卡尔文-本森-巴沙姆循环中的核酮糖-1,5-二磷酸再生:关注允许Rubisco底物形成的最后三个酶促步骤

1介绍

地球上的初级生化生产主要是由一种被称为卡尔文-本森-巴萨姆循环的复杂代谢途径维持的。CBB循环能够固定大气中的二氧化碳(CO₂)，为淀粉和蔗糖的生物合成提供代谢中间体，从而在植物代谢中发挥关键作用(阮,2014；菲斯特和塞曼，2016年)．不论光合生物(如。例如，蓝藻、藻类、苔藓植物和陆生植物)，该途径由相同的11种酶和2种调节蛋白组成，即分子伴侣Rubisco活化酶和内在无序支架CP12 (Michelet et al.， 2013；Bhat等人，2017年；Gerard等人，2022年)．CBB循环的第一步涉及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)。Rubisco催化CO的结合₂转化为5碳糖核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)，生成2分子3-磷酸甘油酸(3PGA)。基于酶的功能特征，这种依赖rubisco的羧化反应被认为是整个循环中的一个限制性步骤(Andralojc等人，2018)．然而，最近的建模研究和实验证据强调，CBB循环的效率也受到Rubisco底物再生的共同限制(即。， RuBP) (Andralojc等人，2018；雷恩斯,2022)．8种酶通过催化交叉反应途径参与循环的RuBP再生阶段。具体来说，5种酶协同作用，将3碳糖和循环产物甘油醛-3-磷酸(G3P)转化为两种5碳糖，即木酮糖-5-磷酸(X5P)和核糖-5-磷酸(R5P)。在这一步之后，再生阶段通过核酮糖-5-磷酸3-外聚酶(RPE)和核酮糖-5-磷酸异构酶(RPI)催化的分离反应形成5-磷酸核酮糖(Ru5P) (图1一个)．最后，最后一步涉及磷酸激酶(PRK)，它催化atp依赖性的Ru5P转化为RuBP (图1一个)．RPI和RPE在参与CBB循环的同时，还参与磷酸戊糖通路(OPPP)的非氧化分支，分别催化Ru5P反转化为R5P和X5P (图1 b)．

本文综述了目前对光合酶RPI、RPE和PRK结构特征的认识，以及它们在CBB循环中生理作用的催化和调节特性。我们的工作主要集中在CBB循环的最后三个酶促步骤上，因为光合作用RPI、RPE和PRK的晶体结构最近已经确定，因此可以更好地理解它们的结构/功能关系及其假定的翻译后调控机制(Gurrieri等人，2019年；勒莫涅等人，2020年；Meloni等人，2022年)．除非另有说明，我们将描述来自绿色微藻模型的蛋白质衣藻reinhardtii，从中已经产生了关于CBB循环的最广泛的分子数据。此外，将讨论与这些酶的生物技术操作有关的未来前景。在全球范围内，这项工作将有助于对碳固定途径进行更全面的概述。我们对目前文献中信息稀缺或分散的单个步骤的强调，旨在将未来的研究引向尚未探索但可能对光合固碳效率产生积极影响的工程策略。

2植物核糖-5-磷酸异构酶的结构和生化特征

2.1植物RPI具有与代谢异构酶共享的保守折叠

核糖-5-磷酸异构酶(RPI;EC 5.3.1.6)是一种普遍存在于所有生物体内的酶，在光合作用模式生物中具有较高的序列保守性(~40-68%的序列相同)(图2一个)．迄今为止，来自非植物生物的RPI酶的结构数据相当广泛，在PDB存储库中有超过50个实验性3d结构可用。例如，已经确定了来自各种不同生物(如细菌)的RPI的晶体结构大肠杆菌(pdb id: 1lkz) (Rangarajan等人，2002年)，即单细胞真核生物酿酒酵母(pdb id: 1xtz) (Graille等人，2005年)，太古菌海床horikoshii(pdb id: 1lk5) (石川等人，2002年)，以及包括原生动物在内的多种人类寄生虫恶性疟原虫(pdb id: 2f8m) (Holmes等人，2006年)和圆齿鲁兹锥体(pdb id: 3m1p) (Stern et al.， 2011)．相比之下，植物RPI异构体的结构数据有限，仅从模型绿藻中得到RPI的晶体结构衣藻reinhardtii(CrRPI, PDB ID: 6ZXT)已通过实验确定(勒莫涅等人，2020年)．

光合rpi属于常见的a型，在细菌、古生菌和真核生物中也有发现，而结构上不同的B型只在寄生原生动物和一些细菌中发现。属于A型的RPIs通常以同型二聚体存在，其中每个单体折叠成两个不同的α/β结构域(图2 b)．催化结构域位于蛋白的n端，属于SCOPe结构家族c.124.1.4, CATH分类3.40.50.1360。该结构域由6股β-薄片和4个α-螺旋组成，通过短β-薄片与羧基端盖结构域相连(图2 b)．盖结构域由一个四股反平行β-片和两个α-螺旋组成，有助于形成同二聚体结构，这一点已得到验证在体外重组CrRPI (勒莫涅等人，2020年)．

通过与RPI结构的比对，确定了RPI活性位点的正确位置嗜肺性军团菌(LpRPI, PDB ID: 6MC0)与R5P和Ru5P共晶。详细地，三个保守的配体结合基序被鉴定出来:磷酸盐结合的p基序，糖结合的s基序和催化的c基序(图2一个)．CrRPI与LpRPI:R5P配合物的结构比对允许在配体结合基基中鉴定13个假定的催化残基，这些残基侧链距离底物4 Å (图2 c)．特别是Lys37和Lys155(成熟的叶绿体CrRPI编号，图2一个)为底物磷酸基的结合提供正电荷，并且在来自植物和非植物来源的其他RPI异构体中完全保守(图2一个)．通过对RPI晶体结构的分析，得到了与催化相关的结构特征的相关见解栖热菌属酸奶HB8 (PDB ID: 1UJ5)与R5P (Hamada等人，2003年)．在这项研究中，作者揭示了底物异构化是立体定向的，并通过一个独联体-烯-二酸中间体，其中带负电荷的O1被一个氧阴离子孔稳定，这个氧阴离子孔由保守的Gly100-Leu105基序中的主干酰胺氮组成(CrRPI中的Gly129-Leu134) (Hamada等人，2003年)．此外，CrRPI中保守的Glu108 (Glu137)，图2一个)被提议将一个质子从底物C2穿梭到C1，依次充当一般的碱和酸。总的来说，这些结构特征不是RPIs所独有的，而是催化异构化反应的酶所共有的，如三磷酸异构酶(TPI)和磷酸葡萄糖异构酶(PGI) (高档的,1957；罗斯和奥康奈尔，1960年；Hamada等人，2003年)．

2.2 RPI的生化特性表明，反应的方向取决于底物的浓度

在光合生物中，RPI异构体存在于细胞质和叶绿体(质体)中，并参与OPPP和CBB循环(图1)．在CBB循环中，RPI通过催化R5P可逆转化为Ru5P (RuBP再生的中间体)发挥着重要作用，还参与核黄素和鸟苷5’-三磷酸的形成(Volk和Bacher, 1991)．RPI参与OPPP时，催化相反的反应(即。，即Ru5P转化为R5P)，从而提供R5P，随后用于氨基酸的合成(即。、组氨酸和色氨酸)，以及嘌呤和嘧啶核苷酸(如。、烟酰胺二核苷酸(NAD) (Hove-Jensen 1988)．尽管RPI在植物代谢中起着至关重要的作用，但目前对植物RPI的催化机制、动力学参数和可能的调控机制(如。变构调控和翻译后修饰(PTM))。到目前为止，只有从豌豆和菠菜的叶绿体RPIs被鉴定出来。生化研究表明，豌豆RPI能够通过较宽的pH范围催化其反应，其活性峰值在7.8左右，这一值与光照条件下的基质pH值相对应。此外，豌豆RPI亚型对这两种底物都表现出类似的亲和力K_{毫克ydF4y2Ba}R5P和Ru5P分别为0.9和0.6 mM (skrukord等人，1991年)．然而，另一项研究报告称，这一数字高出约2.4倍K_{毫克ydF4y2Ba}R5P (K_米,R5P= 2.2 mM;（安德森,1971）).据报道，菠菜亚型已被证明与豌豆同源体相似，显示出类似的R5P亲和力K_{毫克ydF4y2Ba}0.63或0.46毫米(Rutner 1970；Jung等人，2000年)．

如前所述，Ru5P到R5P的相互转化反应是通过与其他异构酶共享的催化机制发生的(即。、TPI和PGI)。该反应由单一的酸碱机制组成，包括在底物的碳1和碳2之间进行质子转移通过形成独联体-烯-二醇(酸)中间体(高档的,1957；罗斯和奥康奈尔，1960年)．构型分析和突变研究强调了两个高度保守的残基，位于催化基序中，在这一过程中发挥了关键作用(石川等人，2002年；Hamada等人，2003年)．具体来说，一种保守的谷氨酸(Glu108和Glu137)t .酸奶分别为RPI和CrRPI，图2一个)被认为是通过催化碱/酸的作用来介导O1和O2之间的质子转移。残基Lys99 (CrRPI中的Lys128)似乎通过盐桥使谷氨酸侧链定向从而促进了这一过程，从而促进了其反应性。

根据RPI的代谢功能，我们可以肯定植物RPI在戊糖磷酸盐的分配中起着至关重要的作用。因此，确定控制这种反应方向的因素是至关重要的。在这方面，平衡常数(K_情商)，随后发现RPI的反应接近平衡(skrukord等人，1991年；Zhang et al.， 2003)．这表明，无论RPI参与的代谢过程如何，异构化反应的方向基本上是由底物的浓度驱动的。因此，RPI是作为一种合成代谢酶还是分解代谢酶，取决于特定的代谢环境和/或代谢途径中其他酶的活性调节。

3植物核糖-5-磷酸表素酶的结构和生化特性

3.1植物RPE是一种具有保守TIM-barrel折叠的金属酶

核酮糖-5-磷酸3-外素酶(RPE, EC 5.1.3.1)广泛分布于所有生物体内，在光合模式生物中具有高度的序列保守性(64-90%同源性)(图3一)．由于其在碳相关途径中的关键作用，RPE一直是广泛的结构分析的主题，包括晶体结构的确定智人酶(PDB ID: 3OVR) (梁等，2011)， RPE异构体来自尖端复合体恶性疟原虫(pdb id: 1tqx) (Caruthers et al.， 2006)，以及来自致病菌淋病奈瑟氏菌(pdb id: 5umf)。来自光合生物的RPE晶体结构包括集胞藻属(SynRPE, PDB ID: 1TQJ) (Wise等人，2004年)，栽培稻(OsRPE, PDB id: 1H1Y和1H1Z) (杰拉科维奇等人，2003年)，茄属植物tuberosum(StRPE, PDB ID: 1RPX) (科普等人，1999年),衣藻reinhardtii(CrRPE, PDB ID: 7B1W)Meloni等人，2022年)也已确定。光合副基团的唯一代表是StRPE和CrRPE。当考虑所有来自植物来源的可用结构时，我们观察到叶绿体RPE组装为由三聚体和二聚体组成的均六聚体结构。相比之下，细胞质OsRPE具有二聚体折叠，正如在人RPE中观察到的那样，这被证明是通过可能的单体-二聚体交换来变构的(Karmali等人，1983年)．

然而，无论来自哪种生物，RPE都是单一折叠的(α/β)₈磷酸三糖异构酶家族的-桶结构域(TIM桶，SCOPe c.1.2.2, CATH分类3.20.20.70)(图3 b)，通常被认为是一种金属酶。两对保守的His和Asp残基(CrRPE中的His72、Asp74、His105和Asp216，图3一)有助于金属离子在活性部位的稳定(Akana等人，2006年） (图3 c)．纯化的RPE大肠杆菌被证明是有效的在体外当与各种过渡金属，如锰结合时^{2 +}、有限公司^{2 +}、铁^{2 +}，或Zn^{2 +}，后者的催化常数明显较低(Sobota和Imlay, 2011)．人RPE与铁共晶^{2 +}，而RPE来自酿脓链球菌，栽培稻,衣藻reinhardtii与Zn共晶^{2 +}．金属离子被认为是催化所必需的，它结合在β-桶的顶部，周围环绕着8个残基的侧链，这些残基构成了底物结合袋(梁等，2011） (图3 c)．结构证据支持所提出的理论，即X5P/Ru5P的催化相互转化是通过涉及质子提取和捐赠的酸碱机制进行的cis-ene -上述用于RPI的二酸中间体(科普等人，1999年)．在脱质子-质子化机制中，两个保守的Asp残基(CrRPE中的Asp74和Asp216)在3号碳上作为一般碱使Xu5P/Ru5P脱质子，同时也作为一般酸使Xu5P/Ru5P质子化cis-ene-二酸中间体(杰拉科维奇等人，2003年)．高能中间体的稳定涉及金属离子和三个保守的Met残基(CrRPE中的Met76、Met107和Met178)，图3 a - c)．当金属离子与碳2和碳3羟基氧相互作用时，蛋氨酸残基连接到带负电荷的碳2氧阴离子(C2-O)^{- - - - - -})．蛋氨酸依赖的稳定是由三个残基的结构几何和定位所保证的，它们在全球范围内充当无质子硫垫，防止异构化，从而有利于外二聚化。

3.2植物RPE的生化分析显示其动力学性质存在较大差异

如RPI所述，RPE也是一种角闪酶，通过催化X5P到Ru5P的可逆互转化，同时参与OPPP和CBB循环(即。在OPPP和CBB循环中分别发生了从Ru5P到X5P和从X5P到Ru5P的二聚体化)。因此，RPE在光合生物叶绿体中共存的这两种基本代谢途径之间的戊糖磷酸分配中起着关键作用(Schnarrenberger等人，1995年)．

功能必需残基的进化守恒(图3一)，其中大部分都存在于活性部位，这表明来自不同来源的RPE具有特定的结构元素，使其遵循相同的反应机制(如。，保守的天冬氨酸残基和蛋氨酸残基分别参与了底物到产物的转化和反应中间体的稳定，(杰拉科维奇等人，2003年)．迄今为止，对来自植物和非植物来源的RPE进行的生化研究主要集中在oppp相关反应(Ru5P转化为X5P)上，突出了底物亲和力和催化熟练度方面的高度可变性。至于植物亚型，不同的周转率(k_猫)对菠菜酶进行了估计，结果发现其酶活性为105-7100 SEC⁻¹为重组形式和0.138秒⁻¹对于从叶片叶绿体中提取的酶，分别为(Chen et al.， 1998；Teige等人，1998年；Meloni等人，2022年)．同样，菠菜RPE对底物Ru5P的亲和力变化很大，具有K_{毫克ydF4y2Ba}数值分别为0.22、0.25及1.56毫米(Chen et al.， 1998；Teige等人，1998年；Meloni等人，2022年)．最近从重组CrRPE中获得的数据显示k_猫等于273秒⁻¹和一个K_{毫克ydF4y2Ba}Ru5P值为1.52 mM (Meloni等人，2022年)．这些催化性能差异的原因是不确定的，可能取决于植物酶作用的特定生理环境的内在差异，或者在样品制备和/或通过偶联酶测定活性测量过程中的方法差异。

X5P转化为Ru5P (CBB循环相关活性)的研究仅在一项分析重组CrRPE催化性能的研究中进行过(Meloni等人，2022年)．该数据可与Ru5P转化为X5P的酶促转化进行动力学比较(即。(oppp相关反应)，同时揭示影响其在光合作用背景下代谢作用的酶的生化特征。值得注意的是，藻类RPE的周转数为80.7秒⁻¹，与Ru5P转化为X5P相比，该值低约3倍，X5P相对于Ru5P的亲和力高约2倍(K_米,X5P0.72毫米)。所得的催化效率(k_猫/K_{毫克ydF4y2Ba})的大小比较相似，均为1.13 x10⁵米⁻¹证券交易委员会⁻¹1.79 x 10⁵米⁻¹证券交易委员会⁻¹(X5P或Ru5P的异构化)，这表明这两个反应是同样有利的，反应的方向取决于各自底物的浓度。

植物磷酸激酶的结构和生化特征

4.1植物PRKs的结构分析显示有一个核苷水解酶折叠，与催化相关的结构元素保守

PRK酶只在光合生物中发现(即。、蓝藻、藻类和陆生植物)和产甲烷古生菌，并分别参与CBB循环和磷酸己糖还原途径(科诺等人，2017年)．在这些生物中，PRK异构体的主要序列是可变的保守的，范围从23%到75%，在绿色谱系中同源性约为70% (图4一)．最早报道的PRK晶体结构来源于紫色光合细菌Rhodobacter sphaeroides(pdb id: 1a7j) (Harrison等人，1998年)，而最近的3d结构已经报道了拱廊产甲烷球菌属hungatei(pdb id: 5b3f)，拟南芥(PDB id: 6H7H和6KEX)，衣藻reinhardtii(PDB ID: 6H7G)和蓝藻聚球藻属elongatusPCC 7942 (PDB id: 6HZK, 6H7L和6KEV) (科诺等人，2017年；Gurrieri等人，2019年；威尔逊等人，2019年；Yu等，2020年)．

PRK属于单磷酸核苷(NMP)激酶超家族的亚群，其特征是ATP结合域(即。， P-loop) (图4一)，可分为3种类型:古菌型(古生菌)、细菌型(α-蓝藻和变形菌门)和植物型(绝大多数蓝藻和植物真核生物)(Tabita 1999；斯坦利等人，2013；威尔逊等人，2019年)．在结构层面，我们根据PRK类型识别了不同的寡聚物状态。值得注意的是，植物型PRKs来自美国elongatus，答:芥而且c . reinhardtii的原型m . hungatei显示二聚体折叠，而细菌型PRK来自α-变形菌门r . sphaeroides是八聚体(Harrison等人，1998年；科诺等人，2017年；Gurrieri等人，2019年；麦克法兰等人，2019年；Yu等，2020年)．在寡聚物内，在蛋白质进化过程中(从细菌型到植物型，再经过古菌型)，单体之间的界面面积减小，这可能影响结构灵活性(Gurrieri等人，2019年)．

PRK褶皱属于SCOPe族c.37.1.6，与Rossman褶皱的CATH分类3.40.50.300有关。在植物类型上，PRK折叠为一个显著的延伸的10股混合β-薄片，两侧是一个2股反平行β-薄片。9个α-螺旋连接在主β-薄片的两侧(图4 b)．每个亚基的最后β链通过多次接触聚合形成单体界面(Gurrieri等人，2019年)．通过对PRK酶的三维结构分析，得到了PRK酶活性位点的精确位置答:芥PRK与反应产物ADP和Ru5P底物的类似物，即葡萄糖-6-磷酸(G6P)共结晶(Yu等，2020年)．该分析允许识别活性位点内与辅因子和底物相互作用的蛋白质残基(图4 c)．此外，还鉴定出含有一个Asp和一个His残基的保守催化二元体(AtPRK中的Asp58和His106分别对应于CrPRK中的Asp57和His105)。图4 a - c)，它们的相互作用使酸性残渣发生脱质子反应。这种质子交换允许Asp57 (CrPRK编号)作为催化碱基，从而激活磷酸基从ATP到Ru5P的转移(详情见下文)。另一个保守的结构元素是p环(图4 a - c)．如前所述，蛋白质的这一区域是ATP结合的基础，使ATP的γ-磷酸靠近糖底物的碳1，即。， Ru5P (Yu等，2020年)．然而，正如观察到的其他蛋白激酶，适当的ATP结合只有在核苷三磷酸与镁离子络合的情况下才能保证，然而，在任何报道的结构中都不可见。其他二价阳离子(如。、锰^{2 +}和Ca^{2 +})可替代Mg^{2 +}，虽然催化效果欠佳(赫维茨等人，1956年；马斯登和科德，1984年)，表明活性的改变可能是离子水平变化的结果在活的有机体内．

4.2植物PRK的生化特征表明其对底物和ATP具有相似的亲和力

在CBB循环中，PRK催化atp依赖性的Ru5P碳1磷酸化生成RuBP、ADP和无机磷酸盐。在催化机制中，活性位点Asp57与组氨酸相互作用，使其脱质子化，作为催化碱，激活Ru5P的碳1。这种活性炭反过来开始对ATP的γ-磷酸化基进行亲核攻击，从而导致Ru5P磷酸化为RuBP (Harrison等人，1998年；Yu等，2020年)．为了确保高效催化，底物按顺序结合。首先，ATP进入活性位点，诱导构象重排，允许Ru5P结合(Lebreton和Gontero, 1999；Yu等，2020年)．这种构象变化还可以防止ATP在富含磷酸戊糖(Ru5P除外)的基质环境中发生不必要的水解(Schlauderer等人，1996年；西格尔等人，1998年；Li et al.， 2004)．

底物和辅因子的亲和性范围相似。的K_{毫克ydF4y2Ba}为植物PRK的Ru5P (即。据报道，与蓝细菌、藻类和陆生植物异构体)的亲和度在50 ~ 270 μM之间^{2 +}-ATP的范围同样为34 ~ 280 μM (赫维茨等人，1956年；安德森,1973；苏瑞克等人，1985年；罗斯勒和奥格伦，1990年；Wadano等人，1995年；哈里哈兰等人，1998年；Kobayashi等人，2003年；Michels et al.， 2005；Thieulin-Pardo等人，2015)．同样，不同植物类型PRKs的特异性活性在218 ~ 588 μ mol min之间具有可比性⁻¹毫克⁻¹，值显著高于那些发现的原始和许多细菌PRK类型(1.68-111 μ mol min⁻¹毫克⁻¹） (Tabita 1988；科诺等人，2017年)．这些差异可能与PRK的结构多样性有关(见前文)，并可能是在发现PRK的不同生物体中通过碳固定途径代谢通量的可变性的基础。

5 RPI、RPE、PRK的调控机制

5.1 RPI、RPE、PRK催化的硫醇开关调控

众所周知，蛋白质硫醇在信号通路中起着核心作用，因为它们已知耦合细胞内氧化还原状态的变化与生化反应。为了响应氧化还原信号，蛋白半胱氨酸硫醇可以进行不同类型的氧化还原修饰，如二硫键形成(−SS−)，氧化(即。，亚砜化−SOH，亚砜化−SO₂H，磺酰化−SO_3.H)、s -谷胱甘肽化(−SSG)和s -亚硝基化(−SNO)。基于大量的蛋白质组学研究，数百种叶绿体蛋白已被确定为半胱氨酸依赖性氧化还原修饰的假定靶点(Zaffagnini等人，2019)及其中的参考资料)。有趣的是，已经观察到所有CBB循环酶都可能由硫氧还蛋白介导的二硫键还原、s -谷胱甘肽化和s -亚硝基化调节(Zaffagnini等人，2019)及其中的参考资料)。四种CBB循环酶通过二硫醇/二硫化物交换的trx依赖性调控已被证实(Michelet et al.， 2013)，活动调制的实验演示通过其余CBB循环酶的氧化还原修饰还远未完成。

在下一节中，我们将集中注意力在当前的知识的氧化还原基调控机制的三种CBB酶讨论整个审查:RPI, RPE，和PRK。

虽然RPI已被确定为氧化修饰的靶点，但目前还没有研究可能的氧化还原调控的生化研究。然而，CrRPI的晶体结构使我们能够获得半胱氨酸硫醇的分子线索，这可能有助于指导未来的生化研究(图5一个)．特别地，Cys149和Cys250位于适合形成分子内二硫键的距离(图5一个)，尽管它们的埋藏位置需要局部构象变化才能与硫氧还蛋白等氧化还原调控因子相互作用。同时，Cys175的硫原子暴露在溶剂中最多(图5一个)，从而促进与氧化分子的反应(如。，过氧化氢和亚硝基谷胱甘肽)，从而使其最有可能成为氧化还原修饰的靶点(勒莫涅等人，2020年)．然而，这一调控的生化证据仍然不足。

类似于CrRPI, RPE的3d结构c . reinhardtii并提出了对氧化还原调控敏感的半胱氨酸硫醇的建议。CrRPE含有四种半胱氨酸，但结构证据尚未显示硫醇基团易于形成二硫键(图5 b)．一致地，在硫氧还蛋白与氧化或还原二硫苏糖醇联合处理后，没有观察到活性的调节(Meloni等人，2022年） (图5 e)．在CrRPE半胱氨酸中，只有Cys37被观察到可被溶剂接近(图5 b)，因此可能成为监管角色的候选人。然而，氧化剂(即。，亚硝基谷胱甘肽，氧化谷胱甘肽，过氧化氢)，已被证明在调节酶活性方面诱导可忽略不计的影响(Meloni等人，2022年） (图5 e)．迄今为止，SoRPE被证明是唯一对氧化还原处理有反应的异构体，但还原剂巯基乙醇诱导的抑制作用的机制尚未阐明(Chen et al.， 1998)．

植物型PRK是CBB循环中受硫氧还蛋白调控的四种酶之一(Michelet et al.， 2013；Gurrieri等人，2021年)．PRK的氧化还原调控主要发生在暗/光循环中，通过两对保守半胱氨酸对的二硫醇/二硫交换反应进行。调控半胱氨酸残基位于蛋白的n端和c端部分(CrPRK中的Cys16-Cys55和Cys243-Cys249) (图5 c)．在光照条件下，还原的TRXs催化Cys16-Cys55二硫化物还原，缓解了影响适当ATP结合的结构约束，从而触发PRK催化活化(Marri等人，2009年；Gurrieri等人，2019年；威尔逊等人，2019年） (图5 f)．TRXs还负责PRK在夜间的失活(图5 f)．由于RuBP仅被CBB循环利用，而不是其他代谢途径所需要的，这种失活确保了防止代谢物积累。PRK的二硫键调节与超分子复合物的形成同时进行，涉及调节蛋白CP12和另一种CBB循环酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Pohlmeyer等人，1996年；韦德尔和索尔，1998年)．在复合体中，PRK几乎完全失活(Graciet等人，2004年；Marri等人，2008年)，由于在所有GAPDH-CP12-PRK配合物结构中均观察到PRK的c端Cys243-Cys249二硫化物(麦克法兰等人，2019年；Yu等，2020年)，假定它对复杂装配很重要。除了硫氧还蛋白依赖的调控外，PRK也被认为是其他氧化还原修饰的假定靶点。一项生化研究强调，酶的活性是可以调节的在体外通过几种氧化还原剂，如谷胱甘肽，亚硝基谷胱甘肽和过氧化氢(Marri等，2014)，但这些化合物介导的有效氧化还原调控仍有待证实在活的有机体内．

综上所述，我们可以肯定，虽然RPE被证明对氧化还原调控机制无反应，但RPI的氧化还原调控仍不确定。相反，PRK活性被不同类型的氧化还原修饰所调节，证实它是一种有效的氧化还原靶点，与基于氧化还原的蛋白质组学一致。应该考虑的是，氧化还原翻译后修饰实际上可能与酶活性的调节无关，而是可能通过促进与其他蛋白质的相互作用或诱导目前未知的“兼职”功能来影响蛋白质功能(Zaffagnini等人，2014)．进一步的研究对于深入了解氧化还原信号在调节蛋白质功能中的作用以及破译这些调节机制对碳固定和相关代谢通量的生理影响至关重要。

5.2 RPI、RPE和PRK的代谢物和辅因子依赖性调控(通过代谢依赖机制调控RPI、RPE和PRK活性)

在检查生理背景时，值得考虑的是代谢物在调节酶的协同活动中可能具有的作用。为此，我们检索了处理某些分子影响的生化研究(如。，糖，有机酸和核苷酸)对CBB循环酶活性的影响。我们发现关于RPI的数据很丰富，但关于RPE和PRK的数据很少。特别是，豌豆RPI已被证明以竞争性方式被单磷酸腺苷(AMP)和各种代谢物如红-4-磷酸(E4P)、sedoheptulose-1,7-二磷酸(SBP)、甘油醛-3-磷酸(G3P)和3-磷酸甘油酸(3PGA)灭活(图5 d)．这些分子的抑制作用已被观察到，其浓度接近光合作用叶绿体中的浓度，具有恒定的抑制作用(K_我)，范围由0.1毫米至1毫米(安德森,1971；skrukord等人，1991年)．与这些数据相一致的是，菠菜RPI对E4P和3PGA有类似的抑制反应(伍德拉夫和沃尔芬登，1979年)．相反，RuBP已被观察到对酶活性有积极影响(安德森,1971；skrukord等人，1991年） (图5 d)．在RPE的情况下，只有α-磷酸甘油酸和Ru5P分别对酶活性具有稳定作用和不稳定作用(Chen et al.， 1998） (图5 e)．关于PRK，很少有研究关注可能的代谢物诱导抑制，但现有数据显示，蓝藻的PRK与陆生植物的PRK反应不同。藻类中PRK的数据还没有。在蓝藻中，AMP和ADP在浓度为0.32 ~ 1 mM时可抑制PRK (马斯登和科德，1984年；Wadano等人，1995年)，而在陆地植物的PRK中没有观察到同样的反应，豌豆的PRK活性似乎对AMP和ADP都不敏感(安德森,1973)．此外，PRK从集胞藻属pcc6803对异柠檬酸酯(西口等人，2020年)，而该化合物对植物型PRK的影响尚不清楚。从陆地植物和蓝藻中发现的唯一影响PRK活性的代谢物是6-磷酸葡萄糖酸盐(安德森,1973；Wadano等人，1995年)．该分子是OPPP的中间体，它对PRK催化的影响可能是协调OPPP和CBB循环之间的代谢通量所必需的。最后，已经观察到3-磷酸甘油酸诱导抑制小麦和豌豆的PRK (安德森,1973；苏瑞克等人，1985年)，但其作用仍存在疑问，因为在高于生理范围(6 mM)的浓度下观察到蛋白质失活。

除了翻译后氧化还原修饰和代谢依赖的调节外，蛋白质活性也可能由其他机制调节，如丝氨酸/酪氨酸磷酸化。值得注意的是，据估计真核细胞中30%的蛋白质受到这种PTM (王等，2014)．在模型中的绿藻衣藻reinhardtii，磷蛋白组学研究确定了包括RPI、RPE和PRK在内的一千多种蛋白质作为推测的靶点。对于CrRPI和CrRPE，结构分析表明磷酸化可以阻止底物进入活性位点，这可能是这两种酶抑制调控的一种方式(勒莫涅等人，2020年；Meloni等人，2022年)．到目前为止，PRK还没有已知磷酸化位点的结构细节。尽管这三种酶都是磷酸化作用的靶标，但对于控制其磷酸化状态的分子机制和生理条件仍然缺乏了解。

6结论与展望

6.1结束语

基于之前发表的研究和数据库中的可用数据，本工作总结了目前关于三种CBB循环酶的结构和功能特征的知识，这些酶参与CBB循环的最后步骤，允许Rubisco底物的形成。即。, RuBP。关于植物RPI、RPE和PRK的催化和结构特性的详细数据仅适用于极少数物种。这种分散的信息并不能让我们完全理解三种CBB循环酶相对于它们特定的生理环境。

6.2未来研究展望

6.2.1 CBB循环与代谢的整合

必须严格控制分解代谢OPPP和CBB循环之间的相互作用，以限制RPI和RPE催化的步骤中R5P和X5P与Ru5P的无效循环。而衣藻reinhardtii如果至少拥有两个编码RPI和RPE的基因，那么将代谢功能归因于每种酶亚型或酶的翻译后修饰状态将是有意义的。我们和CBB循环和糖酵解醛缩酶的合作者已经探索了与代谢功能匹配的para alog (Le Moigne等人，2022年)．另外，代谢产物朝向CBB循环或OPPP的方向可能只是由它们在叶绿体中的浓度控制。

6.2.2通过合理的酶工程提高光合固碳

尽管到目前为止已经揭示了功能特性，但我们提出的关键问题是，是否有必要和可能合理地改进这些功能，以使单个酶更有效，从而增强CBB循环的代谢通量。特别是，与分解代谢直系物或考虑到细胞内的生理代谢产物浓度相比，对底物和/或辅因子的催化能力和亲和力似乎不是最优的。为此，关键残基的定点诱变，例如，允许正调控底物结合，从而通过降低这些相互作用的米凯利斯-门腾常数来提高催化效率。对这些酶及其催化特性的进一步研究将使未来有可能改善天然特性，并设计出更高效、更多产的生物体。

6.2.3将建模扩展到其他工厂

实验结构、功能和调控仅对绿微藻进行了描述衣藻reinhardtii回顾之日的RPI, RPE和PRK。在未来，扩展我们对这些酶的自然多样性的认识，更好地理解来自不同植物物种(包括替代模式植物、作物和宏基因组序列)的CBB循环酶的结构/功能之间的关系将是至关重要的。维拉尔等人，2018)．必须将这三种CBB循环蛋白的催化和结构多样性与主要序列一起分析，以确定潜在的催化开关以及保守和非保守氨基酸的具体功能作用。在这方面，实验证据和建模研究为如何进一步增强RuBP再生提供了新的预测(Andralojc等人，2018；Simkin等人，2019年；雷恩斯,2022)．

6.2.4 CBB循环的系统和合成生物学

测试这些输出将需要一个多学科的方法，包括生化和结构研究，再加上相关亚细胞区室代谢特征的定量分析。此外，新方法的应用，以确定遗传因素和生化机制参与调控CBB循环酶的表达和活性，将受益于基因编辑技术的应用，以修改通路的每个反应步骤。值得注意的是，有可能使用合成生物学来引入改进的酶，在现有的循环中运作，或者取代整个通路的分支。这些新技术的出现为研究人员提供了一个有吸引力的工具箱，利用它来设计RuBP再生的全部潜力，从而有助于提高光合性能和作物产量。这项工作中检测的酶是否可以改进，这种功能的改进是否会对光合作用和初级生产产生影响，仍然是一个悬而未决但肯定有趣的问题，有待测试。

作者的贡献

所有作者都参与了稿件的撰写和修改，并批准了最终稿件。

资金

作者感谢《前沿》杂志提供的出版成本折雷竞技rebat扣(DSC-12035334721PRD)。本工作由ANR CALVINTERACT项目-ANR-19- ce11 -0009资助

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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参考文献