原始研究的文章

前面。植物科学。,13January 2023
秒。植物遗传学、表观遗传学和染色体生物学
卷13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1097534

全基因组关联和RNA-seq分析识别位点pod取向在油菜籽(芸苔属植物显著)

个杨 ^1、2

Wenxiang王 ^1、3

琼胡 ^1、3

的拉曼 ⁴

刘贾 ^{1、3 *}

¹中国农业科学院油料作物研究所,武汉,湖北,中国
²深圳研究生院、中国农业科学院、深圳、广东,中国
³重点实验室的生物学和遗传改良油料作物,农业和农村事务部,武汉,中国
⁴新南威尔士(NSW)主要产业部门,沃加沃加农业研究所,沃加沃加、新南威尔士、澳大利亚

空间分布和取向的豆荚在主总状花序(stem)和分支可能影响油菜籽产量。然而,基因组区域的豆荚取向没有描述芸苔属植物物种。这里,我们决定遗传变异程度的豆荚取向,称为花梗的角度总状花序(APR)和角豆荚的花梗(应用程序)在136年油菜籽到达生长在三个环境上,在中国长江中下游。4月的范围从59°- 109°,而应用不同的从142°- 178°。统计分析表明,表型变异是由于基因型(G)和环境(E)的影响。使用全基因组关联分析(GWAS)方法,两个法4月(qBnAPR。A02和qBnAPR.C02)和两个应用程序(qBnAPP。A05 qBnAPP。C05), having minor to moderate allelic effects (4.30% to 19.47%) were identified. RNA-seq analysis revealed 606 differentially expressed genes (DEGs) in two rapeseed accessions representing the extreme phenotypes for pod orientation and different alleles at the QTLs of APR. Three DEGs (BnLAZY4.A02,BnSAUR32.A02,BnSAUR32.C02)被确定为最可能的候选人负责pod取向的变化(4月)。本研究阐述建构主义假定的候选基因和基因组区域底层舱取向显著。

1。介绍

油菜籽(芸苔属植物显著l .)食用植物油的第三大来源,主要供人类消费的增长在世界各地,特别是在澳大利亚、加拿大、中国、印度、法国和德国。此外,用于生物燃料和stock-feed生产(李et al ., 2020)。由于空前增长的世界人口,提高油菜籽产量必须满足能源需求。油菜籽一般熊豆荚(长角果)外消旋体的顶部(主杆)和侧分支(道格拉斯和里格斯,2005年)。开花后,油菜叶衰老,脱落,主要依赖于绿豆荚进行光合作用。超过一半的干物质提供了种子填充由豆荚阀门/果皮(愣et al ., 1992)。因此,pod取向起着至关重要的作用在光能吸收,这是需要光合作用和增强生产力。基于pod在总状花序的方向角(pod),油菜籽可以分为四种类型:直、斜、扁平、下垂(吴et al ., 2007)。直舱取向由油菜育种者所期望的,因为它们不是容易“阴影综合症”。然而,这种豆荚架构是罕见的在油菜种质资源(Sinhamahapatra et al ., 2010)。大多数芸苔属植物往往倾向于培养的豆荚,促进植物类型更紧凑和疾病累积,尤其是菌核病茎腐烂,由真菌引起的菌核病sclerotiorum。

植物结构显著影响光合效率和作物收获指数。植物器官的生长响应重力决定植物形态学是一个重要的因素。大多数植物器官,尤其是在成熟的植物,显示在某个角垂直增长轴不平行于重力向量(Lorenzi Perbal, 1990)。研究表明,植物器官的取向是由敌对的交互控制的普遍机制之间的引力和auxin-dependent运输(Roychoudhry et al ., 2013)。

虽然植物响应重力尚未完全了解,几个关键基因网络的重力反应被确定在作物全基因组关联研究(GWAS)图谱克隆和突变研究。例如,在大米、AGPL1,LPA1,ONAC106,PROG1,矮人3,TAC1调控分蘖角度通过重力传送信号,表明多基因遗传(盛田昭夫et al ., 2006;冈et al ., 2013;吴et al ., 2013;Sakuraba et al ., 2015(李et al ., 2007;谭et al ., 2008;唱et al ., 2014)。此外,中间的基因LAZY1也通过改变生长素调控分蘖、叶角分布(李et al ., 2007)。基因如BRXL4,HSFA2D和OsPIN2可以调节的表达吗LAZY1基因(徐et al ., 2005;陈et al ., 2012;Zhang et al ., 2018;李et al ., 2019),的突变SL基因可以抑制的表型lazy1通过抑制生长素生物合成(徐et al ., 2005;陈et al ., 2012;唱et al ., 2014;Zhang et al ., 2018;李et al ., 2019)。在拟南芥,LAZY1和TAC1基因调节分支角度,类似于大米(德圣日尔曼et al ., 2013;韦特和Dardick, 2018)。在玉米、TAC1可能会导致增加分支角(Ku et al ., 2011)。基因位点控制分支角度研究了油菜(王et al ., 2016)。然而,大多数的研究集中在作物的分支角(苏et al ., 2020;王et al ., 2020;杨et al ., 2020),而很少有研究解决生殖结构的取向的角色负责经济收益,如豆荚,耳朵,颖片(李et al ., 2012)。除了分支角度,pod取向相关的基因也被孤立和确定模型中的植物拟南芥、烟草、番茄和黄瓜(爱好et al ., 2000;李et al ., 2001;Venglat et al ., 2002;Ha et al ., 2007;汗et al ., 2012;王et al ., 2015;林et al ., 2016;太阳et al ., 2019)。KNAT1基因的缺失突变产生向下的豆荚(Venglat et al ., 2002)。之间的夹角的pod和总状花序生长素信号突变axr6急性(爱好et al ., 2000)。一般来说,野生型之间的夹角pod和总状花序大约是60°的过度ROP2基因的拟南芥G蛋白质可能达到90°以上(李et al ., 2001)。相比之下,抑制突变体都小于60°(李et al ., 2001)。肌动蛋白丝聚束的豆荚角蛋白基因VILLIN2和VILLIN3双突变体vln2vln3成为小(van der珩磨et al ., 2012)。横向器官边界基因BOP1和BOP2蛋白质调节角度通过仓的小黑裙(Ha et al ., 2007)。花梗的夹角/水果和spa突变成为小的总状花序(张、杨,2012年)。也有很多研究拟南芥的生长方向花梗长。拟南芥短花梗突变KNAT1 /销毁英国石油公司基因显示减少花梗长度和下行花(道格拉斯et al ., 2002;Venglat et al ., 2002)。KNAT1 /英国石油公司负调节KNAT2, KNAT6 ATH1确保花梗向上有一个正常的方向(情景不禁啜泣et al ., 2008;李et al ., 2012)。在烟草、发现NtSVP SlAGO7番茄和黄瓜CsUp控制花梗和水果取向(王et al ., 2015;林et al ., 2016;太阳et al ., 2019)。

GWAS RNA-seq相结合是一种有效的方法来识别关键基因控制植物特征(白et al ., 2022)。全基因组关联是在这项研究中,采用一组不同的油菜种质资源,和相关的区域pod取向确定基于连锁不平衡(LD)。有利的SNP等位基因和pod取向之间的联系被Mann-Whitney U评估测试来识别SNP标记的油菜育种的分子标记辅助选择项目。我们进一步进行RNA-seq pod花梗分析两个油菜籽行明显不同pod取向和优先考虑的潜在候选基因QTL pod取向。最后,生物信息学分析发现蛋白质结构和序列变异候选基因的人群中。总的来说,这项研究旨在提供一个圆荚体的遗传基础取向在油菜籽理想株型的植物架构,优化提高光合作用效率和产量,可以开发。

2。材料和方法

2.1。植物材料

一百三十六油菜籽到达被种植在遵义城市的三个地方,贵州省(28°N, 107°E),阳逻的城市,湖北省(30°N, 114°E)和Lu -西安城市,安徽省(32°N, 116°E) (补充图1)。这三个地方(环境)上表示,中下游地区油菜栽培在中国长江流域。实验是在随机进行完整块在每个环境有两个复制。每个加入播种与54个人情节包含三行,行之间的间隔在33厘米和11厘米之间的植物在每一行,种植密度270000株/公顷。所有的实验都是根据当地管理现场管理和耕作实践

2.2。表现型

两个定量指标与油菜籽pod取向测量:花梗的角度在总状花序(APR)和pod在花梗的角度(应用程序)在136年油菜籽到达生长在三个环境。我们数字化测量的pod-related角度GWAS面板在三个独立的环境中。我们。成熟度(BBCH规模90),加入5每个油菜籽植物选择从每个环境调查和测量4月使用描述的图像处理方法和应用王et al。(2015)。pod和总状花序被切断从每个工厂和放置在一个20×20厘米黑板图像分析。数码相机(DSLR-A350,索尼公司、日本),固定在三脚架上,被用来拍照的样品从顶部,与35毫米的焦距。数字图像输出到电脑下载画路径和测量角度与AutoCAD包(https://www.autodesk.com.cn/)。

2.3。基因分型和人口结构

一组选定的136油菜籽到达使用60 k Illumina公司英飞纳姆芸苔属植物基因分型^@SNP数组(Illumina公司)如前所述刘et al ., 2016)。在质量控制(小等位基因频率> 0.05和缺失数据< 20%)(刘和缪斯,2005年),共21426个snp被选为后续GWAS分析。使用CMplot包(SNP密度地图了阴et al ., 2021在R3.3.3) (团队RC, 2013覆盖整个)来衡量标志显著基因组。主成分分析是使用流苏v5.0执行软件(布拉德伯里et al ., 2007)。只有前两个主成分被ggplot2绘制包(韦翰,2011在R3.3.3) (团队RC, 2013)。MEGA-X软件(Kumar et al ., 2018)被用来绘制系统发育树和显示之间的遗传关系GWAS登记入册。主成分分析和系统发育树都是用来揭示人口分布结构。LD(连锁不平衡)衰减估计证明遗传连锁的程度,它是由PopLDdecay软件(max衰变遥远= 2500,打破= 6000个基点,bin1 = 1000, bin2 = 6000)如前所述(Zhang et al ., 2019)。

2.4。统计和全基因组关联分析

一般线性模型(GLM)是使用基因型构造的,环境,和表型数据。进行了方差分析,确定基因型效应,环境效应和基因型×环境交互效应存在。试件进行混合线性模型(传销)Tassel5.0软件(布拉德伯里et al ., 2007)被用来分析表型和基因型之间的关系在三个环境(遵义,阳逻和Lu -西安)。亲属关系(K矩阵)被添加到模型中来消除误报造成的遗传关系。在这项研究中,p值表示一个SNP是否与相应的特征,和r²显示了表型变异解释为标志。重要的网站通过GWAS的标准P< 0.0001。曼哈顿和QQ情节吸引使用qqman包(特纳,2014在R3.3.3) (团队RC, 2013)。

2.5。基因功能注释

候选人地区所有基因注释在NR (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/)和Swiss-port数据库(https://www.expasy.org/resources/uniprotkb-swiss-prot)使用爆炸软件(Korf et al ., 2003)。同源基因的功能在TAIR a .芥筛查,检查网站(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)。

2.6。等位基因的影响评估

积极影响较小的APR的QTL等位基因和应用程序被称为“有利等位基因”。相比之下,等位基因导致更大的角度被称为“不利的等位基因”。我们选择在每个候选人地区最重要的SNP,选择有利等位基因为APR和应用。因为相对应的表型标记基因型不符合正态分布,我们使用非参数测试,Mann-Whitney U测试,分析差异。箱形图被吸引ggplot2软件包(韦翰,2011在R3.3.3)。

2.7。RNA-seq

成熟的豆荚的花梗油菜籽登记入册:9319行(4月:斜油菜籽,59°,APP是170°)和行ZS11(平油菜籽的4月,90°,应用170°)收集RNA序列(图1)。登记入册都是种植在受控环境下一式三份的房间保持在25°C光明与黑暗政权(16/8小时)到样本集合。核糖核酸库建立了使用内^®Illumina公司超™RNA图书馆准备工具包(美国内)遵循制造商的建议。图书馆是测序Illumina公司HiSeq 4000平台,导致paired-end读取150个基点。的质量控制RNA-seq读取由fastqc (2010年安德鲁斯)软件和总结MultiQC (Ewels et al ., 2016)。对RNA降解,记录完整性指数(锡)检查使用RSeQC下面描述的方法王et al。(2012)。质量控制和过滤后,转录组测序读起来比较的参考基因组组装ZS11(20200127版)使用分层索引拼接对齐成绩单(HISAT)版本2.1.0的(金正日et al ., 2015)。StringTie软件v1.3.6 (Pertea et al ., 2015)是用来组装新的记录。RSEM v1.2.31被用来量化基因表达水平。突变检测的准确度和灵敏度使用GATK最佳实践(奥康纳和Van Auwera, 2020年)类似于那些使用SAMtools mpileup (李et al ., 2009)。考虑突变检测的速度和便利SAMtools mpileup,突变检测样品通过SAMtools mpileup基于HISAT2和基因组之间的比较数据,结果是存储在VCF格式。

图1

图1示意图的油菜籽荚荚取向的取向显示两个指标;4月,花梗角总状花序;和应用,角豆荚的花梗。

2.8。识别基因家族

我们下载候选人蛋白质序列参与不同物种的豆荚方向从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),建立了一个本地蛋白质数据库。七个基因IGT的家庭拟南芥被爆炸与本地蛋白质数据库(你们et al ., 2006)。Mafft软件(Katoh et al ., 2002)被用来对齐IGT家族基因,最后,进化树构建使用FastTree软件(价格et al ., 2009)。阿富汗二月基因家族隐马尔可夫模型(PF02519)包含了网站(http://pfam.xfam.org/),所以我们用Hmmer (芬恩et al ., 2011)软件确定阿富汗二月基因家族,也用Mafft软件使阿富汗二月基因家族,然后使用FastTree软件构建系统发育树。NWK格式文件从树构建用于R画拔起由TreeAndLeaf系谱树(卡多佐et al ., 2022)包。不同物种进化树叶,被描绘成不同颜色和大小的遗传关系油菜籽作为进化的叶子。亲缘关系的距离是指NCBI的分类法常见的树(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

2.9。蛋白质结构预测

Alphafold2 (跳投et al ., 2021)软件可以预测蛋白质结构预测的准确率为90%。alphafold2蛋白质结构预测软件,最好的rank_0模型预测分数被选rank_0 4模型的预测结果画出蛋白质结构。ChimeraX软件(佩特森工作室内由手工制作完成et al ., 2021)被用来画蛋白质结构,计算b因子值和映射到蛋白质结构。

2.10。核苷酸多样性

的πSNP多样性的价值计算从289年油菜籽核心到达收集全球(宣et al ., 2020)。下一代测序的原始数据从NCBI下载网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA/SRP15312)。参考基因组的序列比较ZS11 (陈et al ., 2021)Sentieon软件(释放et al ., 2017),GVCF文件是用于检测变化在289登记入册。GATK软件被用来识别GVCF变体文件SNP和InDel VCF文件(奥康纳和Van Auwera, 2020年)。根据种群中每个参数的分布,GATK软件被用来控制变异的数据质量文件,并使用的滤波器参数QD SNP文件< 2.0;FS > 50;MQ < 20;MQ等级总和> -12.5;读Pos等级总和> -8.0。Vcftools软件(Danecek et al ., 2011)是用来计算的多样性。100 bp的滑动窗口和一个25个基点的步骤大小是用来计算核苷酸多样性。利用R语言,基因的核苷酸多样性及其上游和下游2 kb地区被黄土安装方法,跨度为0.3。

3所示。结果

3.1。表型变异为APR和应用

确定自然变异的程度pod取向,4月和应用(图1),136年油菜籽到达在三个不同的环境中生长在这个领域。统计分析表明,4月的变化是由于基因型(E) (G)和环境影响,但没有G×E交互存在。然而,G的影响,E和G×E是重要的应用程序(表1)。广义遗传(H²)计算,范围从49.65%(4月)76.65%(应用程序)。应用程序的频率分布和4月连续变异(图2),这表明pod相角特性遗传定量。

表1

表1汇总统计的表型变异pod取向角的测量椎弓根外消旋体(APR)和角豆荚的花梗(应用程序)在136年油菜籽到达生长在三个环境:ZY:遵义;陆YL:阳逻,LA:国安。

图2

图2皮尔逊相关性和频率分布圆荚体取向特征(角的椎弓根外消旋体:4月和角豆荚的花梗:应用程序)在136年加入油菜籽种植在三个环境(ZY:遵义,YL:阳逻,LA:陆-西安)。左下角的一部分是环境之间的散点图;红线显示了变量的简单线性回归。的对角线角落里的是频率分布图环境。右上角是环境之间的关系。* *:P < 0.01,表明高度显著相关;* * *:P < 0.001表示极显著相关。

遗传变异对pod取向136登记入册的油菜籽提出(图S3)。4月变化从66°- 109°、59.32°到99.38°,和59°- 91°的平均值86.20±7.80°,83.20±6.72°,ZY 76.94±8.27°,分别YL和LA环境。大多数登记入册(80%)4月从73°- 89°。澳大利亚品种Rivette F459,有一个小4月角(4月< 70°),而Cibrabra和OG3186大4月角(4月> 90°)。Rivette澳大利亚不同,最低4月(59.32°),而欧洲各种Nilla,最大4月(109°)。应用不同的从142.59°到178.75°环境(表1)。80%种质到达应用不同从153°- 167°。R11小油菜籽登记入册:BLN3342和应用角度(应用< 150°),而OG3190和P10有大量应用角度(应用程序> 170°)。

我们排名油菜籽加入基于对油菜育种的角度确定登记入册。在这项研究中,我们定义了pod取向为APR和程序的总和小于200°直类型;大于200°和小于250°倾斜类型;超过250°,小于300°度持平类型,而大于300°下垂类型(图2)。我们根据他们的角为离散的类别分类pod取向:直接型的4月~ 0°~ 180°的应用;倾斜的类型有4月~ 45°~ 180°的应用;4月的平面型~ 90°,~ 180°的应用;下垂型APR和应用的~ 180°和180°,分别大多数到达inclined-type豆荚类型豆荚(虽然没有直接和低垂补充图4)。

皮尔森相关分析之间的相角特性(APR和应用程序)在不同的环境中表现出显著的正相关性(r= 0.27至0.59,图2)。这些结果表明,至少部分的遗传控制相角的变化特征是由于环境(遵义,阳逻和Lu -西安)。没有在三个环境(APR和应用程序之间的关系r= -0.06 - 0.05),这表明不同的遗传因素可能控制措施pod取向的变化。

3.2。全基因组关联分析

发现pod的遗传基础定位、表型之间的关系的意义和21426全基因组单核苷酸多态性标记(刘et al ., 2016)是评估使用线性混合(Q + K)模型。有8878多态的单核苷酸多态性(41.44%)12548年sub-genome和C sub-genome(58.56%),覆盖238.13 Mb和405.53 Mb sub-genomes,分别在136年油菜籽登记入册(补充表1)。单核苷酸多态性是均匀分布在整个sub-genome和C sub-genomes (图3一)。的平均LD衰变sub-genome是小于阈值以下的sub-genome cR²= 0.5,LD衰变的整个人口约为147 kb,和阈值以下R²= 0.2,大约2.1 Mb (补充表2,图3 b)。

图3

图3(一)高密度136油菜籽到达物理图谱,揭示了芸苔属植物60 k Illumina公司英^@SNP数组。不同的颜色表示中包含的snp 1 mb的基因组区域。红色表示单核苷酸多态性丰富的区域,蓝色区域显示低密度SNP地区和SNP标记的灰色区域表示缺乏;(B)LD衰变的芸苔属植物基因组的136自然群体使用60 k Illumina公司英飞纳姆^@SNP数组。红色的虚线显示,r²是0.2。轴:物理距离所示Kb。

曼哈顿和Quantile-Quantile (qq)情节显示显著的遗传关联应用和跨环境(4月图4)。使用log10 (P)≥4作为阈值LOD,我们确定了四个QTL,指定为qBnAPR。A02 qBnAPP。A05 qBnAPR。二氧化碳,qBnAPP。C05染色体A02, A05、二氧化碳和C05 (表2,表S3)。有趣的是,qBnAPR。A02 qBnAPR。二氧化碳是位于染色体组上的同源区域2 (A02 /二氧化碳),而qBnAPR。A05 qBnAPP。C05映射到A05 / C05染色体同源区域(补充图5)。SNP标记占4.50%(4月)到16.78% (APP)的表型方差(表2)。除了四个重要的QTL,两个小QTL(一个用于APR A08和一个应用程序A06染色体上)也发现原始数据(没有显示)。然而,这些QTL LOD分数较低的阈值(LOD > 3,但< LOD 4)。两个错误的QTL(一个用于APR A03染色体和一个应用程序A10染色体上)被排除在外,因为只有在这些位点SNP是重要的。

图4

图4曼哈顿和quantile-quantile (QQ)情节显示单核苷酸多态性和两舱取向特征之间的关联136年油菜籽登记入册。GWAS由混合线性模型在流苏v5.0(传销)。(一)曼哈顿情节的花梗角总状花序(APR)在三个环境;(B)4月在三个环境qq情节;(C)曼哈顿情节的角豆荚花梗(应用);(D)应用qq阴谋。水平红线代表了全基因组重要阈值(p= 1.0×10⁴)为了清楚起见,只有snp−日志₁₀假定值> = 4所示。单核苷酸多态性是根据他们的物理位置上绘制ZS11参考基因组。

表2

表2pod定位QTL(椎弓根外消旋体:角4月和角豆荚的花梗:应用程序)中确定一个面板136登记入册B。

我们观察到相对应的表型不同的基因型并没有显示出正态分布。因此,Mann-Whitney U测试(补充表4)应用于确定表型(不同措施的豆荚取向)对应标记等位基因。Bn-A02-p9706613 AA SNP等位基因的4月相比减少了GA和GG。也观察到类似的结果与AA Bn-scaff_17725_1-p505212等位基因,显示明显的分化从大型舱到达角与GA或GG等位基因。AA等位基因在Bn-scaff_17441_3-p165957 Bn-scaff_17441_1-p1146459还显示一个协会和减少应用GA相比,GG等位基因(图5)。

图5

图5箱线图显示两个峰值SNP标记的等位基因之间的联系和pod取向。(一)角豆荚的总状花序(APR)和相应的SNP等位基因;(B)角豆荚的花梗(应用程序)和相应的等位基因。所有统计协会都标有*(在P和* * (< 0.05)P< 0.01)。

3.3。候选基因与pod取向有关

我们选择两个登记入册,极端表型:9319行(4月:斜油菜籽,59°,APP是170°)和行ZS11(平面油菜籽、4月90°,应用170°)(图6)。度分析在两线与极端表型RNA-seq方法(补充表5)。通过RNA seq分析,1.28亿读取被生成。每个库的数据范围从5.8 Gb 8.2 Gb, Q30基地打电话~ 95%。85%的读取是映射到参考ZS11基因组。

图6

图6RNA-seq油菜籽行分析与对比pod取向表型。(一)表型差异的豆荚取向9319线(角之间的椎弓根外消旋体(倾向类型、59°角豆荚的花梗170°)和ZS11线(角总状花序的花梗,平面型,90°;角豆荚花梗:170°);(B)统计汇总(度)在9319年和ZS11之间的差异表达基因。绿色虚线圆圈表明QTL的度;(C)丰富KEGG候选人度9319至ZS11通路;(D)热图度候选基因的表达,表达水平改变了日志₁₀(x + 1), 0代表基因不表达,2代表,表达水平高。

19452度被确定在9319年和ZS11登记入册,其中包括12205和7247年下调基因差异基因(图6 b, C)。,606度,底层舱定位的QTL区域。在606个候选基因,235度衰减,和371年上调(图6 b)。底层qBnAPR我们检测到292度。A02和314度的qBnAPR。二氧化碳(补充表6)。

KEGG浓缩的66个基因分析表明,不同的候选基因309通路(补充表7)和浓缩13通路,包括K00279 (图6 d)。其中,细胞分裂素脱氢酶和xylloglucan: xylloglucosyl转移酶TCH4通路有关植物生长和发展。细胞分裂素脱氢酶可以促进芽的分化和生长(Zhang et al ., 2008)。Xyloglucan: xyloglucosyl转移酶TH4扮演着一个重要的角色在交联的形成和重建Xyloglucan和参与植物细胞壁修改过程(2004年1月et al .,)。注释显示7生长素相关基因在606个候选基因:BnaC02G0079400ZS,BnaC02G0175200ZS,BnaC02G0118700ZS,BnaC02G0102400ZS,BnaC02G0050100ZS,BnaC02G0166500ZS,BnaA02G0138300ZS。

我们专注于三个有趣的度下QTL pod取向:前两个是同源基因与生长素的合成有关。BnaA02G0138300ZS BnaC02G0175200ZS,指定为BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02,分别。第三基因BnaA02G0200300ZS,根角增长有关拟南芥(杨et al ., 2020)。BnaA02G0200300ZS被指定为BnLAZY4.A02。BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02基因是同系物地图在接近1604 kb和654 kb的上游4月的SNP峰值特征(表3)。的BnSAUR32.A02的同系物SAUR32(AT5G53590)编码SAUR-like auxin-responsive蛋白质拟南芥。BnSAUR32.C02和AT5G53590同源性较差,是吗SAUR32-like基因。

表3

表3候选基因的豆荚方向优先结合GWAS和RNA-seq结果。

3.4。系统发育和候选基因的核苷酸多样性分析

的BnLAZY4.A02基因属于IGT基因家族,与167年IGT家族基因在13个物种。调查的关系BnLAZY4.A02表示在花梗的第9319行而不是行ZS11的花梗,与其他物种,我们进行了聚类分析使用neighbour-joining方法(图7)。BnLAZY4.A02聚集在同一分支白菜、卷心菜、符合的遗传谱系是哪一个芸苔属植物物种。有三个螺旋结构BnLAZY4.A02蛋白质高的b因子值,调节上游和下游基因(图7 b)。

图7

图7三个关键候选基因的生物信息学分析(一)IGT的种系发生树基因家族在13个物种,包括拟南芥,落花生hypogaea,芸苔属植物oleracea,芸苔属植物显著,芸苔属植物拉伯,Cucumis巨大,大豆,Gossypium,栽培稻,杨树,茄属植物tuberosum,小麦和玉米。不同的颜色代表不同的物种,圆圈代表的大小与油菜的遗传关系,圆越大,越接近油菜籽。红色的三角形标志LAZY4。(B)的预测BnLAZY4.A02使用Alphafold2蛋白质结构。蓝颜色的蛋白质,b因子越低,和红颜色的蛋白质、b因子越高。(C)的核苷酸多样性分布BnLAZY4.A02289年核心种质收集;(D)蛋白质结构预测的地图BnSAUR32.A02基因。蓝颜色的蛋白质、b因子越低,和红颜色的蛋白质、b因子越高;(E)蛋白质结构预测的地图BnSAUR32.C02基因;(F)核苷酸多样性的分布BnSAUR32.A02289年基因核心种质收集;(G)核苷酸多样性的分布BnSAUR32.C02289年基因核心种质的集合。

获得洞察核苷酸多样性候选基因参与豆荚里的取向,我们利用公共基因组序列数据289年油菜籽核心集合(宣et al ., 2020)。结果表明,该核苷酸多样性峰值出现的下游BnLAZY4.A02基因(图7 c),它可以调节这个基因的表达,因此,负责pod取向在油菜的遗传变异。需要进一步的研究来证实这提出的假设。BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02属于阿富汗二月基因家族的基因。我们确定了1857个阿富汗二月家族基因通过基因家族分析13个物种,包括拟南芥,落花生hypogaea,芸苔属植物oleracea,芸苔属植物显著,芸苔属植物拉伯,Cucumis巨大成功,大豆,Gossypium,栽培稻,受欢迎的,茄属植物tuberosum,小麦和玉米(补充图6)。的蛋白质结构BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02基因是非常相似的(图7 d, E)。蛋白质的活跃区域集中在中心的蛋白质。289年的核心集合油菜籽登记入册,核苷酸BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02基因几乎没有变化,其π值很低,0.0001(核苷酸多样性的关键值是0.005)。(图7 f, G)。然而,有相当大的核苷酸多样性(π值:0.0087,π> 0.005),上游地区的BnSAUR32.A02,这可能会影响基因的表达。

4所示。讨论

作物体系结构是一个重要的生理和农艺性状,可以推动油菜籽产量。分支角决定了工厂的整体形状,而pod角有利于光合作用速率。理想的植物结构可以充分利用资源,比如光、水分和养分,实现最高产量和最好的质量。近年来,作物体系结构已经成为一个至关重要的育种目标的遗传改良计划。调查pod取向通过GWAS扩展研究在两个方面。首先,本研究开采自然变异pod取向特征在多元化GWAS小组到达,而不是两个家长,大多数双亲QTL定位研究中使用。其次,我们确定了四个QTL和候选基因与pod取向有关。

4.1。遗传变异在油菜籽pod取向

早期的研究调查了遗传变异对pod取向使用定性评分:直、斜、平面和下垂(吴et al ., 2007)。然而,这些评估是主观和基因组分析不准确。在这项研究中,我们采用的是更精确的技术,采用图像处理评估遗传变异在豆荚取向(应用程序和4月)。这种方法避免了在现场条件下手工角度测量中的错误。此外,我们使用量化分数分类pod取向。我们只发现到达公寓和倾向类型在我们的GWAS面板。进一步的研究需要屏幕直接类型的国家和国际不同到达所期望的油菜籽改进项目。中度相关性在某些环境中表明pod取向特征可以选择在油菜育种和适合选择初代。

4.2。四个QTL pod取向

有统计上显著的G×E应用交互。4月在环境。因此,我们采用multi-environment-based传销模式,从而排除genotype-phenotype协会的环境的影响,而不是方法紧随其后的是(拉曼et al ., 2022)。我们确定了四个重要的QTL区域占一小部分的变异(17%至4.5)。这些结果表明pod的变化方向是多基因和环境的影响。在这项研究中,我们没有确定QTL与QTL×环境交互。

识别有利等位基因对pod架构,我们寻求一个SNP标记等位基因之间的联系(图5)和表型。豆荚的平面类型占据相当大的空间,更容易着色,限制光合面积和不适合高密度培养。而直接或倾斜式吊舱可以最大限度地提高光能量的功能,空间利用率和更有优势。基于上述假设,我们定义了等位基因,促进pod取向直接或倾斜的有利等位基因。AA基因型标志是短舱角峰值的有利等位基因单核苷酸多态性的四个重要的位点。qAPR。一个02 delimited with Bn-A02-p9706613 marker and qAPP.A05 delimited with Bn-scaff_17441_3-p165957 marker cumulatively contributed 21.28% variation in pod orientation. GG alleles detected with SNPs markers (Bn-A02-p9706613 and Bn-scaff_17725_1-p505212) are in the smallest inclined type materials. Two SNPs, Bn-scaff_17441_3-p165957 and Bn-scaff_17441_3-p68051, are AA genotypes, and not all four loci are favourable alleles of pod orientation. On this basis, the germplasms of inclined type with GG alleles of qBnAPP.A05 and qBnAPP.C05 might be improved to AA alleles obtain straight type.

4.3。候选基因的油菜籽pod取向

我们采用两种方法来确定候选基因潜在的QTL pod取向。首先,我们检查了基因组地区LD(上游和下游424 Kb C subgenome subgenome和2.5 mb)。其次,我们确定度潜在QTL区域。我们还在拟南芥的在分支和花序角候选基因的作用已被证实。

我们优先考虑三个候选基因:BnLAZY4.A02,BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02、底层舱定位QTL (表2)。BnLAZY4.A02表示9319年pod花梗而不是ZS11的pod花梗。的BnLAZY4.A02基因属于糖耐量受损家庭中扮演重要角色的一些植物物种的重力信号(韦特和Dardick, 2021)。懒惰的同系物可以调节拍摄分支角度拟南芥树、大米、玉米和一些多年生作物(Roychoudhry Kepinski说道,2015年)。在拟南芥,最近的研究表明,增加LAZY4表达pifq突变体部分能够拯救暗增长的打断下胚轴重力表型不但是不能保存内胚层造粉体的发展(杨et al ., 2020)。在增长拟南芥造粉体在小柱细胞重力沉没,两极分化的方式和懒惰的蛋白质调控生长素运输后感觉这种变化。生长素的极性运输导致反重力增长(Furutani et al ., 2020)。因此,LAZY4调节pod角的机制可能是相同的。在最近的一项研究茉莉酸的侧根取向的影响拟南芥的转录激活LAZY4茉莉acid-related介导的基因MYC2也表明,LAZY4基因与植物生长角度(Sharma et al ., 2022)。

遗传变异在pod A02 QTL定位和二氧化碳(表2)可能会受制于小RNA表达生长素上调基因(阿富汗二月)同系化合物:BnSAUR32.A02和BnSAUR32.C02。年代本身参与调节的动态和自适应增长吗拟南芥和向日葵(Atamian et al ., 2016;Bemer et al ., 2017;Stortenbeker Bemer, 2019)。生长素和其他上游因素也可以调节的表达阿富汗二月基因(Favero et al ., 2017;范Mourik et al ., 2017;胡锦涛等人。,2018年)。阿富汗二月可以与PP2C交互。D磷酸酶(Spartz et al ., 2014)诱导植物生长调节细胞壁酸化。阿富汗二月也可以独立行动的生长素。周等人发现了98阿富汗二月在苹果的基因家族,筛选25法调节根系生长角度。七个阿富汗二月被选为候选基因调控根系生长角度通过蛋白质相互作用网络周et al ., 2022)。高粱、叶角的一个强有力的候选基因SAUR36被RNA-seq识别,和它的表达式可能会增加叶角(Natukunda et al ., 2022)。值得注意的是,启动子区域的变化BnSAUR32.A02也可以调节遗传变异在pod A02底层QTL定位和二氧化碳染色体。

总之,我们决定遗传变异在豆荚取向多样化的油菜籽登记入册。利用,我们确定了四个重要的QTL pod A02取向,A05,二氧化碳,C05染色体在多样化的油菜籽登记入册。此外,我们执行RNA-seq分析和优先考虑三个候选基因:斜平舱和局部之间的差异表达与应用程序相关的QTL和4月因此,GWAS和转录组研究划定三个假定的候选基因潜在pod取向显著。总的来说,这项研究的结果提供了遗传工具和资源了解变异的分子基础油菜籽的豆荚取向。这些发现可能促进油菜籽理想株型的开发和培养。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://ngdc.cncb.ac.cn/?lang=en,CRA007893。

作者的贡献

杰设计和监督。WW和JL收集样品。本书提供了种质。YY执行基因和转录组数据分析。YY,人力资源和JL讨论结果和准备手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作得到了中国自然科学基金会(U19A2029),中央公益科研机构基础研究基金(161017202203和161017202203)和开放项目(KF2020007)重点实验室的生物学和遗传改良油料作物,农业和农村事务部,p . r .中国。我们感谢科技创新项目的中国农业科学院计算和实验支持。我们还要感谢谷物研究和发展公司支持开展合作研究在新南威尔士州DPI和OCRI,武汉下DAN00208项目。

的利益冲突

处理编辑CL宣布与作者YY,分享信仰WW,心不在焉,杰的审查。

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

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引用

安德鲁斯,美国(2010年)。FastQC:高通量序列数据的质量控制工具(Babraham学院,剑桥,英国:Babraham生物信息学)。

谷歌学术搜索

Atamian, h·S。,Creux: M。、棕色、大肠。,Garner, A. G., Blackman, B. K., Harmer, S. L. (2016). Circadian regulation of sunflower heliotropism, floral orientation, and pollinator visits.科学353年,587 - 590。doi: 10.1126 / science.aaf9793