越来越严重的脊髓损伤导致小胶质细胞/巨噬细胞与Annular-Shaped形态和没有变化表达CD40和肿瘤生长具有抑制受损阶段延伸Factor-β在慢性
埃尔韦拉Ruslanovna Akhmetzyanova
1 *,
安娜Viktorovna Timofeeva1,
Davran Khudaishukurovich为
1,
亚历山大·亚历山大Kostennikov
1,
亚历山大·亚历山大Rogozhin
1、2,
维多利亚詹姆斯
3,美国美国Arkhipova1,
艾伯特Anatolevich Rizvanov
1和
雅娜Olegovna Mukhamedshina
1、4
- 1精度和再生医学临床研究中心,基础医学和生物学研究所,喀山联邦大学,喀山,俄罗斯
- 2神经病学、喀山州医学Academy-Branch校园父亲联邦国家预算教育机构的专业教育,俄罗斯医学科学院持续专业教育,喀山,俄罗斯
- 3生物医学科学,医学和健康科学学院,兽医学院和科学,诺丁汉大学Biodiscovery研究所,大学公园,英国诺丁汉
- 4组织学、细胞学和胚胎,喀山州医科大学,喀山,俄罗斯
定量测定成分和形态不同的分群的居民小胶质细胞和巨噬细胞浸润在脊髓损伤(SCI)的不同程度的严重性可能导致急需的小说在创伤的治疗干预。在这方面,我们调查了CD40和TGF-β表达小胶质细胞/巨噬细胞的数量和形态国家不同程度的SCI大鼠模型。我们是第一个描述annular-shaped小胶质细胞/巨噬细胞,形态的形成是由于空间定位的过程,形成圆形或椭圆形micro-territories,其中包括瓦解髓鞘纤维。这种类型的细胞形态只有在被发现受伤的脊髓白质,主要。同时,评估annular-shaped小胶质细胞/巨噬细胞的数量和直径micro-territories由他们的流程在这些指标显示海拔SCI的严重程度增加。虽然我们没有发现显著的定量Iba1种群的变化+/ CD40+和Iba1+/ TGF-β+小胶质细胞/巨噬细胞与严重程度增加慢性SCI的时期(60 dpi),我们决定改变细胞因子的表达和信使rna的基因编码小胶质标记蛋白质,发现SCI后最大的改变在7和14天实验组之间不同程度。
介绍
在过去的几十年中开展的多项研究都不可否认演示的重要性小胶质细胞在中枢神经系统(CNS)损伤的发病机制(Kawabori Yenari, 2015;Devanney et al ., 2020)。小胶质细胞的一个关键特性是他们能够改变他们的表型和形态在微环境的影响下,这一过程称为极化(胡锦涛等人。,2015年)。这个过程决定了范围广泛的小胶质细胞的反应,包括吞噬活动的变化和分泌各种细胞因子(周et al ., 2014;Akhmetzyanova et al ., 2018;Bellver-Landete et al ., 2019)。
小胶质细胞极化,描述了基于神经毒性(M1),和神经保护(M2)表型的细胞是有区别的,它有一个特定的微环境。小胶质细胞的激活和收购M1表型,据推测神经炎症损伤被触发,由生产的促炎细胞因子如interleukin-1β(IL-1β),肿瘤坏死factor-α(TNF-α),过氧化物,一氧化氮,活性氧(ROS) (块et al ., 2007;邱et al ., 2020)。它曾被描述的另一种变体小胶质细胞激活导致极化对M2表型,对抗炎性反应和有积极影响对创伤的结果通过分泌il - 4, IL-13, il - 10,肿瘤生长factorβ(TGF-β)(Butovsky et al ., 2005;周et al ., 2012;2013年余地et al .,只有集中精力)。然而,近年来的研究进展给我们理由修改上面的术语(凯蒂,2016)。转录组分析显示大量的多样性表达谱的小胶质细胞和巨噬细胞浸润,不整合与M1和M2表型依照极化连续模型(雪et al ., 2014;韦斯et al ., 2016)。由于这些数据和最近的研究使用单细胞RNA序列(scRNAseq),新的术语开始被引入,如疾病有关的小胶质细胞(坝)(Keren-Shaul et al ., 2017;Deczkowska et al ., 2018;哈蒙德et al ., 2019),在我们看来,也没有完全揭示小胶质细胞的各种角色和功能。
小胶质细胞的行为和他们的表型性状中详细研究了各种脑损伤(Loane库马尔,2016;徐et al ., 2017;律et al ., 2021)。然而,我们所知的小胶质细胞在脊髓损伤(SCI)还不足够。Bellver-Landete et al。(2019)报道不同人群的小胶质细胞/巨噬细胞存在于脊髓损伤的面积在1星期内损伤后小鼠细胞M1的数量超过M2的数量。这个缺乏平方米小胶质细胞/巨噬细胞也发现在慢性具有抑制受损(28天)延伸段,以及相比显著下降M1小胶质细胞具有抑制受损(延伸至7天Kigerl et al ., 2009;Francos-Quijorna et al ., 2016)。最近的一项研究哈基姆et al。(2021)显示稳定的居民小神经胶质细胞重新编程为大坝,开始3天post-SCI,强烈增强复苏。
到目前为止,没有接受的形态分类和术语形式的小胶质细胞,胶质细胞中杰出的一个显著的多样性。这是体现了不同的报道,主要描述了不同形态的小神经胶质细胞是分歧的,分歧的/ hyper-ramified de-ramified orbipolar /杆形态(莫里森et al ., 2017;Holloway et al ., 2019),而其他已发表的研究指的是煎蛋,变形和小胶质细胞肥厚性形态(林et al ., 2017;高et al ., 2018;Zhang et al ., 2020;Banerjee et al ., 2021)。应该注意的是,小胶质细胞的形态并不总是显示他们的表型。因此,结果表明,双相/杆状小胶质细胞的人口在体外高增殖潜能和表达的标记特征M1 (TNF-α,IL-1b、CD32和CD86)和M2 (il - 10和TGF -β)表型(Tam和马,2014年)。然而,其他比较变形和双相/杆状的小胶质细胞发现变形细胞产生促炎细胞因子的水平明显高于更类似于一个M1表型。此外,Kigerl et al。(2009)形容M1小胶质细胞/巨噬细胞细胞许多短,高度支化的流程和M2表型与单一细胞长流程SCI的小鼠模型。
尽管可用数据,它尚未确定是否定量成分的变化和形态不同的分群的小胶质细胞影响SCI的严重程度。潜在的性质和极化强度之间的相关性小胶质细胞在一定方向和SCI的结果可以作为发展的基础治疗的新方向,在创伤尤其相关的搜索,鉴于目前缺乏有效的治疗策略。
材料和方法
脊髓损伤撞伤
所有动物协议被喀山批准联邦大学动物保健和使用委员会(许可证号码:2,日期为5月5日,2015年)。成年女性Wistar鼠体重250 - 300克每从Pushchino实验室获得俄罗斯。动物每笼住3 - 4,在12 h光/暗周期提供食物和水随意。
手术进行了异氟烷麻醉和肌内注射Zoletil(20毫克/公斤,Virbac桑特Animale,法国)镇痛。皮肤切口后,Th8椎椎板切除术摘除。影响杆撞击器的集中Th8上方和降至诱发不同程度的科学:光(1.5米/秒,n= 20),中等(2.5米/秒,n= 20)和严重(4米/秒,n= 20)(影响一个立体定位撞击器,徕卡)。此外,36个老鼠的每组收集脊髓样本在3天,7和14 SCI后进行细胞因子分析和实时PCR。完整的动物(n= 15)被用作我们的对照组。根据前面描述的所有术后程序进行协议(Mukhamedshina et al ., 2017)。
行为研究
使用开放田地低音部运动功能评估,比蒂,Bresnahan (BBB)运动评定量表(低音部et al ., 1995)。利率运动评估和BBB规模范围从0到21岁。获得了一个基线SCI前3天。开放田地运动测试进行了一次一个星期。在功能恢复评估的差异,实验组和对照组的行为评估是SCI之前执行。运动同时得分2培训调查人员对治疗组也不清楚。
电生理研究
电生理测试进行完整的老鼠和控制/实验大鼠2和11周后损伤(wpi)如前所述Mukhamedshina et al ., 2019)。城市规划机构复合肌肉动作电位(CMAP)和H-response记录腓肠肌肌与单极电极针。一个活跃的电极放置在腹部肌肉的中间,在该地区的跟腱。单极电极针插入皮下注射区域内坐骨神经退出骨盆被用于刺激。电刺激坐骨神经进行方波单一刺激持续0.2 ms。
经颅电刺激运动中枢通路的用于评估。运动诱发电位(mep)注册从腓肠肌肌肉与提出相同的技术。电极针插入头皮接触下骷髅的骨激活运动皮层。阴极在中线位置大约0.5厘米从interorbital行尾,阳极在中线附近的枕骨。刺激持续时间是0.04毫秒,强度从20到400 V的变化。
双通道记录的躯体感觉诱发电位(SEPs)是用来评估中央感觉通路。注册完成了单极电极针插入皮下注射。登记的腰椎水平:一个活跃的电极上腰椎椎,参照electrode-over中间胸椎骨。从头皮登记:一个活跃的电极中线约0.5厘米从interorbital行尾,枕骨参照电极中线附近。电刺激的尾巴由表面的圆形电极刺激持续时间为0.2毫秒。刺激强度阈值选择的尾巴的动作(最低的刺激产生尾动作使用)。
组织学评估
组织学和免疫组织化学,60天postinjury (dpi)老鼠安乐死和4%多聚甲醛灌注intracardially (PFA,σ)。在4% PFA隔夜孵化后,脊髓被移除,放置在15%蔗糖为24 - 48 h。切之前,脊髓是存储在30%蔗糖。非固定组织用于rt - pcr。然后,样本被冻结在一个组织冷冻剂(Tissue-Tek O.C.T.化合物,樱花Finetek)。大约20 -μm横向组织切片上分段Microm HM 560低温恒温器。Azur-eosin染色后,组织可视化使用20×客观(APERIOCS2,徕卡)。使组织和异常蛀牙的横截面积测量的横向部分脊髓内病变中心的中点(震中)和脊髓段1-5-mm吻侧和尾受伤的网站。总面积异常在脊髓腔截面计算通过添加囊肿μm面积不小于1.5002。Aperio透视仪软件被用于测量组织区域。
Immunoelectron显微镜
immunoelectron显微镜,脊髓标本分离的距离5毫米尾Th8 /中心的SCI固定在10% PFA磷酸盐0.2%戊二醛溶液混合(阿尔法蛇丘,热费希尔科学)在4°C 12 h,在0.5% post-fixation OsO4(σ)在PBS 1 h在室温下(RT)。固定后,样本在乙醇梯度脱水,封装在LR白色聚合树脂(电子显微镜科学)。徕卡UC7超微切片机(莱卡)被用来获得0.1的超薄部分-μm厚度。超薄部分是安装在镍网格涂布formvar电影。片被封锁和tbs - nds - bsa - tx - 100(三羟甲基氨基甲烷缓冲液的解决方案(Tris.01 M,氯化钠。15-M pH = 8.2)], 10% normal donkey serum, 0.2% bovine serum albumin, and Triton X-100 0.1% for 1 h at RT. After washing in TBS, sections were incubated overnight at 4°C with antibodies against Iba1 (补充表1)。免疫金标记,部分被清洗和孵化与胶体gold-conjugated二级抗体(补充表1在RT) 2 h。
免疫过氧化物酶标记的部分是孵化0.5% H2O230分钟,其次是60分钟1% H2O2为30分钟,然后再在0.5% H2O2。部分被冲洗PBS和孵化自由浮动Iba1抗体有3%正常马血清,PBS Triton-X 0.05%, 24 h旋转在rt,然后组织冲洗3井30年代在PBS和孵化1 h生物素化的通用抗体(1∶向量实验室),在rt,然后旋转,部分被冲洗3井30年代在PBS和孵化1 h ABC(向量实验室)的解决方案,在rt,孵化后,旋转部分与PBS冲洗3分钟,由孵化0.025% diamino-benzidine (DAB)和0.002%过氧化氢在PBS。民建联的反应被PBS,紧随其后的是3 - x-30-s洗在PBS。
然后,获得部分与醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色对比和评估使用透射电子显微镜(日立HT7700)。禅宗蓝Lite程序和软件提供了日立7700透射电子显微镜是用来测量金纳米粒子的大小以及纤维厚度。
免疫组织化学研究
在PBS阻塞后含有5%正常山羊血清1 h RT,一夜之间,组织切片被孵化在4°C主要抗体(Abs) (补充表1)。在可视化之前,部分与相应的fluorophore-conjugated二级Abs(孵化补充表1)为2和4′h RT和复染色,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)(在PBS 10μg /毫升,σ)可视化细胞核。使用一个LSM 780共焦显微镜检查的部分(卡尔蔡司)。定量计数细胞表达TGF-βIba1和CD40进行。所有的部分都使用相同的共焦设置在z平面成像(激光强度、增益和偏移量)。测量从横向获得组织学部分收集了5毫米的距离从震中SCI尾。以下方面被选为小胶质细胞免疫组织化学分析:腹侧角(VH),主要的皮质脊髓束(CST)和腹侧funiculi (VF)。
研究小胶质细胞形态
小胶质细胞的形状和大小实验组被使用FracLac ImageJ分形分析,评估量化一个跨比和密度(如前所述)(莫里森et al ., 2017)。四annular-shaped小胶质细胞被选为分形分析在每个显微照片(5显微照片/动物)在VF和VH区。因为我们没有找到annular-shaped完好的脊髓小胶质细胞,有分枝的小胶质细胞被选为人口比较,跨比和密度的使用上面的方法进行了分析。我们也量化annular-shaped小胶质细胞和估计的直径micro-territories由他们的流程在VF和VH区实验小组。
获得脊髓组织匀浆
评估脊髓细胞因子在实验动物,部分脊髓受伤的5毫米长现场/ Th8准备和在300年与电动均质机均质μl完整的提取缓冲。叶片是冲洗两次300μl完整提取缓冲区,并不断搅拌维持在4°C 2 h。在15000转离心20分钟后在4°C,可溶性蛋白质提取收集和冻结在−80°C到细胞因子进行多元分析。
细胞因子测定
多路复用分析基于xMAP Luminex技术遵循制造商的指示执行bead-based免疫测定Bio-Plex Pro鼠细胞因子组l面板23-plex化验# 12005641 (Bio-Rad)。实验进行了一式三份。工具包允许同步多路复用分析23细胞因子,趋化因子和白细胞介素在50 -μl样本。
RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR
总RNA从新鲜分离脊髓受伤(5毫米长段包括网站)使用黄色解决工具包(硅石、俄罗斯)根据制造商的指示。RNA质量和数量测量使用NanoDrop(热科学)。大约100 ng的总RNA进行反向转录100 U的RevertAid逆转录酶(热科学),100 pmol六聚体随机引物5 U的核糖核酸酶抑制剂根据制造商推荐的协议(25°C-10 min, 42°C-60 min,终止转录,70°C-10 min)。信使核糖核酸的定量分析Iba1, il - 6, TGF-βCD209, CD40基因进行了使用一个排名96实时PCR系统(Bio-Rad)。放大条件如下:95°c - 3分钟,39周期:95°C-10年代,55°正在年代,包括板读。每个反应是在重复执行总量的10μl含有100 ng稀释cDNA、2.5×反应混合物B (Syntol),每个引物200 nM和100 nM SybrGreen (Eurogen) (补充表2)。使用GAPDH rRNA mRNA表达规范化。质粒DNA与对应的插入是用于创建量化的标准曲线。评估拷贝数的质粒DNA插入,我们使用DNA拷贝数calculator1。Cq范围18岁13 - 14日周期,而测试基因范围从25到31日。
统计分析
生成的结果表示为一个平均数±标准差。方差分析与图基的测试是用于多种对比所有调查群体。Mann-Whitney测试是用于分析PCR的结果分析。所有失明的方式分析治疗组。实验组均值之间的差异被认为是重要的如果p< 0.05。数据分析使用起源7.0 SR0软件(OriginLab)。
结果
结构和功能变化的条件下大鼠脊髓损伤的不同程度的严重性
形态测定分析表明,使组织的面积在60 dpi大吻侧方向(1 - 5毫米)的震中受伤小集团SCI轻1.5 (SCI)或者媒介2.5 (SCI)相比,严重程度最严重的群体伤害(SCI 4)和尾方向光SCI 1.5组相比中等SCI 2.5和严重SCI 4组(图1 a - c)。异常空洞的面积是最小距离震中受伤的研究在SCI 1.5组相比更严重受伤SCI 2.5和SCI 4组(图1 b, C)。同时,更高的价值发现蛀牙异常区域的距离3 - 5毫米的喙的SCI 4组相比,SCI 2.5和1.5 SCI组。然而,在上面的形态学指标无显著差异分析实验组之间被发现。
图1所示。组织分析实验小组。没有组织的一个领域(一)和总面积异常蛀牙(B)5毫米的吻侧和尾震中受伤后60天轻微的脊髓损伤(SCI 1.5,n2.5 = 8)、中度(SCI,n= 8)、严重(SCI 4,n= 8)清规戒律。在上面的形态学指标无显著差异分析实验组之间被发现,单向方差分析图基的事后考验紧随其后。(C)横截面脊髓受伤的60天在实验性脊髓损伤后组织azur-eosin染色。
后肢的运动活动进行了使用BBB行为测试从7岁到60 dpi。电机功能分数最高的SCI 1.5组相比,SCI 2.5和SCI 4组,从2批发价格指数(图2一个)。同时,SCI 1.5和2.5 SCI团体之间的显著差异被认为在实验的最后一个星期,和1.5之间SCI在37-60 dpi和SCI 4组。应该指出的是,后肢运动活动分数在SCI 2.5组高于在60 dpi SCI 4组,但没有显著差异。
图2。Post-SCI行为和电生理学的研究在实验小组。评估使用低音部的运动活动,比蒂,Bresnahan (BBB)评定量表从7到脊髓损伤后60天轻微1.5 (SCI),中等(SCI 2.5),和严重的严重程度(SCI 4)(一),n在每组= 20。电机功能分数最高的SCI 1.5组相比,SCI 2.5和SCI 4组,从2批发价格指数。*p<0.05与SCI 4组;# #p<0.05与2.5 SCI组相比,单向方差分析图基的事后考验紧随其后。坐骨神经传导的调查在30和60 dpi Amax所示的并购浪潮(B)和H / M波振幅比(C)在实验小组。在30 dpi, M-response的振幅在SCI 1.5组和Hmax / Mmax SCI 2.5组较低而完整的控制。在60 dpi, Hmax / Mmax只观察到的差异SCI 4组和完整的控制。* *p<0.05;#p<0.05与完整的控制相比,单向方差分析,其次是图基的事后考验。
调查坐骨神经传导dpi显示减少30日(p< 0.05)的振幅M-response SCI 1.5组腓肠肌肌的较完整的控件(图2 b)。与此同时,在这个指标实验组之间没有差异被发现在30或60 dpi。30日dpi, H-reflex记录为大大减少频繁在SCI 2.5组相对完整的控制和SCI 1.5组。在同一时期,Hmax / Mmax较低(p< 0.05)在SCI 2.5组相比,完整的控件(图2 c)。60岁dpi,没有差异的频率H-response实验群体之间和完整的控制。然而,Hmax / Mmax SCI 4组较低而完整的控制。
调查中央运动通路的方法经颅电刺激在所有实验组30和60 dpi证明有明显的减少在登记的频率和振幅的腓肠肌肌肉议员在刺激大脑皮层(表1)。关于60-dpi议员们明显更频繁的在SCI 1.5组(60%的病例)与科学相比2.5组(30%的病例)和SCI 4组(25%的病例)。应该注意的是,没有议员的振幅特征的差异在实验小组。
表1。结果经颅电刺激和运动诱发电位(MEP) /头皮躯体感觉诱发电位(SEP)登记的老鼠。
当评估中央躯体感觉通路内的所有动物完整的对照组,SSEP峰值记录电极的腰椎(腰峰)和电极放在头皮皮肤(皮质山峰)。腰椎山峰SCI后继续被记录在所有动物实验组没有差异振幅,包括与完整的对照组相比,这反映了保护外围躯体感觉通路的一部分。同时,在实验组,有显著减少皮质SSEP的频率峰值较完整的对照组(表1)。同时,dpi SCI 4组,30日皮质山峰经常记录SCI 1.5和2.5 SCI组相比,但是,实验组60 dpi,这些差异消失了。
总结获得的结果,我们可以得出结论,SCI 1.5组有明显改善在60 dpi中央运动路径,使其可以维持正常的兴奋性反射弧的腰椎水平,与SCI 2.5和SCI 4组。
细胞因子在脊髓组织
确定的细胞因子表达水平不同程度的脊髓损伤后的严重程度,进行了多元分析。显著差异被发现在内容分析物的急性(3 - 7 dpi)和亚急性(dpi) 14日受伤后时期(图3一)。促炎细胞因子的水平IL-1β在所有SCI损伤组相比显著增加完整的控件(p由3 dpi < 0.05)。同时,在动物群体严重创伤(SCI 4), IL-1β较低(p< 0.05)相比,不太严重的SCI 1.5和2.5 SCI组(图3 b)。dpi, 14日的表达IL-1β动物脊髓的轻微创伤1.5 (SCI)呈逐渐下降趋势,显示出显著差异与中等严重程度SCI 2.5组(分别为8.8±3.7和33.3±17.9)。同样,促炎细胞因子的水平也增加了在所有SCI - 2组(除了天具有抑制受损在SCI 2.5延伸3和7组)相比,完整的控件(p< 0.05)。然而,在- 2表达显著差异观察实验小组在7至14 dpi (图3 c)。7 dpi的最高水平- 2观察轻度创伤组1.5 (SCI),从SCI 2.5组有显著差异(分别为177.5±85.4和52.6±30.1)。然而,在2 wpi,情况发生了戏剧性的改变与水平显著降低在SCI 1.5 - 2组和增加了2倍多,更严重受伤SCI 2.5和SCI 4组(85.5±52.8 1.5 (SCI)和382.1±183.7 2.5 (SCI)和198±5.9 (SCI 4),p< 0.05)。
图3。细胞因子的分析和完整的脊髓撞伤。热图分析细胞因子(颜色键)在实验性脊髓组织和完整的控制(一)。浓度(Y轴,pg / ml) IL-1b, 2、il - 6, IL-17, IFN-g, il - 4,并在天TNF-a 3、7、14日和60脊髓损伤后的1.5 (SCI)温和,温和的2.5 (SCI)、严重(SCI 4)严重程度进行了分析(b - h),n每组= 7,上述每个dpi。完整的脊髓中细胞因子表达水平被认为是1。* p<0.05与所有调查群体;#p<0.05与1.5 SCI组相比,单向方差分析,其次是图基的事后考验。
发现了类似的趋势14日dpi其他促炎细胞因子il - 6, IL-17 IFN-g,水平的显著降低在此期间组中有轻微创伤(SCI 1.5)相比更严重受伤SCI 2.5和SCI 4组(图3 d-f)。同时(dpi) 14日,il - 4和il - 12的浓度在SCI 1.5组也最小,但是相比显著差异被发现SCI 2.5组(il - 4 -0.8±1 (SCI - 1.5)和8.3±5.3 2.5 (SCI),p< 0.05;il - 12 - 25.7±14.2 (SCI - 1.5)和82.7±34.2 2.5 (SCI),p< 0.05)(图3 g)。然而,14日dpi,促炎细胞因子IL-1a和GRO / KC增加轻微创伤组1.5 (SCI)相比SCI 4组(p< 0.05)。它也是值得注意的,在同一时期,抗炎细胞因子il - 10的水平和血管生成/神经营养因子VEGF,值得注意的是,在SCI 1.5组最低。
TNF-a表达脊髓也测量。3 dpi的最高表达TNF-a发现轻微的创伤SCI 1.5组(218.6±20.7和64.1±34.1 (SCI - 2.5)和101.9±49.1 (SCI 4),p< 0.05)。随后,有一个逐步减少TNF-a水平组的1.5 (SCI),在14-dpi TNF-a表达相比,动态的最低点TNF-a表达式的其他实验群体(62.2±36.5和106.9±41.6 (SCI - 2.5)和74.5±21.3 (SCI 4)] (图3 h)。类似动态IL-5成立,这是最高水平的具有抑制受损在SCI 1.5延伸天3和7组,但是,在14 dpi,变得明显低于其他实验群体(21.6±6.6和44.7±13.8 (SCI - 2.5)和43.7±15.1 (SCI 4)]。
应该注意的是,一些细胞因子与中度损伤组中经历了重大变化(SCI 2.5)。因此,在3和7 dpi,促炎细胞因子的地震显示较低(p< 0.05)的表达水平的面积损伤动物的SCI 2.5组相比其他实验群体。类似的变化3 dpi指出咆哮,这个分析物的水平在SCI 2.5组相比显著降低SCI 1.5和SCI 4组由5 - 7倍,分别。同时,趋化因子的表达MCP-1是SCI 2.5组最高,显示显著差异的SCI 4组3 dpi。7点MCP-1 dpi的水平在SCI 2.5组保持最高(∼高出三倍,p< 0.05)比其他实验小组。
Microglia-Specific基因的mRNA的表达
的表达Iba1, il - 6、IL-1b CCL22、TNF-a TGF -β,CD209mrna建立了完整的大鼠脊髓伤组天3、7、14岁和60后受伤。的最高表现Iba1指出mRNA组与轻度创伤1.5 (SCI)从3 - 14 dpi最大值在亚急性期(dpi) 14日,在其他实验群体相比差异显著(43.1±24.7和11.3±8.2 (SCI - 2.5)和11.6±4.9 (SCI 4)] (图4一)。在60 dpi,显著减少的表达Iba1信使rna在SCI 1.5组,点的表达Iba1不再是显著不同团体SCI增加2.5和SCI 4但仍相对完整的控制。也获得了类似的结果TGF -βmRNA水平,这在更大程度上增加7和14 dpi SCI的最大值1.5 group by 14 dpi,那里∼三倍高(p< 0.05)相比,SCI 4组(图4 b)。类似于Iba1表达的水平TGF -β减少60 dpi轻微创伤SCI 1.5组没有显著差异TGF -β表达的其他实验群体,虽然TGF -β表达仍高相对完整的控制。
图4。信使rna表达的分析SCI大鼠的面积。的相对数量Iba1 TGF -β,CD40, il - 1β,il - 6、CCL22 TNF-α,和CD209信使rna表达(a)3、7、14和脊髓损伤后60天轻微(SCI 1.5,一个浅灰色的列),中等(SCI 2.5,一个灰色的列),和严重的严重程度(SCI 4,黑色列)(n= 5在每组和每一个上面的dpi),计算与完整的脊髓控制,被认为是1。使用GAPDH rRNA mRNA表达规范化。* p<0.05与所有调查群体;* * p<0.05与科学相比2.5组;#p<0.05与1.5 SCI组相比,单向方差分析,其次是图基的事后考验。
的水平CD40mRNA表达最高的轻微创伤SCI 1.5组7 dpi,其价值高出∼4倍(p< 0.05)比水平发现在SCI 2.5组(图4 c)。在14和60 dpi,逐渐减少的表达CD40信使rna在SCI 1.5集团的水平没有明显不同于其他实验小组。在急性(3 dpi)和慢性(60 dpi)时期,我们还发现显著差异的表达CD40组中度和重度损伤组、高表达在SCI 4组。
类似于CD40, IL-1β和il - 6信使rna表达显著增加在严重创伤(SCI 4)组7 dpi;在14 dpi这些水平略有下降,但又增加了60 dpi,以最大的表达式值观察SCI 1.5和SCI 4组60 dpi (图4 d, E)。应该注意的是,的水平il - 6信使rna表达∼100倍高(p1.5 < 0.05)在SCI和SCI 4组60 dpi与完整的控制,由多元分析与结果一致的il - 6蛋白的水平。
的水平CCL22信使rna也增加7点dpi,组中表达最高的发现与严重创伤(SCI 4)(15.4±7.2和3.4±1.3 1.5 (SCI)和3 2.6±2.5 (SCI),p< 0.05)和随后的减少14 dpi (图4 f)。与il - 6的水平CCL22信使rna在60岁dpi也增加了再次在SCI 1.5和SCI 4组。最伟大的表达的变化TNF-a信使rna也关注组与轻度1.5 (SCI)和严重创伤(SCI 4),这个信使rna逐渐从3增加到60 dpi和SCI相比明显高于2.5组(图4 g)。最后,表达CD209mRNA表达逐渐从3增加到60 dpi,但是表达的差异没有达到意义之间的实验小组在调查期SCI后(图4 h)。
研究小胶质细胞形态学的变化
小胶质细胞形态学分析60 dpi 5毫米的距离震中的尾SCI在不同实验小组。除了以前描述的特征和形态的小胶质细胞(分枝和变形),我们还发现annular-shaped小胶质细胞在白质VF和中科区域分析。形态的形成是由于空间定位的过程,形成圆形或椭圆形micro-territories (图5模拟)。应该注意的是,这样的小胶质细胞形态在灰质很少观察到;annular-shaped小胶质细胞在个位数在这个区域(图5情况)。
图5。小胶质细胞形态学的分析SCI和完整的控制。小胶质细胞形态的可视化使用anti-Iba1抗体(绿色)在腹侧funiculi (VF)和腹侧角(VH)在脊髓损伤后60天轻微(SCI 1.5;B, F)、温和(SCI 2.5;C、G),和严重(SCI 4;D H严重程度)和完整的控制(A, E)5毫米的距离震中的尾受伤。所有的部分都使用相同的共焦设置在z平面成像(激光强度、增益和偏移量)。Annular-shaped小胶质细胞用箭头表示。核是DAPI-stained(蓝色)。酒吧规模:20μm。许多annular-shaped小神经胶质细胞(我)和直径micro-territories annular-shaped小胶质细胞的过程形成的(J)VF 1.5 SCI后60天内(一个浅灰色的列),SCI 2.5(一个灰色的列),或SCI 4(黑色列)。* p<0.05与所有调查群体相比,单向方差分析,其次是图基的事后考验。汇总数据的小胶质细胞密度(K)和跨度比(左)VF在60天内上述实验团体和完整的控制。示意图说明的凸包(蓝色)和边界圆在二进制显微照片(紫色)调查组织必要的计算跨度小胶质细胞率和密度(M)。
在VF区,我们观察到的最大数量annular-shaped小胶质细胞,我们分析的数量和直径micro-territories由他们的流程。严重损害组(SCI 4), annular-shaped小胶质细胞的数量最高(18.85±5.5和11.14±5.1 (SCI 1.5,p< 0.05)和14.86±4.6 2.5 (SCI)],和micro-territories由他们的流程的直径达到16.86±3μm, 32.1% (p比在SCI 1.5 < 0.05)组(12.76±2.7)(图5 i, J)。
我们分析了小胶质细胞形态与细胞形状:跨比和密度。小胶质细胞跨比和密度损伤领域的实验组降低30.7%,三倍(∼p< 0.05)分别与完整的控件(相比图5 km)。然而,在这些参数没有明显差异的不同划分SCI之间。
除了上述情况,我们进行了免疫电镜分析为了理解哪些结构包围annular-shaped小胶质细胞的过程。我们的研究结果表明,瓦解髓鞘纤维存在于圆形或椭圆形micro-territories annular-shaped过程形成的小胶质细胞(图6)。解体髓鞘形成同心多层电子致密的结构。Immunoperoxidase染色使用anti-Iba1抗体演示了一个暂停电子密度在细胞质中解体过程位于邻近地区的髓鞘和周围的这些地区与薄过程(图6 a, B)。采用免疫染色与金纳米粒子显示的表达Iba1小胶质细胞的细胞质和细胞核(图6 c, C1)。金纳米粒子的累积也可视化解体髓鞘层之间的(图6 c₁)。的发现annular-shaped小胶质细胞细胞质的电子密度增加;线粒体细胞器可视化很差,但与朦胧地分辨crystae被检测到。我们的数据证实小神经胶质细胞形状的变化/伸长和大小和annular-shaped的存在形式的这些细胞,这周围瓦解SCI后髓鞘纤维。
图6。SCI annular-shaped小胶质细胞的超微结构。小胶质细胞超微结构的可视化使用anti-Iba1抗体在腹侧funiculi轻微挫伤后60天(VF)损伤(SCI 1.5组)。积极immuno-peroxidase染色与小胶质细胞的细胞质中anti-Iba1抗体过程(蓝色标记)包围瓦解髓鞘纤维(星号)(一)。积极采用免疫反应与anti-Iba1抗体结合金纳米粒子(箭头)的原子核,perikarion和流程的小胶质细胞(绿色)(B, C, C1)。的发现annular-shaped小胶质细胞细胞质的电子密度增加;线粒体细胞器可视化很差,但与朦胧地分辨crystae被检测到。的(C)区域标有虚线框对应的放大图像(C1)。获得部分评估使用透射电子显微镜(日立HT7700)。规模栏:(一)5,(B)2,(C)1μm。
该研究还分析了比例Iba1的比例+-annular-shaped细胞Iba1的总数+肽在实验小组,高∼10折叠VF相比VH区域(图7)。然而,没有明显差异在每个分析Iba1的百分比+-annular-shaped细胞实验人群与不同程度的SCI严重性。
图7。Iba1的百分比+在SCI -annular-shaped小胶质细胞。Iba1的百分比+-annular-shaped细胞Iba1的总数+肽(轴)腹funiculi (VF)和腹侧角(VH)在脊髓损伤后60天轻微(SCI 1.5,一个浅灰色的列),中等(SCI 2.5,一个灰色的列),和严重的严重程度(SCI 4,黑色列)5毫米的距离震中的尾受伤。在上述指标无显著差异的形态学分析被发现之间的实验小组,单向方差分析,其次是图基的事后考验。
定量CD40和肿瘤生长的变化Factor-β表达小神经胶质细胞的数量
小胶质细胞的总数估计使用锅Iba1标志。结果表明,在60 dpi, Iba1的数量+细胞仍然升高实验组相比,完整的控件(图8)。然而,Iba1数量无显著差异+小胶质细胞被发现在VF、VH或春秋国旅区域时比较实验群体和不同程度的SCI严重性。
图8。定量CD40和TGF-β表达小胶质细胞数量的变化。Iba1的数量+(一),Iba1+/ TGF-β+(B),Iba1+/ CD40+细胞(C)(轴)检查区域(x轴)的完整的实验组脊髓和脊髓损伤的温和1.5 (SCI),中等(SCI 2.5),和严重(SCI 4)清规戒律(n在每组= 8)。可视化不同的小胶质细胞数量使用Iba1(绿色),TGF-β(红色)或CD40(红色)5毫米的尾损伤中心(60 dpi)在腹侧funiculi (VF)和主要的皮质脊髓束(CST)组织调查(D-K)。Iba1+/ TGF-β+和Iba1+/ CD40+细胞用箭头表示。所有的部分都使用相同的共焦设置在z平面成像(激光强度、增益和偏移量)。我地区标有虚线框对应的放大图像I1, I2和I3。核是DAPI染色(蓝色)。酒吧规模:20μm。* p<0.05与所有调查群体;#p<0.05与完整的控制相比,单向方差分析,其次是图基的事后考验。
不同数量的小胶质细胞数量SCI后不同程度的被免疫组织化学分析确定Iba1评估+/ TGF-β+(M1神经毒素)和Iba1+/ CD40+(M2a神经)细胞(沃克和卢,2015年)。Iba1+/ TGF-β+细胞,Iba1相比+/ CD40+细胞,更均匀地分布在脊髓受伤,和没有明显的定量差异被发现在VF VH,或者春秋国旅控件(相比图8 c, H-K)。60岁dpi, Iba1的数量+/ TGF-β+和TGF-β+细胞在5毫米的距离震中的尾受伤没有发生显著的变化,无论SCI的严重性。
Iba1的数量+/ CD40+细胞增加SCI组相比完整控制在春秋国旅(0.22±0.4 (Intactcontrol)和9.91±5.6 (SCI - 2.5)和5.58±3.8 (SCI 4),p< 0.05)和VF地区(0.23±0.4 (Intactcontrol)和5.11±3.5 (SCI - 1.5)和7.81±4.1 (SCI - 2.5)和5.6±4.2 (SCI 4),p< 0.05)的最大数量中等严重程度SCI 2.5组(数字8,H-K)。然而,我们又没有发现显著变化Iba1的数量+/ CD40+细胞研究领域SCI的团体之间不同程度的严重性。
该研究还分析了比例Iba1的比例+/ TGF-β+和Iba1+/ CD40+细胞Iba1的总数+肽在实验组(表2)。Iba1的比例最高+/ TGFβ+细胞中发现了完整的对照组相比,科学实验小组。在VF Iba1的百分比+/ TGFβ+细胞显著降低VF地区在轻微外伤SCI 1.5组和VH地区严重的SCI 4组。在所有的三个实验小组,Iba1的数量+/ TGFβ+细胞中科地区较低。与此同时,Iba1的百分比+/ CD40+细胞增加了SCI组CST和VF地区,在那里不少于5.5倍高(p< 0.05)实验组相比,完整的控制。
表2。Iba1的百分比+/ TGF-β+和Iba1+/ CD40+细胞相比Iba1所有人群+细胞的完整性,在大鼠脊髓60 dpi撞伤。
讨论
虽然有大量的研究在SCI的发病机制,重编程的分子和细胞机制小胶质细胞向神经毒性和/或神经保护表型仍然不清楚。迄今为止,这尚未建立因素和细胞间的相互作用在小胶质细胞的极化发挥最大的作用在一个方向或另一个。这是证实了这一事实,在调查的一个重要阿森纳抑制剂的存在小胶质细胞的活动,没有一个选项通过临床试验尚未发现其应用。可能对二分法的发展的贡献小胶质细胞的反应是神经组织损伤的程度。然而,直到现在,这样的研究尚未开展,虽然他们可以的重要性不仅对基础科学的实际应用和发展也为最佳治疗策略。
上述证实了我们研究的重要性和相关性高的定量和定性评估各种人群SCI大鼠模型中的小胶质细胞的不同程度的严重性。与小胶质细胞的直接研究之前,我们验证了温和的挫伤大鼠SCI模型,中度和严重的伤害。形态学分析获得的数据是一致的高尚而Wrathall (1985)表明,SCI严重程度的增加,使组织的面积减少。我们还发现使用电动机复苏BBB评分随SCI的严重程度增加而降低。巴罗斯球场和更莫利纳(2008)显示,BBB评分高重现性轻度SCI和再现性低中度和严重的伤害。这一发现解释之间没有显著差异的情况下适度SCI 2.5和严重伤害SCI 4组在我们的研究中。我们获得类似的行为数据功能评估使用电生理学的研究。因此,该组织有轻度损伤的严重程度(SCI 1.5)有一个优势中度和重度SCI的团体,因为它在中央运动通路传导指数明显高于60 dpi,维护正常兴奋性反射弧的腰椎水平。这些结果与研究一致曹et al。(2005)作者表明,SCI严重性增加,使组织减少,和运动功能和神经纤维导电性能恶化。指出本研究以及我们之间的显著差异在上述参数组和中度和严重程度的伤害并不总是存在。然而,一般来说,这种综合方法评估脊髓结构和功能的不同程度的SCI的能证实创造各种条件对神经组织的修复。
的定量和定性评估各种小神经胶质细胞的数量,我们相信,细胞因子的评估SCI地区构成微环境也非常重要,可以澄清的原因重新编程的小胶质细胞向神经毒性和/或神经保护表型。在我们的研究中,我们发现促炎和抗炎细胞因子的水平在3 dpi相比显著增加完整的控制,而经常在60 dpi达到最大值。早些时候,表明,尽管慢性期间,小胶质细胞产生大量的促炎细胞因子,这对应于第二波小胶质细胞激活(高尚而Wrathall, 1989年;Milich et al ., 2019)。应该注意的是,在细胞因子的表达无显著差异实验组观察到60 dpi。它可以认为,慢性时期(60 dpi),创伤后流程以类似的方式进行,无论受伤的严重程度。然而,我们不能断言,只有小胶质细胞在细胞因子的构成做出贡献在受损区域的知名度。
利用rt - pcr,我们发现增加的程度Iba1mRNA在SCI,这是一个逻辑过程的结果的主要创伤后流程和招聘小胶质细胞(Poulen et al ., 2021)。同时,我们观察到最大的增长Iba1和TGF我mRNA水平轻微SCI后14天。间接地,这可能表明神经保护小胶质细胞数量的增加和更重要的抑制免疫过程的温和SCI在亚急性期(森野et al ., 2008)。的CCL22mRNA水平的表达,以及TGF-β是神经保护小胶质细胞的特征(Jurga et al ., 2020),它还显示最重要的差异实验团体初期SCI (dpi) 7日之后,最大值是在严重的SCI损伤的动物群体。与此同时,CD40信使rna水平,表达产品的早期神经毒性小胶质细胞激活的标志(一支et al ., 2006持续),有一个更高层次的表达在轻微外伤SCI 1.5组织还在损伤后的早期比其他实验小组。因此,我们发现最大的增加,重大的改变Iba1, TGF-β,CD40mRNA表达组有不同程度的SCI之间7和14 dpi。与此同时,的表达il - 6, IL-1βTNF-α,cd - 209信使rna SCI后逐渐增加,达到了最大60 dpi表达式。这些数据表明,炎症过程在SCI后不同时期最有可能由不同的机制,而慢性时期(60 dpi),然后继续在更相似的方式,无论受伤的严重性。
在实验小组,主要在VF的白质和中科地区,我们发现annular-shaped小胶质细胞,形态的形成由于空间定位的过程,形成圆形或椭圆形micro-territories,瓦解髓鞘纤维包围。令人惊讶的是,我们没有发现任何以前这样的小胶质细胞形态出现在SCI的描述。此外,我们首次建立了annular-shaped小胶质细胞的数量和直径micro-territories由他们的过程直接相关的程度伤害SCI的严重程度增加。总的来说,我们的数据确认小神经胶质细胞形状/伸长和大小的变化,这些细胞的annular-shaped形式的存在。
评估不同人群的小胶质细胞/巨噬细胞在科学领域,我们使用Iba1的免疫组织化学分析+/ TGF-β+和Iba1+/ CD40+细胞。当评估Iba1的总人口+在受伤的脊髓小胶质细胞完整控制相比,我们发现60 dpi的显著增加。而在Iba1没有显著差异+小胶质细胞之间的观察实验小组,这些结果,对应Iba1的增加+在受伤的大鼠脊髓小胶质细胞延迟慢性期间,符合别人的作品(吴et al ., 2005)。但是,第一次,我们还进行了定量的评估神经(Iba1+/ TGF-β+细胞)和神经毒性(Iba1+/ CD40+在此期间细胞)的数量小胶质细胞。在60 dpi, Iba1的数量+/ TGF-β+细胞实验小组的调查区域不发生重大变化并出席类似水平的完整的脊髓控制。然而,Iba1比的百分比+/ TGF-β+细胞相比Iba1所有人群+细胞内脊髓挫伤较低相比,完整的脊髓。与此同时,Iba1的数量+/ CD40+细胞和他们的百分比比所有Iba1人口+细胞增加了60 dpi的白质受伤而完整的脊髓,虽然与科学实验组之间无显著差异的不同程度的严重性。这些发现可能间接表明标准化或减少神经保护小胶质细胞激活后的一段时间内的慢性损伤(60 dpi),以及正在进行的神经毒性小胶质细胞激活脊髓白质的受伤。
不幸的是,我们的研究由于免疫组织化学分析不同人群中的小胶质细胞/巨噬细胞完整,只在慢性脊髓受伤时期(60 dpi)。因此,全面总结小胶质细胞的行为是否会影响的严重性SCI和确定这种疾病的结果,进一步研究小胶质细胞和巨噬细胞浸润的人群的急性和亚急性期SCI是必需的。总之,我们获得的数据有潜在的影响,因为他们支持一个小胶质细胞激活的作用影响的严重性SCI和值得进一步研究的第一次描述了annular-shaped小胶质细胞来决定它们的价值在SCI的治疗和管理。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。
道德声明
动物研究回顾和批准的喀山联邦大学动物保健和使用委员会(许可证号码:2日期为5月5日,2015年)。
作者的贡献
EA导致免疫组织化学,获得脊髓组织匀浆,和细胞因子测定。互补脱氧核糖核酸合成和rt - pcr在导致免疫组织化学,和小胶质细胞形态的研究。DS导致共焦显微镜和统计分析。正义与发展党导致SCI和术后护理和行为,组织学评估。SA immunoelectron显微镜。ARo导致电生理学的研究。YM,阿里,VJ导致发展的研究计划和参与文章的写作。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这个手稿已经支持的喀山联邦大学战略学术领导支持的项目和研究俄罗斯基础研究基金会(YM)(批准号20-34-90060)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2021.802558/full补充材料
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关键字:脊髓损伤、小胶质细胞、大鼠、极化、形态
引用:Akhmetzyanova呃,Timofeeva AV,为乌DK, Kostennikov AA, Rogozhin AA,詹姆斯V, Arkhipova党卫军,Rizvanov AA和Mukhamedshina哟(2022)越来越严重的脊髓损伤导致小胶质细胞/巨噬细胞与Annular-Shaped形态和没有变化表达CD40和肿瘤生长具有抑制受损阶段延伸Factor-β在慢性。前面。摩尔。>。14:802558。doi: 10.3389 / fnmol.2021.802558
收到:2021年10月26日;接受:2021年12月28日;
发表:2022年2月24日。
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