghosh 2017;李et al ., 2019)。此外,最近的研究也单独确定GLX3s在某些植物物种。例如,217 GLX3s获得通过使用AtDJ-1d (AT3g02720)比较Swiss-Prot数据库,包括8选用物种,2小麦属植物物种,大麦芽,玉米,美国二色的,Setaria italica,Brachypodium distachyon。其中,12 GLX3s被确定o .漂白亚麻纤维卷,这是由6基因和强烈诱导毫克(编码Ghosh et al ., 2016)。来洞察GLX3的进化模式,GLX3s在原核生物和真核生物的演变进行了研究,和183年GLX3s属于69种用于进化分析植物(Kumar et al ., 2021)。总之,研究植物GLX3已经成为一个焦点和热点,并系统分析GLX1, GLX2和GLX3成员将在工厂改善起着重要的作用。

共有26个AsGLX1基因,14AsGLX2基因,和15AsGLX3在oat基因被确定。的数量AsGLX1和AsGLX2基因识别拟南芥,o .漂白亚麻纤维卷,g·马克斯,美国二色的,b·拉伯低于燕麦,这可能与基因组复制事件在进化过程中(Ghosh和伊斯兰教,2016年;燕et al ., 2018;Bhowal et al ., 2020;彭et al ., 2022)。在二级分支的进化树GLX1, GLX2, GLX3,有两个或三个燕麦同源基因,来自两个或三个燕麦subgenomes (A, C和D),对应于一个拟南芥乙二醛酶基因。燕麦有二倍体和四倍体的祖先,基因组复制可能是主要原因的同源基因在燕麦(彭et al ., 2022)。一些演化支只包含GLX成员o .漂白亚麻纤维卷和燕麦,如OsGLYI11、AsGLX1-7A AsGLX1-C1, AsGLX1-D GLX1,以及OsDJ-1A AsDJ-1-3A1, AsDJ-1-3C1, AsDJ-1-3D1 GLX3,表明这三个家庭异步演化而来的o .漂白亚麻纤维卷、燕麦和拟南芥基因组。此外,基因重复事件的分析AsGLX1,AsGLX2,AsGLX3基因显示,只有AsGLX1和AsGLX3基因家族串联重复,而所有的三个家庭节段重复。相比之下,在o .漂白亚麻纤维卷,拟南芥,显著和g·马克斯基因的复制,GLX1和GLX2节段性所造成的基因重复,而不是串联重复(Mustafiz et al ., 2011;Ghosh和伊斯兰教,2016年;燕et al ., 2023)。因此,有显著差异基因重复事件发生在乙二醛酶家庭在不同的植物物种。

AsGLX1家族成员,AsGLX1-1A1、AsGLX1-1C1 AsGLX1-1D1, AsGLX1-6C, AsGLX1-6A2, AsGLX1-7A, AsGLX1-7C1, AsGLX1-7D,包含两个守恒的乙二醛酶域和集群与倪^{2 +}端依赖GLX1成员拟南芥,这表明它们是倪^{2 +}端依赖AsGLX1s。AsGLX1-5D和AsGLX1-6A1包含一个乙二醛酶域长度和141个氨基酸的集群和锌^{2 +}端依赖GLX1s在拟南芥和o .漂白亚麻纤维卷,这表明它们是锌^{2 +}端依赖AsGLX1s (Ghosh和伊斯兰教,2016年;Bhowal et al ., 2020)。GLX1取决于二价金属离子的活动,和早期的研究表明,二价离子的类型GLX1活动所需原核生物和真核生物之间的不同。GLXI在人类和酵母锌^{2 +}端依赖,而GLX1大肠杆菌需要倪^{2 +}为了获得最佳的活动(他et al ., 2000年)。然而,研究植物已经确定了两种类型的二阶ion-dependent GLX1s。例如,在拟南芥,AtGLYI2依赖锌^{2 +},而AtGLYI3和AtGLYI6依赖倪^{2 +}。大多数研究在功能上的植物GLX1s都集中在这两个类型,用更少的研究在其他GLX1-like蛋白质。在o .漂白亚麻纤维卷,OsGLYII-1 ethylmalonic encephalopathy-1活动,可以激活^{2 +},OsGLYII-2双核的锌/铁中心在其活性部位,对其活动是至关重要的。AsGLX2-5A、AsGLX2-5C AsGLX2-5D都内酰胺酶B和HAGH_C域,所有含有守恒THHHYDH金属ion-binding网站和活动网站,表明这些成员编码假定的功能活动AsGLX2酶(Ghosh和伊斯兰教,2016年;Bhowal et al ., 2020;Singla-Pareek et al ., 2020)。GLX2酶与这两个领域,包括THHHYDH和碧网站,已确定在高粱等其他植物(SbGLYII-3和SbGLYII-4)和葡萄(VvGLYII-like1和VvGLYII-like2) (Ghosh和伊斯兰教,2016年;李et al ., 2019)。

亚细胞定位预测分析显示,AsGLX1s主要表达在细胞质中,叶绿体、线粒体、AsGLX2s主要表达在叶绿体和线粒体,AsGLX3s主要表达在叶绿体。叶绿体和线粒体细胞器负责光合作用和呼吸作用,分别是新陈代谢活跃。他们不仅是活性氧的主要来源,但也潜在的细胞器MG生产(Hasanuzzaman et al ., 2017)。过度MG已经发现抑制光合作用,破坏线粒体功能(Kaur et al ., 2016)。在压力条件下,叶绿体和线粒体组件通常为糖化热点(特里帕西et al ., 2023)。乙二醛酶酶的表达和活性在叶绿体和线粒体保护光合系统和线粒体功能的关键。此外,还有一些成员函数在细胞核中,这可能是重要的保护和维护核DNA和RNA的稳定性。例如,在高粱、SbGLYI-8/8.1蛋白质也发现港口假定的核本地化信号,因此,可能促进核MG SLG的转换(Bhowal et al ., 2020)。OsGLYI-8位于细胞核和可以减轻核引起的DNA损伤毫克(Kaur et al ., 2017)。

通过组织表达分析的一些成员,发现他们的表达模式与亚细胞定位预测是一致的。例如,AsGLX1-7A预测是在细胞质中表达和被发现在发展中高度表达的种子和干种子。AsGLX2-3C被预测为主要表达在线粒体和被发现根中高度表达,鲜花,干种子和种子汲取了24 h。AsDJ-1-4C预测是在叶绿体和细胞质表达和被发现高度表达的干种子和叶子。总的来说,大部分的测试成员表达在叶子和干燥的种子,在维持叶功能来显示他们的重要作用和种子活力。AsGLX1-3D2只表现在发展中国家和干种子,表明其功能可能seed-specific,如加强种子耐压力在种子成熟和脱水。在拟南芥和o .漂白亚麻纤维卷,AtGLYI8,OsGLYI3,OsGLYI10也发现在发展中高度表达的种子(Mustafiz et al ., 2011)。乙二醛酶已被建议在种子发展发挥重要作用,种子萌发和种子活力的监管。在拟南芥,胞质GLXI3同种型适用于消除毒性羰基活性物种在萌发和幼苗建立(施密茨et al ., 2017)。而缺乏AtGLYI2导致严重抑制种子发芽在MG治疗,和盐胁迫下幼苗的生长也是有限的(刘et al ., 2022)。在大米、OsGLYI7参与胚乳淀粉合成,及其变异显著降低淀粉含量和淀粉合成基因的表达改变(你et al ., 2019)。同时,OsGLYI3特别表现在水稻种子和有助于种子寿命和盐胁迫耐受性(刘et al ., 2022)。AsGLX2-3C根和花中高度表达,从其他成员表现出显著差异,可能在根和花的发育起到解毒作用。在显著,GLX1 self-incompatibility授粉和目标所需的系统(Sankaranarayanan领导et al ., 2015)。先前的研究主要被忽视的乙二醛酶的作用在种子。不同的表达模式和亚细胞定位GLX1,GLX2,GLX3基因在植物功能多样性提供了一个基础,在种子及其重要作用在未来应给予更多的关注。

乙二醛酶基因的表达模式的家庭,特别是GLX1和GLX2基因,在压力下都进行了广泛的研究。GLX1而GLX2转录水平和酶活性可能引起的各种不利条件下(Kaur et al ., 2014;Sankaranarayanan领导et al ., 2017)。但是他们的表达模式在种子萌发已经很少报道。然而,从种子播种育苗阶段,建立作物经常遭受压力,如干旱、低温、或盐度,这可以导致作物产量显著降低。因此,表达模式的分析GLX1,GLX2,GLX3在压力条件下基因在种子萌发是至关重要的理解他们的角色在调节种子活力和应对压力。在这项研究中,发现GLX1基因AsGLX1-3D2和AsGLX1-7A可能发挥重要作用在解毒压力条件下种子萌发。他们被冷显著诱导、干旱、盐、镁、发芽和老化治疗的早期阶段(6小时和12小时)。AsGLX2-5D在发芽的早期阶段调节冷、镁、和老化的感应,而AsGLX2-3C被各种压力诱导的后期(24 h - 72 h)自吸,表明这些基因可能发挥解毒作用在压力条件下种子萌发,但特异性压力的时间和类型。GLX1, GLX2转基因植物常常表现出压力阻力的增加,而他们function-deficient突变体表现出减少压力电阻(Kaur et al ., 2014;Kaur et al ., 2016;Sankaranarayanan领导et al ., 2017)。例如,在拟南芥互补的AtGLYI2和大米同族体OsGLYI8显著增强抗压力atglyI-2突变体(Kaur et al ., 2017)。过度的OsGLYII3在烟草显著提高植物抵抗MG和氯化钠(Singla-Pareek et al ., 2003)。过度的OsGLYII2在大肠杆菌和烟草导致显著增加阻力MG和盐压力,改善植物光合性能和减少氧化损伤(Ghosh et al ., 2014)。表达式分析GLX3成员,AsDJ-1-3D2,AsDJ-1-4C,AsDJ-1-5 AsDJ-1-5D,显示重要的应对压力的早期阶段,种子吸水时,AsDJ-1-5 AsDJ-1-5D被显著调节整个自吸过程应力条件下如寒冷、干旱、盐、和老化。在这两个大肠arundinaceus和商业甘蔗混合动力车,通用电气三世应对干旱和盐胁迫克二世和克我的表达水平通用电气三世高压力下(Manoj et al ., 2019)。此外,过度的追随者三世在高粱授予在干旱和盐胁迫的抗性显著改善,就是明证增加脯氨酸和可溶性糖的水平,增强光合作用和抗氧化能力,降低脂质过氧化作用的转基因线(Mohanan et al ., 2020;Mohanan et al ., 2021)。尽管研究GLX3基因在植物中是有限的,他们都显示的巨大潜力GLX3在打击不利的条件。

在这项研究中,人们发现AsGLX1-7A有两个乙二醛酶域和倪^{2 +}端依赖GLX1位于细胞质中,基因表达水平高的种子。AsGLX2-5D THHHYDH金属离子和碧活跃的网站,可能在线粒体发挥保护作用,对呼吸和应激反应的重要种子发芽。AsDJ-1-5D有两个守恒DJ-1域和高种子基因表达水平。三个基因显示重要的应对各种压力和编码假定的乙二醛酶酶功能活跃。此外,AsGLX1-3D2seed-specifically表示,AsGLX1-2A可能在保护功能核酸在压力条件下稳定。这些乙二醛酶基因家族的成员可以在未来的研究集中在潜在候选基因燕麦抗逆性育种和种子活力提高。

5的结论

燕麦基因的识别压力阻力和种子活力监管代表一个至关重要的努力在oat分子育种、作物产量和种质资源保护的重要意义。本研究发现,燕麦有更多乙二醛酶基因比其他植物物种在进化过程中由于基因组复制事件和串联重复。这些基因通常是由荷尔蒙和应对不利的条件。各自不同的组织表达模式和亚细胞的本地化显示其功能多样性植物,尤其是在叶片发育和种子活力形成。AsGLX1-3D2具体表现在种子,AsGLX1-2A可能发挥重要作用在缓解核酸糖化。此外,AsGLX1-7A潜在倪^{2 +}端依赖GLX1活动,AsDJ-1-5D双DJ-1域,两者都可以极大地应对寒冷、干旱、盐、镁和衰老的治疗方法。AsGLX2-5D有潜力GLX2活动并能应对寒冷,老化,MG压力。突出显示这些基因是有前途的候选人为进一步调查燕麦压力阻力或种子活力的监管。然而,其他成员的特定功能AsGLX1, AsGLX2, AsGLX3家庭需要进一步调查。然而,这样的研究可能会导致新策略的发展与改进育种燕麦的承受力和种子活力通过乙二醛酶基因的利用。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

作者的贡献

点的构思和设计实验。女士和学生进行实验和分析数据。ZJ公司,JW,赫兹和WM导致了实验。女士,学生写了论文,毫升和点修改。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究受到了研发种子涂层技术的关键在青藏高原牧场草(SJCZFY2022-10)和汽车(CARS-34)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2023.1215084/full补充材料

引用