原始研究的文章

前面。植物科学。,02 June 2023
秒。功能和应用植物基因组学
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1185440

全基因组分析WD40蛋白质家族和功能描述bvwd40 - 82在甜菜

Zhirui吴¹

Tingyue张¹

Jinna李¹

官府陈²

印加r .笑容 ^3、4

德米特里·o·Zharkov^3、4

Yu Bing ^{1 *}

海鹰李 ^{1 *}

¹农业微生物学技术工程研究中心、教育部和黑龙江省级重点实验室的植物基因工程和生物发酵工程寒冷地区与分子生物学重点实验室,黑龙江省&学院生命科学学院,黑龙江大学,哈尔滨,中国
²生物学系,密西西比大学,牛津大学,美国女士
³自然科学部门,新西伯利亚州立大学,俄罗斯新西伯利亚
⁴化学生物学和基本医学研究所,西伯利亚的俄罗斯科学院,俄罗斯新西伯利亚

甜菜是世界上最重要的糖作物之一。它有助于全球糖产量,但盐胁迫消极地影响作物产量。WD40蛋白质扮演重要角色在植物生长和响应非生物压力通过参与多种生物学过程,如信号转导、组蛋白修饰、泛素化,RNA加工。WD40蛋白家族已经被充分研究过的拟南芥、大米和其他植物,但系统分析的甜菜WD40蛋白质尚未报道。在这项研究中,共有177名BvWD40蛋白质从甜菜基因被确定,和他们的进化特征,蛋白质结构、基因结构、蛋白质相互作用网络和基因本体进行了系统地分析了解他们的进化和功能。与此同时,的表达模式BvWD40s在盐胁迫下的特点,bvwd40 - 82基因被假设为耐盐候选基因。其功能进一步利用分子和遗传特征的方法。结果表明,bvwd40 - 82增强的转基因耐盐胁迫拟南芥幼苗通过增加osmolytes和抗氧化酶活动的内容,维持细胞内离子体内平衡和增加SOS和ABA通路相关基因的表达。其结果为进一步的研究奠定了基础BvWD40在甜菜耐盐胁迫的基因,它可能通知生物技术应用在改善作物压力弹性。

介绍

WD40蛋白质的进化和广泛分布于真核生物。他们倾向于由4至16 WD40域,这也被称为WD40重复(世界发展报告》)(史密斯et al ., 1999)。《世界发展报告》一般由40到60个氨基酸残基,与GH (glycine-histidine)二肽的n端和WD (tryptophan-aspartate)在糖基二肽(从不et al ., 1994)。《世界发展报告》通常折叠成一个高度稳定的seven-bladedβ-propeller (Stirnimann et al ., 2010),连接的n端氨基酸残基在一个封闭的循环,这决定了特定的蛋白质功能(Mishra et al ., 2012)。

WD40蛋白质家族成员已确定在许多植物。例如,植物的引用拟南芥有230个WD40蛋白(李et al ., 2014)。经济作物中报道,有225 WD40蛋白质红圣人(丹参)(刘et al ., 2020),187 WD40蛋白质在蔷薇科(罗莎对“老脸红”)(太阳et al ., 2020),42 WD40核桃蛋白(胡桃regia),204年无花果WD40s (无花果)(陈et al ., 2022 a;风扇et al ., 2022)。此外,小麦在粮食作物中,(小麦)743年WD40蛋白(胡锦涛等人。,2018年)、土豆(茄属植物tuberosum)168年WD40蛋白(道et al ., 2019),和大米(栽培稻)200年WD40蛋白(欧阳et al ., 2012)。然而,在甜菜WD40蛋白家族(甜菜属L)并没有被报道。作为一个最大的蛋白质家族,WD40曾被认为是蛋白质支架招募其他分子形成功能性配合物或参与蛋白质-蛋白质之间的关系(李和罗伯茨,2001年)。近年来,大量的研究表明,WD40有多种生物功能的蛋白质。在动物,它们参与许多生物过程,包括信号转导(梁et al ., 2022),组蛋白修饰(Lorton给出et al ., 2020),DNA损伤反应(崔et al ., 2022)、转录调节(莫et al ., 2023)、核糖体生物合成(Barandun et al ., 2018),蛋白质降解和细胞凋亡(et al ., 2022;Cai et al ., 2022)。在植物,WD40蛋白质通常被认为是一个重要的监管机构的一些生物过程,如花青素生物合成(霁et al ., 2023),开花的分生组织开发(公园et al ., 2019)、配子形成(施et al ., 2005)、胚胎发生(金正日et al ., 2021)和产量(陈et al ., 2022 b)。此外,基因编码WD40蛋白质还扮演了一个重要的角色在植物对非生物胁迫的响应。例如,过度的TaPUB1基因在烟草增强烟草通过减少钠盐耐受性⁺积累和活性氧(ROS)的转基因植物,增加antioxidant-related基因的表达(Zhang et al ., 2017)。此外,一个AtXIW1基因拟南芥阿坝响应中发挥了积极作用。突变的AtXIW1抑制ABA-responsive基因的诱导和积累ABI5,并导致快速的蛋白酶体降解ABI5 (徐et al ., 2019)。此外,抑制水稻OsRACK1A表达增强水稻耐盐通过保持较高的K⁺/ Na⁺和减少丙二醛(MDA)的积累。操作系统RACK1A被发现与许多盐胁迫响应蛋白减少米饭的盐耐受性(Zhang et al ., 2018)。最近,超表达的另一种形式TaWD40-4B.1干旱胁迫下基因增加转基因小麦的生物量。的助教WD40-4B。1protein interacts with助教CAT3蛋白促进他们齐聚反应和过氧化氢酶活性在干旱胁迫下,导致改进抗旱转基因小麦(田et al ., 2023)。

甜菜是一种苋科二年生草本植物,是世界上重要的糖作物,占世界上-25%的年度20%糖生产(汗et al ., 2019)。甜菜也是一个重要经济作物在中国东北,和它的根具有较高的经济价值(Thiruvengadam et al ., 2022)。甜菜是盐土植物耐受盐和碱的压力。世界上随着盐碱地的增加,作物生产和食品安全已经成为一个巨大的挑战Kopecka et al ., 2023)。植物耐盐基因的系统识别对提高作物压力弹性和增加产量是迫切需要(马et al ., 2017;霁et al ., 2019)。自从WD40蛋白质也参与许多生物过程包括植物生长和应激反应,我们假设一些WD40蛋白质编码基因在盐土植物甜菜扮演重要角色在植物盐胁迫宽容。在这项研究中,我们分析了序列WD40家族的蛋白质在甜菜基因组中。的表达谱BvWD40盐胁迫下的基因特征。的一个基因,bvwd40 - 82,被发现赋予植物盐胁迫宽容。结果不仅突出了实用的基因功能分析全基因组信息学通知,但也为社区提供了重要的资源,进一步探索的角色WD40基因作物压力弹性和屈服。

材料和方法

的识别Bv在甜菜WD40蛋白质

的种子文件WD40域从InterPro下载数据库(www.ebi.ac.uk interpro /包含/ PF00400 / /条目)。隐马尔科夫模型(HMM)的WD40域构造使用HMMER计划(Mistry et al ., 2013),甜菜NCBI蛋白质数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov基因组搜索和比较。E值被用来屏幕候选蛋白(E值< 0.05)和智能(http://smart.embl-heidelberg.de/)是用于验证和确认BvWD40成员包含WD40域。的守恒的图案BvMEME WD40s预测的程序(meme-suite.org/tools/meme)。域和守恒的图案BvWD40s被TBtools可视化(陈et al ., 2020)。各自的理论分子量和等电点BvWD40分析通过使用Expasy工具(web.expasy.org/compute_pi/)。

系统发育分析

177年的序列BvWD40蛋白质从NCBI下载,然后multi-sequence对齐的BvWD40s是由Clustal W (拉金et al ., 2007)。trimAl用来修剪序列(Capella-Gutierrez et al ., 2009)。的参数被设置为分数序列允许差距为0.8,最小平均相似度为0.001,最小的百分比80%的职位保留在原来的路线。删除文件导入到IQ-TREE 2 (明et al ., 2020),系统树与1000年建立了最大似然方法复制的引导。

基因结构、染色体定位和基因重复的分析BvWD40基因

基因组注释文件、编码序列(CDS),和序列BvWD40基因从NCBI下载。基因结构模式的地图BvWD40s得到的德牧网站(gsds.gao-lab.org/)。我们使用TBtools地图BvWD40s染色体位置信息。根据前面的数据(李et al ., 2014),我们补充拟南芥WD40基因与新发现WD40基因:AT1G05631.1,AT1G51690.1,AT1G655801.1,AT2G31830.1,AT2G439001,AT3G56990.1,总共236人AtWD40s被获得。之间的共线性关系BvWD40s和AtWD40s分析了MCScanX (王et al ., 2012),甜菜和共线性映射拟南芥是由圆环(Krzywinski et al ., 2009)。

交互网络、基因表达分析和本体的分析

的Bv从字符串获得WD40蛋白质相互作用网络的网站(cn.string-db.org/)(Szklarczyk et al ., 2015使用Cytoscape)和可视化软件(香农et al ., 2003)。的RNA-seq数据b .寻常的从NCBI SRA数据库下载(加入:PRJNA666117)。的转录组数据BvM14线在盐胁迫下生成并存储在实验室。的表达谱BvWD40基因被TBtools软件。基因本体论的基本数据分析得到的网络数据库(geneontology.org/),注释和浓缩的BvWD40基因进行使用TBtools和可视化的一个在线工具(www.bioinformatics.com.cn)。

植物材料和盐胁迫处理

的BvM14行是一个单体的额外的线之间的交叉和回交得到的二倍体野生甜菜种植甜菜和四倍体,由李实验室(创建和传播甜菜属l,VV+1C, 2n= 18 + 1)(李et al ., 2022 b)。种子消毒,培养在水培系统之前报道(马et al ., 2017;霁et al ., 2019)。日益增长的第三条完全展开后叶子,叶子和根取样采用试剂盒法提取总RNA (孟和费尔德曼,2010年)。三个生物进行了复制。引物3 + (www.primer3plus.com)被用来设计特定的引物,18 srna被用来作为参考。使用SYBR执行中存在,并使用2相对基因表达进行了计算^-ΔΔCt方法(Schmittgen Livak, 2008)。

答:芥哥伦比亚生态型(Col-0)种子从ABRC获得(abrc.org),并在1/2 MS培养基发芽300µmol / m²光强度,14 h光和10 h黑暗。八天之后,苗女士被转移到一个新的媒介(有或没有150毫米氯化钠)7天进一步筛选转基因植物,或观察他们的盐胁迫下生长表型。土壤和蛭石在2:1混合后,在180°C消毒烘干机,种子被播种在土壤混合。经过21天的文化(相对湿度65% - -75%,22°C,光16 h /黑8 h),种子是150毫米氯化钠盐胁迫处理,和三个植物选择与一致的增长从每一行后面的生理/生化分析和RNA提取。

的亚细胞定位bvwd40 - 82和一代的转基因线

的bvwd40 - 82基因是pCAMVBIA2300-35S-eYFP向量构造及其亚细胞定位是由激光扫描共焦显微镜观察(FV1200,奥林巴斯)。的核苷酸序列AtUTP18的同源基因bvwd40 - 82基因拟南芥通过NCBI在线BLASTN软件。为了构造utp18突变植物来形容这个基因的功能,在线工具CRISPR-P2.0 (cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)是用于选择适当的目标和构建CRISPR / Cas9向量(pNGG2F向量)。后感染野生的花朵拟南芥,utp18纯合突变体是通过潮霉素B(30毫克/升)筛查和TA克隆测序。的bvwd40 - 82基因构建到pCAMBIA1300-35S-3xFLAG向量,野生型拟南芥和utp18突变线改变了植物的侵扰,每个植物的种子收集并放置在女士中含有潮霉素B(30毫克/升),和幼苗正常生长被安置在大约十天后文化的土壤。DNA和RNA的提取每个转基因植物的叶子后4周进行DNA验证和rt - pcr。T3代纯合子转基因线(OE异种超表达,OE # 16日# 17日OE # 18;不等的互补,有限公司# 1、# 2,有限公司# 5)被用于进一步分析。

生理生化指标测定

每个转基因幼苗根长和野生型幼苗有或没有150毫米氯化钠治疗MS培养基的决心。干重和鲜重(有或没有150毫米土壤中的氯化钠)也进行了分析。MDA含量、SOD和POD酶活性进行了分析使用以前公布的方法(马et al ., 2017;霁et al ., 2019);在525 nm(甜菜碱含量测定Swarna et al ., 2013);Na⁺K⁺,Ca^{2 +}内容被火焰原子吸收分析方法,如前所述(高et al ., 2016)。

结果

在甜菜WD40蛋白质的识别

总共有177BvWD40s获得通过删除冗余和重复序列的蛋白质。基于相应的位置这些蛋白质的基因9甜菜染色体,他们命名BvWD40-1来bvwd40 - 177。在硅片分析表明,物理化学性质和组成的序列BvWD40蛋白质变化在很大程度上,例如,分子量(MW, 13.79 - -398.63 kDa)和等电点(π,4.25 - -9.67)横跨广泛。序列的长度Bv氨基酸WD40s范围从126年到3599年,平均长度为627.7氨基酸(补充表1)。聪明的表示,BvWD40s包含1到13 WD重复。

保守的领域和主题分析BvWD40s

蛋白质结构分析的结果表明,所有的BvWD40蛋白质包含WD40域,超过35附加功能域(补充表2)。大多数(49)BvWD40s有六个WD40重复,紧随其后的是七WD40重复在43个BvWD40s。36BvWD40s了WD40域糖基的其他领域。除了WD40域,丽斯域的频率是最高的(12BvWD40s)。研究表明,丽斯域影响水稻生长和繁殖(高et al ., 2012),这表明BvWD40蛋白质与丽斯域也可以参与类似的过程。其他各种领域在场但很少,比如ATG16域只有在Bvwd40 - 106和BCAS3域只有在BvWD40-57和Bvwd40 - 64。这两个领域是参与细胞自噬的酵母(熊et al ., 2018;山田和Schaap, 2021)。UTP15域(只在BvWD40-20)的一个组成部分UtpA复杂参与装配小核糖体亚基(Kornprobst et al ., 2016)。然而,拟南芥AtMSI4基因编码一种WD40蛋白质包含六个WD40域和一个CAF1C域,可能参与核小体的组装,但是一些研究已经表明AtMSI4参与调节开花拟南芥(Pazhouhandeh et al ., 2011)。另一个例子,RNAi -AtATG18a植物对盐更敏感和甘露醇和自噬体形成的缺陷拟南芥,这表明AtATG18a可能起着重要的作用在植物自噬和非生物压力。应该指出的是,在ATG18a只包含WD40域(刘et al ., 2009)。

我们预测177年50守恒的图案BvWD40s使用MEME工具(补充图1),其中最高度保守的主题是主题1(173次)、主题2(171次)和主题4(171次)。色氨酸的频率(W)和天冬氨酸(D)是最高的主题1和主题2,谷氨酸(G)的频率和组氨酸(H)最高的主题4,结果还显示,WD40域的氨基酸组成非常不同。有趣的是,一些主题发生得不那么频繁,如主题6(8次)和主题18(61倍),有WDxR主题(补充图2)。DCAFs WDxR图案往往发现,已经被提议作为衬底招聘E3泛素连接酶的蛋白质复杂Cullin4-DDB1 (Mistry et al ., 2020)。此外,先前的研究已经证明的WDxR主题DCAF WD40域在植物蛋白质与DDB1交互的一个关键主题。它也可能参与多种植物发育途径(Zhang et al ., 2008)。

亚科分类和系统发育分析

我们把BvWD40蛋白质分为13个亚科根据域成分和不同领域的角色在生物过程(表1)。亚科是最大的甜菜和108个成员。它只包含WD40域。亚科我是第二个最大的家庭与16个成员包含丽斯和植保领域相关的植物生长和发展。其他亚科也扮演不同角色的功能域,如核糖体合成,泛素化,核小体组装、和囊泡运输,这表明BvWD40s可能主监管机构在不同的流程。的BvWD40蛋白质分为14种不同集群(G1-G14)基于他们的序列同源性,其中G1只有3个成员和最小的集群和G14是最大的集群与21个成员(图1)。在每个集群成员的结构相似度很高,和保守域的组成和顺序是一致的(补充图1)。值得注意的是,集群不一样的亚科,可能由于域的氨基酸组成的巨大差异保持类似的功能。

表1

表1域组成、功能和规模的177年的13个亚科BvWD40s。

图1

图1从甜菜的种系发生树WD40蛋白质。系统发育树构建使用ClustalW trimAl和IQ-Tree软件与最大似然法和1000引导程序复制。分支线用不同的颜色代表不同的组(G1 G14)。

基因结构、染色体位置,重复BvWD40基因

177年的基因结构BvWD40德牧的基因分析软件(补充图3)。外显子的数量BvWD40s变化很大。BvWD40-10有39个外显子,而10BvWD40s只有一个外显子。平均而言,BvWD40s9.8 10.8外显子和内含子。

自13BvWD40s没有完全组装,我们绘制了剩余的164BvWD40s使用位置信息甜菜染色体。的BvWD40s广泛分布在9染色体(图2)。9号染色体有22,最多的BvWD40s6号染色体,染色体3和每一个有15个,最低的数字。

图2

图2的位置BvWD40在甜菜染色体上的基因。据的位置信息BvWD040s,BvWD40s标记在每一个染色体的甜菜。有一个数字标记每个染色体的左边,长度与规模同步,根据颜色基因密度分布(低密度:蓝色,高密度:红色)。

学习的发生WD40基因在甜菜及其不同物种之间的进化关系,我们绘制的共线性映射WD40在甜菜和基因拟南芥(图3)。结果表明,BvWD40基因重复事件较少,只有4对(BvWD40-34/bvwd40 - 141,BvWD40-7/BvWD40-17 bvwd40 - 72/bvwd40 - 90,BvWD40-11/bvwd40 - 156)被发现。相比之下,拟南芥有28个重复事件。然而,58对甜菜和之间存在重复事件拟南芥,超过两个物种。

图3

图3共线性分析WD40在甜菜和基因拟南芥。甜菜和拟南芥染色体是由橙色和紫色表示块,分别。灰色的线表示所有现有基因线性关系,蓝线代表共线性的甜菜WD40基因,红线代表拟南芥有共线性的WD40基因,绿线代表甜菜和拟南芥有共线性WD40基因。

基因本体论分析BvWD40基因

功能性浓缩结果显示(图4 c),大量的BvWD40s丰富的器官组成,植物开发过程、生物过程的监管,催化活性,蛋白质绑定,信号转导,核苷酸绑定和其他基本的生物功能。此外,大量的BvWD40s丰富等对压力的反应刺激反应,热响应和盐反应。

图4

图4相互作用的网络BvWD40蛋白质的分析BvWD40基因。(一)之间的相互作用网络BvWD40s。(B)网络之间的交互BvWD40s和其他蛋白质。在这两种图像,球体的大小和填充颜色代表的节点数量(黄色-深紫色:1 - 100),和线的颜色代表了总比分(浅绿色-浅蓝色:0.4 1)计算字符串的工具。(C)BvWD40基因本体分析,横坐标代表去的地方项目,纵坐标代表的基因丰富,与英国石油(BP)、CC和MF代表生物过程,细胞成分,分别和分子功能。

分析BvWD40蛋白质相互作用网络

我们获得了交互的网络关系Bv使用字符串WD40蛋白质。有丰富的相互作用BvWD40s (图4一)。共有167个蛋白有3337互动关系,和50BvWD40s有50多个相互作用的关系。Bvwd40 - 175可能与其他的60%BvWD40s (100 BvWD40s)。它是根起始的相同器官缺陷蛋白3 (RID3),这是参与顶端分生组织(SAM)再生的负调节CUC-STM通路(玉城丹尼et al ., 2009)。为了获得WD40s和其他蛋白质之间的相互作用网络,我们扩大了字符串网络节点,发现与4418年共有207个蛋白质相互作用。我们进行了MCODE分析网络并发现了一个关键的网络,这是由53个BvWD40蛋白质和6非BvWD40蛋白质,与1160年交互(图4 b)。在网络,Bvwd40 - 175和Cullin4BvWD40 non-WD40蛋白质最交互(分别为117和110节点)。Cullin-4 E3连接酶的支架单元,结合DDB1和DCAF E3连接酶的作用。一些研究表明,拟南芥DCAF蛋白质ABD1负调节脱落酸信号拟南芥(Mistry et al ., 2020)。番茄DCAF CUL4-DDB1 DDI1作为基质受体蛋白质泛素连接酶,积极调节非生物压力茄(耐性苗族et al ., 2014)。这是推测BvWD40s可能相互作用参与植物发展和增长。他们中的大多数可能Cullin-4的基质和可能参与非生物应力响应。

的表达模式BvWD40盐胁迫下的基因

进一步探索的反应BvWD40盐胁迫下的基因,我们绘制的表达谱BvWD40s在培养b .寻常的盐胁迫下(补充图4)。我们的表达模式进行了研究BvWD40s在不同的时间在两个组织在200毫米,300毫米和400毫米氯化钠治疗。在12 h和72 h 300毫米氯化钠治疗下,有大量的BvWD40s改变表达式在根和叶。响应盐胁迫的基因数根达到最大值72 h基因(35),和叶在24小时达到最大值(39)的基因。我们发现6BvWD40s在和五根BvWD40s叶子始终对盐胁迫的12 - 72小时。的叶子BvM14行,有49个BvWD40s对200毫米盐胁迫和32BvWD40s应对盐胁迫200毫米和400毫米。在根部,有92BvWD40s对200毫米盐压力和58BvWD40s改变在不同浓度盐胁迫的反应。在这两种组织,15BvWD40s(38 BvWD40-6, 11日,44岁,62年,66,72,82,83,87,109,126,141,152,162年同时对不同浓度的盐胁迫)。这些结果表明,很多BvWD40s在不同的组织响应盐胁迫的条件。在不同的甜菜,有独特的和共享的胁迫反应BvWD40s在时空的级别。显然,许多BvWD40s在甜菜耐盐可能扮演重要角色,这些独特的吗BvM14和改变叶子和根可能拥有高价值的生物技术的应用程序。

克隆、组织特定的表达和亚细胞定位bvwd40 - 82

根据表达式的分析BvWD40基因,我们发现bvwd40 - 82基因是上调的叶子和根茎BvM14线在200毫米和400毫米氯化钠。我们所知,没有先前的研究在盐宽容的函数bvwd40 - 82据报道。我们克隆了bvwd40 - 82基因的BvM14线(补充图5)。组织表达分析显示的表达水平bvwd40 - 82基因在根叶高出12.3倍(图5一个)。绿色荧光蛋白成像显示,Bvwd40 - 82蛋白是局部核(图5 b)。

图5

图5组织特异性分析bvwd40 - 82基因的亚细胞定位Bvwd40 - 82蛋白。(一)中存在的分析bvwd40 - 82表达水平在不同的组织,使用18 srna基因作为参考,数据均值±SD (n = 3), * *代表了卡方检验p < 0.01的显著差异。(B)亚细胞定位Bvwd40烟草35 s - 82蛋白::eYFP空白控制。

一代的bvwd40 - 82CRISPR突变和超表达转基因拟南芥

功能描述,我们最同源基因的识别bvwd40 - 82在答:芥,AtUTP18(AT5G14050)。由于缺少AtUTP18突变体在公共存储库,我们产生了变异AtUTP18使用CRISPR / Cas9方法(Pawluk et al ., 2016)。测序结果表明utp18突变体只有一个峰值代表一个插入胸腺嘧啶为872 bp的cdAtUTP18基因(只有一个外显子),造成移码突变和终止在879个基点(淘汰赛,KO) (补充图5)。此外,我们还创建了bvwd40 - 82超表达(OE)拟南芥和互补的utp18突变体(有限公司)。pcr和rt - pcr结果显示bvwd40 - 82基因被发现在OE组级别的DNA和RNA水平有限,但不是在WT KO,AtUTP18在KO(中被淘汰补充图5)。结果证明,转基因植物和基因敲除突变体是可靠的,可以用于后续的功能分析。

转基因植物的表型分析,WT和盐胁迫下KO

OE的根源和线长比WT和KO的控制和盐处理条件。这些结果表明,bvwd40 - 82基因可以促进苗期根系生长的植物,同时,增加植物对盐胁迫的耐受通过促进根系生长(图6 a, B)。令人惊讶的是,KO和WT表现出类似的控制和盐胁迫条件下根系生长。这可能是由于潜在的冗余功能AtUTP18同源染色体的拟南芥的根源。

图6

图6表型分析bvwd40 - 82基因拟南芥盐宽容。(A, B)、根长度分析转基因拟南芥幼苗盐之前和之后的治疗。(C, D)。比较的增长状态,转基因的鲜重和干重拟南芥盐之前和之后的治疗。OE代表过度线,公司代表互补,KO代表基因敲除突变体,WT代表野生型植物。

与早期的苗期拟南芥在玫瑰阶段生长参数(鲜重(FW)和干重(DW))的突变线显示显著差异WT和转基因线。KO线枯萎的叶子,和显示与压力相关的紫黑色的颜色(图6 c),而弗兰克-威廉姆斯、WT DW OE和线高于突变线控制和盐胁迫条件下(图6 d)。WT植物相比,弗兰克-威廉姆斯和OE DW公司行更高(图6 d)。这些结果表明,bvwd40 - 82可能会增加盐胁迫下转基因线的生物量。

生理、生化和胁迫的基因表达分析

除了生长表型,这里我们生理和生化变化,以及胁迫响应途径在转基因,WT和植物。没有明显的差异^{2 +}内容和K⁺/ Na⁺内容转基因线之间的比率(图7 a, B)、WT和KO线控制。在盐胁迫下,Ca^{2 +}内容和K⁺/ Na⁺OE线和线的比率明显高于WT和KO线。控制、MDA和甜菜碱含量在WT KO没有显示显著差异(图7 c, D)。在盐胁迫下,MDA含量的OE和线明显低于WT、KO和甜菜碱含量的差异是相反的MDA在不同的植物。控制,转基因的SOD和POD活动线路,WT和KO线没有显著不同。在盐胁迫下,SOD和POD活动OE线和线都明显高于WT和KO植物(图7 e, F)。

图7

图7不同植物的生理生化分析包括OE,有限公司KO和WT。(f)。Ca^{2 +}内容,K⁺/ Na⁺内容比、MDA含量、甜菜碱、SOD和POD酶活性的植物。小写字母表示不同群体之间的显著差异。

测试潜在的胁迫反应途径的影响bvwd40 - 82基因在植物应对盐胁迫,我们选择了salt-overly-sensitive (SOS)通路和ABA通路和测量途径中的关键基因的表达水平。控制,相关基因的表达水平在每一行都是相似的,在盐胁迫下SOS pathway-related基因的表达水平SOS1,SOS2,SOS3(图8)OE线和线明显高于WT和KO线。除了PYL6的表达水平PYL4和PYL5在阿坝pathway-related被盐胁迫诱导的基因,他们显著的高于OE和线比WT和KO (图8 b)。

图8

图8基因表达分析的潜力bvwd40 - 82盐胁迫通路介导的。(一)SOS-related途径表达分析。(B)ABA-related途径表达分析。小写字母表示不同群体之间的显著差异。

讨论

在甜菜WD40蛋白质家族的进化

甜菜是世界上一个重要的糖类作物和盐压力会严重妥协的收益率。因此,特定角色WD40蛋白质在甜菜和WD40蛋白质是否会影响其盐宽容和收益率仍有待调查。在这项研究中,生物信息学工具和公共数据库被用来进行全基因组分析WD40蛋白质家族的甜菜。总共有177BvWD40s得到,数量小于大多数植物WD40蛋白质家族,如大米(欧阳et al ., 2012)、黄瓜和拟南芥(李et al ., 2014)。虽然他们的基因组大小小于甜菜,他们有更多的WD40蛋白质。之前的研究表明,重复事件的主要原因大家庭大小(大炮et al ., 2004)。因此,它可能是逻辑演绎,甜菜基因组复制事件少于这三个物种(补充图6)。进化树的拓扑结构划分的BvWD40蛋白质分为14组。域在同一组的组成相似,表明密切相关BvWD40s可能有冗余或合作功能(冯et al ., 2019)。系统发育树也反映了物理化学性质的差异BvWD40s,类似于其他物种(WD40蛋白质太阳et al ., 2020;陈et al ., 2023)。

探索之间的进化关系WD40的基因,拟南芥WD40基因和甜菜WD40基因被用来构造一个共线性映射。甜菜和拟南芥,只有少量的WD40基因是由重复事件(分别为4双和28对),而大多数WD基因不接受基因重复事件,表明WD40是一个比较古老的基因家族。它还表明,WD40基因存在之前,甜菜和之间的分化拟南芥,有一定的多样性分化后由于一系列重复的事件(杨et al ., 2020)。这个结果与其他研究结果一致(欧阳et al ., 2012;胡锦涛等人。,2018年)。

的BvWD40基因是参与许多生物学过程

进一步研究的可能的功能Bv甜菜WD40蛋白质,其基因本体论(去)注释。去注释和浓缩的结果表明,该功能BvWD40s是多样化的,包括对盐胁迫的反应。土豆的浓缩结果类似于(道et al ., 2019),大麦(陈et al ., 2023),棉花(萨利赫et al ., 2018),和玫瑰(太阳et al ., 2020),说明物种保护。在植物功能开发、泛素化、器官组成,微管乳沟,信号转导,蛋白质绑定,核苷酸绑定,刺激响应,和其他生物功能丰富,指示的功能多样性WD40基因。相比之下,WD40大量的其他物种的基因BvWD40s丰富的热响应、盐反应,以及在棉子糖合成肌醇合成。棉子糖的积累被报道为甜菜的盐耐受性(Naguib et al ., 2021),杨树肌糖转运蛋白基因PtINT1b可以提高转基因植物的盐耐受性(Zhang et al ., 2023)。因此,BvWD40s在盐胁迫耐受可能有独特的作用。其他丰富的功能BvWD40s还显示与盐胁迫相关,如过氧物酶体生物起源,TOR信号转导,MAPK复杂,Katanin复杂,RNA绑定,自噬和泛素化。以前的研究已经表明OsPEX11大米、过氧物酶体生物起源因素,有助于对(水稻耐盐胁迫崔et al ., 2016工厂的压力(期间),TOR信号是必要的哈克et al ., 2022),MAPK可以调解在植物盐胁迫信号转导(吴et al ., 2023)。AtKATANIN1一种微管切割蛋白质编码,调节微管解聚,以应对盐胁迫拟南芥(杨et al ., 2019)。OsRGG1γ亚基基因编码的G蛋白,促进对促进活性氧清除(水稻耐盐求爱者et al ., 2017)。RNA结合蛋白MUG13.4可以与之交互在AGO2, MUG13.4 -在AGO2复杂盐耐受中发挥着重要作用拟南芥(王et al ., 2019)。以前的报告还表明,自噬在植物应对逆境中扮演一个重要的角色,和植物适应环境压力的选择性通过泛素化蛋白降解(徐和雪,2019年;Raffeiner et al ., 2023)。的的结果BvWD40蛋白质是激动人心的,与其他研究一致(太阳et al ., 2020;陈et al ., 2023)。他们不仅显示了潜在的功能多样性BvWD40蛋白质,但也提供了重要的见解理解的角色Bv在甜菜耐盐WD40蛋白质。

亚科分类支持的角色BvWD40s在盐胁迫响应和宽容

它已被广泛认识到蛋白质域是高度相关的功能(利兹et al ., 2016)。因此,研究领域的作品BvWD40蛋白质有可能在预测其功能和生成可测试的假设。在这项研究中,177年BvWD40s被分成13个亚科根据域的组成。指出这是亚C具有典型的泛素化领域如UBOX FBOX和戒指,说明参与泛素化。之前的研究表明,大豆通用汽车PUB21包含UBOX域负调节大豆干旱和盐胁迫耐受性(杨et al ., 2022)。环与环锌指蛋白域作为一个E3连接酶在植物生长中起着重要作用和非生物压力(耐性汉et al ., 2022)。此外,在特别提款权包含FBOX域参与非生物压力拟南芥(李et al ., 2022 a)。十BvWD40s被发现含有甜菜的泛素化领域。我们假设这些BvWD40s可能发挥作用在非生物胁迫宽容通过水解酶的活动。也指出,亚K只有一个成员,标注为纤维素合成基于其域函数。盐胁迫下植物应对盐胁迫造成的损害可能通过调节细胞壁的合成和沉积(Dabravolski Isayenkov, 2023)。此外,亚科的最大数量BvWD40s,先前的报道已经证实WD40蛋白质只包含WD40领域积极响应盐胁迫的植物。例如,芒果MiTTG1编码WD40蛋白质中扮演一个重要的角色在促进发展的根长和根头发,和转基因线具有较强适应能力,盐和干旱压力(谭et al ., 2021)。一个LbTTG1的l二色的可以促进增长的拟南芥毛状体,积极通过盐腺分泌物盐提高植物耐受盐压力(元et al ., 2019)。过度的TaWD40D可能会增加紧急求救信号通路相关基因的表达在转基因植物在盐胁迫下,从而提高小麦的耐盐胁迫(香港et al ., 2015),GbLWD1-like基因银杏叶可以提高转基因杨树的生长,增加salt-stress-related转录因子的表达,从而提高转基因杨树的耐盐(鑫et al ., 2021)。超表达的另一个OsABT基因改良水稻盐胁迫耐受性通过防止过量的活性氧积累,增加细胞内K⁺/ Na⁺减少ABA合成,激活ABA反应基因表达和ABA信号通路(温家宝et al ., 2022)。的WD40protein REBC in quinoa is involved in the formation of epidermal bladder cells, and mutation ofREBC导致盐胁迫敏感性(导演今村昌平et al ., 2020)。与不同的领域不同的亚科成员可能参与多种生物功能。某些域的研究表明,它们也可能与盐胁迫相关,而研究表明,该亚科亚科的成员已经与盐胁迫相关高于其他亚科。这些结果支持BvWD40蛋白质可能发挥关键作用在植物盐胁迫宽容。

bvwd40 - 82增强耐盐转基因拟南芥

BvM14线是一个很好的种质资源中创建的独立专业的实验室。通常生长在高盐浓度下,而栽培甜菜不能。目前,一些优秀的耐盐基因已经被孤立的BvM14行,他们被认为是重要的生物标志物盐甜菜(公差马et al ., 2017;霁et al ., 2019)。但是,没有WD40-related基因已经被特征与盐对甜菜的宽容。首先,表达式的分析BvWD40s盐胁迫下显示,大量的BvWD40s对不同浓度的盐胁迫不同组织的甜菜,和bvwd40 - 82有一个明显的反应。第二,bvwd40 - 82只包含WD40域,属于亚科,指示bvwd40 - 82可能参与了植物耐盐。因此,bvwd40 - 82克隆功能研究利用反向遗传学在吗拟南芥。在盐胁迫下,盐胁迫下MDA可以显著增加,从而破坏细胞膜(刘et al ., 2023 a)。的bvwd40 - 82基因可以促进根的生长bvwd40 - 82转基因植物,减少MDA的积累在盐胁迫下,因此减少了盐胁迫下植物的伤害,同时提高转基因植物的甜菜碱的积累来维持植物细胞的渗透压(Annunziata et al ., 2019)。第三,不同的超表达和互补的bvwd40 - 82促进了Na基因⁺射流和抑制K⁺流出,保持高K⁺/ Na⁺比,增加钙^{2 +}内容,改善植物耐盐(赵et al ., 2021;刘et al ., 2023 b)。第四,bvwd40 - 82积极监管SOD和POD活动在盐胁迫下,从而维持活性氧在植物体内平衡(杨和郭,2018年)。此外,在盐胁迫下,bvwd40 - 82通过调节增强盐耐受SOS信号通路相关基因表达,激活了Na⁺/小时⁺传输通道和K⁺摄入量(徐et al ., 2023),而ABA受体基因的表达增加(PYL4,PYL5)在ABA信号通路(温家宝et al ., 2022)。功能描述bvwd40 - 82清楚地表明,bvwd40 - 82发挥了重要作用在植物应对盐胁迫。它可以提高盐的宽容拟南芥。然而,需要进一步的研究来阐明背后的分子机制bvwd40 - 82在植物耐盐功能。

结论

本研究确定了177BvWD40蛋白质甜菜基因组和描述他们的基因和蛋白质结构、染色体分布,和演化特征。的反应BvWD40s盐胁迫是特征和潜在的耐盐基因bvwd40 - 82是孤立的。的功能bvwd40 - 82基因在盐耐受性研究通过一系列分子、生理生化分析。的bvwd40 - 82基因可以提高转基因植物的盐耐受性增加osmolytes和抗氧化酶活动的内容,维持细胞内离子体内平衡和增加SOS和ABA通路相关基因的表达。本研究揭示了重要的角色BvWD40s在甜菜和盐胁迫的响应提供了一个理论依据提高甜菜耐盐胁迫,以及BvWD40s也可以作为其他作物的遗传育种的重要资源。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

作者的贡献

写作和编辑:ZW和SC。分子实验和协助编辑:TZ和杰。想法和监督概念:霍奇金淋巴瘤。文档检查:搞笑和DZ。概念和修改:SC和霍奇金淋巴瘤。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

资金

这项研究是由美国国家科学基金会的国际合作与交流项目(32261133530)和中国国家科学基金项目(32072122)和俄罗斯科学基金会(23-44-00050)。这项工作是由黑龙江省级重点实验室的植物基因工程和生物发酵工程为寒冷地区。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

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引用

一个,周宏儒。,Lee, C.-J., Lee, G.-E., Choi, Y., Jeung, D., Chen, W., et al. (2022). FBXW7-mediated ERK3 degradation regulates the proliferation of lung cancer cells.Exp。摩尔。地中海。54岁,35-46。doi: 10.1038 / s12276 - 021 - 00721 - 9