原始研究的文章

前面。摩尔。>。,14February 2020
秒。疼痛机制和调节器
卷12 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fnmol.2019.00324

外围δ阿片受体调节Formoterol Anti-allodynic神经性疼痛的小鼠模型的影响

Rhian爱丽丝Ceredig ¹,

Florian皮埃尔^{1 __},

Stephane Doridot ²,

Unai Alduntzin ^{1 __},

皮埃尔母鸡¹,

Eric Salvat ^1、3,

Ipek Yalcin ¹,

克莱尔Gaveriaux-Ruff ⁴,

米歇尔•巴罗特¹和

多米尼克•Massotte ^{1 *}

¹神经科学研究所des Cellulaires Integratives,中心国家de la任职,斯特拉斯堡大学、法国斯特拉斯堡
²Chronobiotron,中心国家de la任职,斯特拉斯堡,法国
³中心d”et de Traitement de la Douleur Hopitaux斯特拉斯堡大学医疗,斯特拉斯堡,法国
⁴de Genetique研究所等生物Moleculaire Cellulaire,中心国家de la任职,斯特拉斯堡大学,由法国Illkirch

目前治疗神经性疼痛是一个具有挑战性的条件往往仍不满意。慢性管理β2肾上腺素能受体激动剂,包括formoterol目前用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺疾病,减轻机械触诱发痛坐骨神经袖口的神经性疼痛模型。目前有限的临床数据还表明,formoterol将是一个合适的候选药物再利用。β2 antiallodynic行动的肾上腺素能受体激动剂是需要激活的delta-opioid(计划)受体但更好的知识分子机制是必要的。使用鼠标线夹住受体选择性地切除的神经元表达Nav1.8钠离子通道(夹住cKO),我们表明,这些计划所必需的外围受体antiallodynic行动的β2肾上腺素能受体激动剂在袖口formoterol模型。使用鼠标敲入线夹住受体的表达荧光版本与增强型绿色荧光蛋白融合(DOPeGFP),我们建立在先前的研究中,机械触诱发痛与一个较小的百分比DOPeGFP积极的小肽能的感觉神经元在背根神经节(DRG),以降低密度DOPeGFP积极自由皮肤神经末梢和增加DOPeGFP表达在细胞表面。在这里,我们表明,密度DOPeGFP积极自由皮肤神经末梢部分恢复,没有增加DOPeGFP易位到质膜中观察到小鼠的机械在长期口服formoterol疼痛缓解。这项研究中,因此,扩展了我们的以前的结果确认机械阈值的变化与外围夹住剖面的变化相关联。它还强调了共同影响计划之间的5 -羟色胺受体去甲肾上腺素再摄取抑制剂如度洛西汀和β2模仿formoterol。

介绍

神经性疼痛来自创伤性神经损伤或疾病,影响躯体感觉系统,特点是自发性疼痛,机械触诱发痛和/或热过敏(冯Hehn et al ., 2012)。一线治疗包括抗抑郁药,如5 -羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri类),或抗惊厥药如类(克雷默et al ., 2016 a)。在临床前研究中,β2-adrenergic受体的激活已被证明是强制性antiallodynic行动的抗抑郁药(Yalcin et al ., 2009;克雷默et al ., 2016 a,2018年)和慢性管理几个β2-adrenergic受体激动剂如formoterol已经成功地用来减轻机械触诱发痛(Choucair-Jaafar et al ., 2009,2014年;Yalcin et al ., 2010;若丹畠山直哉,2019)。Formoterol已经在诊所经常用于治疗慢性阻塞性肺疾病(Vanfleteren et al ., 2018)。同时,吸入β2-agonists围手术期期间与低五倍的风险post-thoracotomy慢性抗抑郁药或慢性神经性疼痛而gabapentanoids出现无效(Salvat et al ., 2015)。因此,药物再利用可以被设想治疗神经性疼痛。

救援机械触诱发痛的机制广泛研究的主题在各种临床前模型,但仍不清楚。有趣的是,delta-opioid(计划)受体antiallodynic夹住受体激动剂的影响是至关重要的(Nozaki et al ., 2012;Vicario et al ., 2016),还因为antiallodynic慢性抗抑郁药(管理的影响Benbouzid et al ., 2008 b;Yalcin et al ., 2010;Ceredig et al ., 2018;克雷默et al ., 2018)和β2模拟(Yalcin et al ., 2010;Choucair-Jaafar et al ., 2014)。更具体地说,我们以前的工作使用袖口模型指出,外围夹住在Nav1.8受体表达阳性神经元作为antiallodynic强制性行动计划受体激动剂(Gaveriaux-Ruff et al ., 2011;Nozaki et al ., 2012)以及SNRI度洛西汀(Ceredig et al ., 2018)。我们的数据还显示,外围夹住受体的表达谱的变化与机械触诱发痛。事实上,我们观察到减少夹住受体表达无髓鞘的降钙素相关基因肽(CGRP怎样)阳性神经元和免费皮肤神经末梢和增加表面表达神经元仍然表达受体在小鼠慢性神经性条件但不接受度洛西丁袖口手术后(Ceredig et al ., 2018)。在这里,我们试图确定是否同样的机制是由慢性治疗β2肾上腺素能受体激动剂formoterol通过识别边缘夹住受体的表达变化使用鼠标线边缘夹住受体的选择性切除在神经元表达Nav1.8钠离子通道(夹住cKO;Gaveriaux-Ruff et al ., 2011)和一个敲入鼠标线夹住受体融合表达绿色荧光蛋白eGFP (DOPeGFP;谢勒et al ., 2006)。我们的数据表明,外围夹住受体表达Nav1.8 +神经元被强制formoterol anti-allodynic活动。夹住表面表达较低相比,动物治疗慢性formoterol神经性条件。然而,夹住受体表达在神经末梢自由只是部分恢复皮肤和保持类似神经性条件后的背根神经节(DRG)慢性formoterol。完全,数据表明,抗抑郁药和β2模仿效应进行类似DOP-dependent机制。

材料和方法

动物

DOPeGFP敲入小鼠注入夹住受体表达绿色荧光蛋白的同源重组产生的。在这些动物中,eGFP cDNA之前五个氨基酸链接器(G-S-I-A-T)被引入夹住受体基因外显子3,框架和5 '终止密码子(谢勒et al ., 2006)。的遗传背景DOPeGFP小鼠C57BL / 6 j: 129 svpas (50%: 50%)。DOP-floxed (Oprd1fl / fl)老鼠杂交Nav1.8-Cre生成条件基因敲除小鼠(cKO)计划在初级痛觉神经元(Nav1.8-Cre×Oprd1fl / fl或DOPcKO)如前所报道(Gaveriaux-Ruff et al ., 2011)。的遗传背景条件夹住淘汰赛老鼠和液氧控制C57BL / 6 j: 129 svpas (62.5%: 37.5%)。这些老鼠在ICS动物饲养设施,Illkirch,法国,请提供公关。克莱尔Gaveriaux-Ruff。岁的成年雄性和雌性小鼠6 20周,体重20-32 g为雄性雌性和20-38 g。动物从独立群体分布在最好的情况下提供类似的大小为每个性别和治疗组(n= 88 DOPeGFP老鼠,n= 22 DOPcKO老鼠,n= 20 DOP-floxed老鼠)。每笼老鼠群居饲养2 - 5,在标准实验室条件下(12 h黑/光周期,灯在7点)温度(21±1°C)和湿度(55±10%)控制房间和食物和水随意。所有实验都通过“拉西'Ethique en Matiere d 'Experimentation Animale de斯特拉斯堡”(授权号码201503041113547APAFIS # 300 .02点),在协议与欧盟指令2010/63 /欧盟动物实验。

神经性疼痛模型

引起的神经性疼痛是成套右侧坐骨神经的主要分支(如前所述)(Benbouzid et al ., 2008 c;Yalcin et al ., 2014)。在手术之前,老鼠与氯胺酮麻醉(Vibrac,卡罗,法国)/甲苯噻嗪(Rompun,基尔,德国;100/10毫克/公斤,i.p)。常见分支的坐骨神经暴露,和袖口PE-20聚乙烯管(哈佛装置,Les乌里,法国)标准化的长度(2毫米)单方面周围插入(袖口组)。Sham-operated动物接受相同的手术没有袖口植入(虚假的组)。动物被放置在左侧在干净家里笼后立即手术和热灯下保持直到他们醒来。水和食物直接放置在笼子里。外科检查网站每日在接下来的3天,和动物监控异常痛苦的迹象或感染端点协议中定义的伦理委员会的建议。

评估机械触诱发痛

机械触诱发痛测试使用·冯·弗雷细丝和结果表示在g中描述Yalcin et al。(2014)。短暂,校准·冯·弗雷细丝(Bioseb、Vitrolles、法国)应用于足底后爪子,直到他们只是表面弯曲,在一系列的提升力机械阈值。丝测试5次爪子,爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)被定义为两个连续的低纤维三个或三个以上的取款的五个试验观察(Yalcin et al ., 2014)。

治疗程序

治疗β2-adrenergic兴奋剂formoterol手术后4周开始,持续4周。Formoterol(猫。Nr BG0369 Biotrend AG)、瑞士)是由随意访问和唯一来源的流体溶解在饮用水的剂量0.5μg /毫升(相当于0.05毫克/公斤/天)以0.2%的糖精(猫。西格玛奥德里奇Nr S1002,圣路易斯,密苏里州,美国)。实验小组DOPeGFP老鼠包括虚假的集团(n= 36岁,29岁女性和7个男性),袖口集团(n16女性和13名男性)= 29日,和Formoterol集团相应的袖口老鼠Formoterol处理(n= 23日14女性和9名男性)。实验小组计划cKO老鼠包括虚假的集团(n两个女性和四个男性)= 6日,袖口集团(n男性= 5)和Formoterol组相应的袖口老鼠Formoterol处理(n= 11,七个女性和四个男性)。实验组织控制的同胞Oprd1fl / fl(液氧老鼠)包括虚假的集团(n= 7,五个女性和两个男性),袖口集团(n男性= 5)和Formoterol组相应的袖口老鼠Formoterol处理(n= 8,两个女性和六个男性)。虚假的和袖口团体收到控制糖精在饮用水解决方案0.2%。虚假的和先前发表在袖口组相同Ceredig et al。(2018)。

组织准备和免疫组织化学

老鼠与氯胺酮麻醉(Vibrac,卡罗,法国)/甲苯噻嗪(Rompun,基尔,德国;100/10毫克/公斤,i.p。)和灌注intracardially 100毫升的冰冷的(2 - 4°C) 4%多聚甲醛(PFA)磷酸盐缓冲剂0.1米pH值7.4 (PB)。侧(右)和侧(左)L4背根神经节解剖出16种腰,你找找90 - 120分钟在PB PFA 4% 4°C,在4°C cryoprotected 30%蔗糖在PB 24 h,嵌入在10月(最佳切削温度中,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),冷冻,保存在−80°C。(16μm厚)按纵向部分被剪掉了,低温恒温器(Microm Cryo-star HM560),继续漂浮在PB。

免疫组织化学显示了标准协议如前所述Ceredig et al。(2018)。短暂、DRG部分被孵化1 h在室温下(RT)屏蔽解决方案组成的PB渐变为0.2% 20 (PBT;猫。热费希尔科学Nr 85114年,沃尔瑟姆,妈,美国),3%正常山羊血清(表达载体,佩斯利,英国)和3%的驴在需要时血清(D9663 Sigma-Aldrich,圣昆汀Fallavier法国)。一夜之间被孵化的部分在4°C与适当的屏蔽解决方案主要抗体:多克隆兔anti-GFP(猫。Nr - 11122,表达载体,稀释1:1,000)、羊多克隆anti-CGRP(猫。Abcam Nr。阿瑟22560年,稀释下)。三个洗之前用PBT进行部分孵化2 h RT在昏暗的灯光下,山羊anti-rabbit免疫球蛋白共轭Alexa萤石488(猫。Nr - 11012,分子探针,稀释下)和驴anti-sheep免疫球蛋白共轭Alexa萤石594(猫。Nr - 11016,分子探针,稀释下)。 Following three washes with PBT, the sections were mounted with MOWIOL (Calbiochem, Darmstadt, Germany) and 4,6-diamino-phenylindole (DAPI; Roche Diagnostic, Mannheim, Germany; 0.5 μg/ml).

足底皮肤的后爪(拦路贼和无毛的皮肤,长1厘米)被固定在4°C 4% PFA解一夜之间,cryoprotected一夜之间以30%蔗糖在PB,嵌入在10月,冷冻,保存在−80°C。纵向截面(50μm厚度)被削减,低温恒温器(MicromCryo-star HM560),继续漂浮在PB。爪子组织样本处理可视化初级传入终端在皮肤上的后爪如前所述Ceredig et al。(2018)。简单地说,部分接受0.3% H₂O₂与连续浴在乙醇制成冻干脱水,洗3次PBS和孵化屏蔽解决方案(PBS, 0.5% Triton X100 (PBST)与3%正常山羊血清或正常的驴血清)在rt,隔夜孵化后30分钟在4°C屏蔽解决方案,部分是主要抗体孵育anti-GFP(1:1,000)或anti-CGRP(下)抗体。PBST的部分被洗了三次,分别为2 h RT孵化与anti-rabbit或抗体生物素化的二次抗体(1:400)PBST又洗了三次与染色前PBST向量SG (sk - 4700, VectorLab)。装有MOWIOL样本。

图像采集和分析

图像采集和分析进行了如前所述Ceredig et al。(2018)。简单、图像与徕卡获得TCS SP5共焦显微镜使用20×干客观(数值孔径:0.7),40×决议通过数码变焦的因素。共焦收购在连续模式(单一激发光束:405、488和568海里)被用于标记co-localization避免潜在的不同荧光排放之间的串扰。图像获取与LCS(莱卡)软件使用随机选择部分。

的ImageJ^®软件细胞计数器(大约15两部分每条件和动物)被用来计算屏幕手动给定荧光标记神经元表达和盲目。阈值应用于荧光检测。仅从L4-L6神经元可见核被认为是诊断相关。细胞表达一个给定的标记和eGFP荧光分别进行了分析。在分析中,我们记录了所有代表性的区域为每个标记细胞概要文件。没有区别在神经元的分布数量之间的男性和女性的老鼠和数据集中进行后续分析。

DOPeGFP亚细胞分布表示为一个膜相关的比率与胞质荧光密度确定如前所述(erb et al ., 2016)。收购使用63×(NA: 1.4)石油目标进行确定DOPeGFP亚细胞分布。短暂的、量化的内化了8位上使用ImageJ软件原始共焦图像神经元随机抽样。核荧光被用来定义背景水平(无阈值应用)。胞质荧光强度减去从全细胞荧光强度来获得表面荧光强度。表面荧光强度值/每单位(像素)获得密度。膜相关的比率(Df中介)和胞质(Df阶段)荧光密度计算跨神经元进行规范化数据。值为1.0的结果相同密度的DOPeGFP在细胞表面,在细胞质中。

游离神经末梢在皮肤无毛的部分可视化使用20×干客观(尼康Eclipse 80 i)。指望蒙蔽样本进行手动屏幕上使用Neurolucida软件(V.10 MBF生物科学)每个动物至少有四个随机选择的部分。密度得到的数量除以传入穿越真皮不含二级分支,总长度的部分(Lauria et al ., 2005)。

统计分析

行为分析的冯·弗雷测试都使用Statistica v12 (StatSoft、法国)和Graph-Pad棱镜v7 (GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。佩恩表的编制者的变化,术后时间的函数(内部因素)和实验处理(因素)之间进行了分析使用双向方差分析和重复措施(双向rANOVA)分析图基HSD紧随其后事后测试。基线佩恩表的编制者在男性和女性使用两个示例学生的比较t以及。确切的p值低于0.0001没有提供行为数据(圣地亚哥Graph-Pad棱镜v7中,GraphPad CA,美国)。的横截面积测量,数据集中每个治疗组为每一个标记(CGRP怎样或eGFP)。在所有组、横断面领域被发现不是正态分布(p -值总是小于10⁻⁸使用R Shapiro-Wilk测试)(R核心团队,2017年)。的高斯函数因此适应细胞大小的相对累积分布曲线,利用非线性最小二乘曲线拟合(nls2、nlstools和pracma R包)。数据被表示为累积分布允许直接测定的均值和标准误差通过调整实验点重新分配的功能。我们比较不同群体使用非参数的累计分布Kolmogorov-Smirnov测试(R)。治疗影响DOPeGFP +箱进行了分析使用多个t测试。DOPeGFP亚细胞分布的统计分析和皮肤纤维进行了单向方差分析塔基HSD紧随其后事后测试(圣地亚哥Graph-Pad棱镜v7中,GraphPad CA,美国)。Co-localization DOPeGFP与神经元标记神经元体积小(< 300μm²)使用非参数分析了克鲁斯卡尔-沃利斯检验Dunn的紧随其后事后测试。

结果

慢性Formoterol需要夹住受体表达Nav1.8 +神经元Anti-allodynic行动

我们之前确定的机械触诱发痛被cuff-implantation诱导,开发直接手术后,维护直到12 - 14周(Yalcin et al ., 2011)。同时,夹住受体表达Nav1.8 +神经元被证明是强制性的anti-allodynic行动抗抑郁度洛西汀的袖口模型(Ceredig et al ., 2018)。自夹住受体也需要长期治疗的anti-allodynic效果β2受体激动剂克仑特罗(Yalcin et al ., 2010),我们调查是否计划的具体删除受体在初级传入纤维(外围DRG神经元)表达Nav1.8电压门控钠通道(DOPcKO;Gaveriaux-Ruff et al ., 2011)也被废除antiallodynicβ2-adrenergic受体激动剂的作用。

冯·弗雷测试显示,坐骨神经成套导致单边机械触诱发痛DOPcKO和控制液氧(夹住fl / fl)动物(图1 a, B)如前所报道(Ceredig et al ., 2018)。袖口DOPcKO老鼠没有饮用水中formoterol治疗后的恢复(50μg /毫升;双向rANOVA、交互处理×时间F_(12114)= 11.31,p< 0.0001,影响的时间F₍₆₁₁₄₎= 33.37,p< 0.0001,治疗的效果F₍₁₉₎= 112.8,p< 0.0001,图基HSD事后测试:formoterol治疗28天到39和虚假的,p在每个时间点< 0.0001;图1一个),而控制计划fl / fl袖口动物对待formoterol回到基线值在39天,11天后formoterol管理局(双向rANOVA交互处理×时间F_(12119)= 8.386,p< 0.0001,影响的时间F₍₆₁₁₉₎= 18.56,p< 0.0001,治疗的效果F₍₂₁₁₉₎= 84.47,p< 0.0001,图基HSD事后测试:formoterol治疗与虚假的:p从28到32天,< 0.0001p< 0.01从38岁的33天p在39天= 0.33;图1 b)。结果因此建立夹住Nav1.8阳性神经元受体是强制性的机械触诱发痛缓解慢性治疗β2模仿formoterol。我们因此详细评估的影响慢性formoterol治疗神经元数量表达计划使用DOPeGFP荧光受体敲入鼠标线。

图1

图1。表达delta-opioid(计划)神经元的受体在Nav1.8 +强制口服formoterol anti-allodynic行动。正确的(同侧)后爪机械阈值测试使用·冯·弗雷校准细丝。袖口植入手术后,动物降低了爪子撤军阈值(佩恩表的编制者),显示持续的机械触诱发痛。Formoterol(0.5μg /毫升)或糖精0.2%控制每操作系统开始治疗4周后神经损伤,维持3周。(一)机械阈值的权利(同侧)后爪在夹住cKO老鼠。三个独立的实验数据(每一个包括三个条件)汇集±SEM和表达手段。虚假的(n= 6),袖口(n= 5),袖口formoterol处理(n= 11)。双向rANOVA和图基HSD事后测试:* * * *p< 0.001 formoterol治疗与基线。(B)机械阈值的权利(同侧)后控制液氧老鼠的爪子。三个独立的实验数据(每一个包括三个条件)汇集±SEM和表达手段。虚假的(n= 7),袖口(n= 5),袖口formoterol处理(n= 8)。双向rANOVA和图基HSD事后测试:* * * *p< 0.0001,* *p< 0.01 formoterol治疗39天与基准:p= 0.3284。

慢性Formoterol减轻Cuff-Induced机械触诱发痛DOPeGFP老鼠

我们第一次证实口服的β2 DOPeGFP中的肾上腺素agonist-induced预期anti-allodynic效应敲入鼠标线。正如之前报道的(Ceredig et al ., 2018),男性基线相比机械阈值明显高于女性(5.4±0.4 g对男性和对女性3.5±0.2克,学生的t以及对于基线值:t= 7.18p< 0.0001)和袖口植入引起同侧的机械触诱发痛持续了至少8周(灌注)性(双向rANOVA;治疗男性互动×时间F_(16208)= 15.15,p< 0.0001;治疗,效果F₍₂₆₎= 318.5,p< 0.0001从21到57天袖口和虚假的;治疗女性互动×时间F_(16448)= 11.02,p< 0.0001,治疗的效果F₍₅₆₎= 236,p< 0.0001从21到57天袖口和虚假的;图2 a, B)。我们没有发现任何虚假的手术后疼痛的阈值的变化或袖口侧后爪子的动物(数据没有显示)。

图2

图2。慢性formoterol治疗每个操作系统缓解机械触诱发痛DOPeGFP敲入小鼠。正确的(同侧)后爪机械阈值测试在男性和女性使用·冯·弗雷校准细丝DOPeGFP KI老鼠。男性(一)和女性(B)降低了佩恩表的编制者袖口植入手术后,即,持续的机械触诱发痛。4周后神经损伤,formoterol(0.5μg /毫升)或糖精0.2%控制每操作系统治疗开始,维持4周。三个独立的实验数据(每一个包括三个条件)汇集±SEM和表达手段。虚假的(n男性和女性29日)= 7,袖口(n= 13名男性和16名女性),袖口formoterol处理(n= 9雄性和雌性14日)。双向rANOVA和图基HSD事后测试:*p< 0.05,* * *p< 0.001,* * * *p< 0.0001和虚假的。^{# # # #}p< 0.001和袖口。

Formoterol治疗饮用水(50μg /毫升)缓解机械触诱发痛一天51(23天之后政府)DOPeGFP男性虽然没有完全(双向rANOVA图基HSD事后测试:51天与虚假的:p_(男性)= 0.0009和57天与虚假的:p_(男性)< 0.0001,每天51和57与袖口:p_(男性)< 0.0001;图2一个)。在DOPeGFP雌性,formoterol treatment-induced在51天几乎完全缓解(双向rANOVA图基HSD事后测试:51天与虚假的:p_(女性)= 0.0382)和价值观,是类似于虚假的老鼠在日57(双向rANOVA图基HSD事后测试:57天与虚假的:p_(女性)= 0.3547,每天51和57与袖口:p_(女性)< 0.0001;图2 b)。这次课程是类似于我们以前观察到的,在相同的模型,在男性C57BL6 / J小鼠反复注射ip每天两次(Yalcin et al ., 2010)。

DOPeGFP表达Formoterol-Treated老鼠

然后我们研究了分布的变化DOPeGFP + DRG神经元(图3一)。正如前面建立的(Ceredig et al ., 2018),在袖口DOPeGFP +细胞的累积分布实验团体转向更大的细胞大小值相比虚假的组(图3 b)。神经元的损失DOPeGFP +小横截面(多个领域t测试:袖口与虚假的:p100 - 200μm = 0.03²类别)表示DOPeGFP表达式的损失小和/或介质神经元后8周的神经病变(图3 c)。

图3

图3。DOPeGFP分布骗局,袖口和Formoterol-treated动物。(一)代表共焦荧光DOPeGFP的形象表达神经元的腰背根神经节(DRG)虚假的动物。10μm比例尺。(B)人口分布DOPeGFP +神经在虚假的(3080个神经元,n= 7动物;浅灰色),袖口(3123个神经元,n= 6动物;黑色)和Formoterol(1917个神经元,n= 5动物;暗灰色)组。(C)分类数据块的大小分布DOPeGFP假阳性神经元横断面地区(白色的酒吧),袖口(黑条)和Formoterol(检查酒吧)组。多个t测试:*p= 0.03袖口和假象,*p= 0.01 Formoterol与骗局。

袖口小鼠长期接受formoterol, DOPeGFP +神经的分布数量仍非常相似,袖口条件和明显不同于虚假的集团(KS测试:D= 0.14212,p< 2.2十⁻¹⁶;图3 b)。事实上,小尺寸的百分比神经元相比仍然较低(多个虚假的条件t测试:Formoterol与虚假的:p100 - 200μm = 0.0137²类别;图3 c)。

因为DOPeGFP表达式是减少无髓鞘的肽能的袖口老鼠的数量(图3)和(Ceredig et al ., 2018),我们评估的结果慢性formoterol全球CGRP怎样治疗+人口和CGRP怎样+人口的比例也表达DOPeGFP (图4)。CGRP怎样+神经元对应的累积分布表明,转向更大的单元尺寸值在袖口组不再是目前最小的横断面与formoterol虽然整体治疗后的区域分布仍明显不同于虚假的集团(KS测试:D= 0.090945,p10 = 3.398⁻⁷;图4 b)。然而,累积分布的CGRP怎样+ DOPeGFP +神经元仍类似于袖口条件和明显不同于虚假的条件(KS测试:D= 0.15672,p< 2.2十⁻¹⁶;图4 c)和小型神经元的比例(< 300μm²;剩余6.7±0.8%)类似于袖口条件(4.3±0.5%)和低比虚假的条件(16.5±1.3%;千瓦测试:p< 0.0001,邓恩事后测试骗局和袖口p= 0.0007,虚假与Formoterolp= 0.0352,袖口与Formoterolp> 0.9999;图4 d)。因此,慢性治疗formoterol似乎没有恢复DOPeGFP +神经元的损失引起的神经性条件在小肽能的神经元。

图4

图4。影响formoterol治疗DOPeGFP colocalization CGRP怎样+数量。(一)与神经元标记代表荧光显微图显示DOPeGFP co-localization降钙素相关基因肽(CGRP怎样;箭头所示的红色)覆盖图。核与DAPI染色(蓝色)。10μm比例尺。(B)CGRP怎样分配+在虚假的神经元数量(3351个神经元,n= 7动物;浅灰色),袖口(1331个神经元,n= 6动物;黑),Formoterol(1311个神经元,n= 5动物;暗灰色)。(C)人口分布的神经元共同表达DOPeGFP和CGRP怎样在虚假的(803个神经元,n= 7动物;浅灰色),袖口(438个神经元,n= 6动物;黑色)和Formoterol(294个神经元,n= 5动物;暗灰色)组。(D)在神经元细胞的比例共同表达DOPeGFP和CGRP怎样< 300μm领域²在虚假的(n= 6;●),袖口(n= 6;▪)或Formoterol (n= 5;▴)动物。值表示为±SEM。克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的post以及:*p< 0.05,* * *p< 0.001和虚假的。

DOPeGFP表达式Formoterol-Treated质膜的老鼠

增强计划表达在质膜以前描述的神经性条件(Gendron et al ., 2015)。这个观察被证实在袖口模型显示与细胞表面相关的比率荧光相比显著增加相关的荧光的细胞内的隔间DOPeGFP +神经元(图5)也曾报道(Ceredig et al ., 2018)。Formoterol治疗膜相关荧光值下降,甚至低于神经元的虚假的条件(虚假的1.16±0.03,袖口:1.35±0.04,0.94±0.05 Formoterol,单向方差分析F₍₈₉= 28.8p< 0.0001图基HSD事后测试袖口和虚假的p= 0.002,袖口与Formoterolp< 0.0001,虚假与Formoterolp= 0.0002;图5 b)。这表明formoterol抑制治疗计划的增加表面受体表达在神经性老鼠。

图5

图5。在老鼠Formoterol-treated DOPeGFP表达在细胞表面。(一)代表荧光显微图DOPeGFP-positive神经元的骗局,袖口和袖动物formoterol对待。10μm比例尺。(B)DOPeGFP亚细胞分布在神经性条件和增加减少formoterol治疗后相比,骗局。数据表示为±SEM手段(虚假的:n= 32细胞从四个动物,袖口:n= 30细胞三种动物,Formoterol:n= 30从三个动物细胞)。单向方差分析和图基HSD事后测试:* *p< 0.01,* * *p< 0.001和虚假的,^{# # # #}p< 0.0001和袖口,p> 0.5 Formoterol与袖口。

CGRP怎样和DOPeGFP表达Formoterol治疗皮肤的老鼠

CGRP怎样减少+ intra-epidermal神经纤维(IENF)纤维长度和密度,以及减少DOPeGFP + IENF密度,据报道8周后袖口手术(Nascimento et al ., 2015;Ceredig et al ., 2018)。我们因此评估formoterol治疗是否影响CGRP怎样+和DOPeGFP + IENFs (图6)。CGRP怎样的密度的无毛皮肤+ IENFs铐老鼠的后爪处理formoterol保持在水平与袖口集团(单向方差分析F₍₈₎= 49.15,p< 0.0001;图基HSD事后测试骗局和袖口p< 0.0001,虚假与Formoterolp< 0.0001,袖口与Formoterolp= 0.771;图6 b)。DOPeGFP + IENFs较高的密度formoterol对待动物相比袖口组相比,但仍显著降低虚假的条件(单向方差分析F₍₉₎= 371,p< 0.0001;图基HSD事后测试骗局和袖口p< 0.0001,虚假与Formoterolp< 0.0001,袖口与Formoterolp= 0.0008 (图6 c)]。作为一个整体,慢性formoterol治疗没有恢复CGRP怎样+表达和诱导IENFs DOPeGFP表达的部分恢复。

图6

图6。CGRP怎样+密度和DOPeGFP +免费皮肤的神经末梢。代表的显微照片(一)CGRP怎样或DOPeGFP intra-epidermal神经纤维(IENF)标签在皮肤上的骗局,袖口和袖动物对待formoterol(黑色箭头)。10μm比例尺。(B)CGRP怎样+免费的密度无毛皮肤的神经末梢的后爪在袖口减少动物和袖口formoterol对待动物。数据表示为±SEM手段,n= 4老鼠骗局和袖口nFormoterol = 3。单向方差分析和图基HSD事后测试:* * * *p< 0.0001和虚假的。(C)DOPeGFP +免费的密度无毛皮肤的神经末梢的后爪在袖口动物减少,只在袖口部分恢复动物对待formoterol而虚假的。数据表示为±SEM手段,n老鼠= 4 /条件。单向方差分析和图基HSD事后测试:* * * *p< 0.0001和骗局,^{# # #}p< 0.001和袖口。

讨论

我们第一次显示,口服的β2肾上腺素能受体激动剂formoterol和腹腔内注射(一样有效Yalcin et al ., 2010袖口模型)来减轻机械触诱发痛的神经病变。然后我们确定外围夹住受体作为antiallodynic效应和强制性决定的影响慢性formoterol夹住受体的表达在腰椎drg和皮肤IENFs。

几项研究指出,夹住受体的作用,和更特别的外围夹住受体存在于Nav1.8 +神经元,抵消机械触诱发痛在坐骨神经结扎引起的神经性条件(纳达尔et al ., 2006;Gaveriaux-Ruff et al ., 2011;Nozaki et al ., 2012)。以前的工作由集团证实慢性三环抗抑郁药和去甲肾上腺素重摄取抑制剂治疗的antiallodynic行动需要计划和β2肾上腺素能受体(Yalcin et al ., 2010;Choucair-Jaafar et al ., 2014;克雷默et al ., 2018)。系统性管理夹住对手naltrindole还封锁了antiallodynic行动的长期管理β2肾上腺素能受体激动剂(Yalcin et al ., 2010;Choucair-Jaafar et al ., 2014)。SNRI度洛西汀的,外围夹住受体表达Nav1.8 +神经元被强制antiallodynic效应没有观察到的复苏计划cKO的鼠标线边缘夹住受体选择性地切除在神经元表达Nav1.8钠离子通道(Ceredig et al ., 2018)。外围夹住在这里,我们表明,受体表达Nav1.8 +神经元也强制β2-adrenergic兴奋剂formoterol减轻机械触诱发痛。因此,我们的研究结果证实外围夹住受体,可能位于C痛觉受器,必要的有效antiallodynic两个长期治疗的效果。他们还表明,夹住受体表达SNRIs去调制的组成部分。

在我们以前的工作,我们在DRG神经元数量变化特征的神经性疾病导致坐骨神经成套(Ceredig et al ., 2018)。我们的主要研究结果强调了减少体积小肽能的神经元的比例(≤300μm²袖口)和IENFs表达DOPeGFP 8周后手术以及增加DOPeGFP表达式在质膜(Ceredig et al ., 2018),这表明这些变化可能有助于控制机械痛觉过敏。在这里,我们表明,慢性formoterol管理提升部分复苏DOPeGFP表达自由皮肤神经末梢而不是小CGRP怎样+ drg神经元。这与高DOPeGFP表达式中发现小无髓鞘的肽能的神经元(≤300μm²)在慢性度洛西丁管理。这种差异的原因是未知的,但它可以对应于一种次优的formoterol剂量的使用还建议的剂量反应曲线使用腹腔内注射执行(Yalcin et al ., 2010)。这的确是不太可能取决于的血清素激活的组件SNRI行动由于选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂没有减轻机械触诱发痛(Benbouzid et al ., 2008 a)。然而,我们的研究结果证实,夹住表达神经终端,可能无髓鞘的周围轴突的C mechanonociceptors (Brederson和本田,2015年)出现机械敏感性的主要决定因素,可能构成价值的神经性状态的标志。

慢性疼痛是显示增加夹住的质膜受体易位drg(综述Gendron et al ., 2015),我们的数据显示一个类似的增加在袖口DOPeGFP表面表达模型。慢性formoterol与低夹住在质膜受体的表达,甚至在值中观察到虚假的条件下。DOPeGFP低表达在表面也观察到小鼠长期接受度洛西汀(Ceredig et al ., 2018),因此,似乎是一个常见的机制两个antiallodynic抵消机械治疗过敏症。底层机制,然而,仍然是难以捉摸的。提出了计划和β2肾上腺素能受体形成heteromers基于研究执行co-transfected细胞(约旦et al ., 2001)。然而,β2肾上腺素能受体表达在卫星drg细胞(Bohren et al ., 2013)而计划依赖镇痛是介导神经元水平(Gaveriaux-Ruff et al ., 2011;Ceredig et al ., 2018;这项工作)和独立于小胶质激活(米卡et al ., 2014这就排除了直接分子相互作用。formoterol和度洛西汀的延迟antiallodynic行动表明,它需要细胞的适应性。病变周围去纤维与胍乙啶、毒素,不穿过血脑屏障废除了antiallodynic行动度洛西汀(克雷默et al ., 2018)支持共同参与外围β2肾上腺素能受体。Formoterol (Bohren et al ., 2013)以及抗抑郁药(克雷默et al ., 2018)中和TNFα的增加与神经性疼痛和胶质NFκB-TNFα通路的活性,使之抑制促炎细胞因子调控的重要生产(梁和卡希尔,2010)。然而,这能够具有抗神经炎性反应行动也是共享的类,不需要阿片受体antiallodynic行动(克雷默et al ., 2016 b)。这个相当支持的视图能够具有抗神经炎性反应效果和夹住表达式的调制和活动并不直接相关。

有一些线索DOP-dependent机制调解anti-allodynic formoterol或SNRI慢性治疗后行动。当前数据指向一个间接影响通过增加内源性阿片肽释放原生和适应免疫系统,它可以激活神经元阿片受体减轻机械触诱发痛(粘合剂et al ., 2004;侯赛因et al ., 2016)。的确,去发芽顺向神经损伤会激活β2-adrenoceptors表达的免疫细胞,促进脑啡肽的释放,dynorphin和β-endorphin由这些细胞(粘合剂et al ., 2004;侯赛因et al ., 2016;帕奈尔et al ., 2016)。同样,肽也存在于皮肤(Slominski et al ., 2011)。此外,交感神经纤维发芽是发生在皮肤的袖口模型(Nascimento et al ., 2015),位于接近细胞表达β2肾上腺素能受体和β-endorphin发炎爪子组织提供一种方式来激活不仅拖把还夹住受体(粘合剂et al ., 2004)。夹住受体的激活可能,反过来,导致疼痛减少Nav1.8频道活动通过p38增殖抑制蛋白激酶作为Nav1.7渠道在老鼠模型中描述糖尿病神经病变(将et al ., 2008)。

总之,我们的工作证实,夹住受体表达Nav1.8 + anti-allodynic行动的神经元是强制性的长期治疗β2肾上腺素能受体激动剂formoterol。还显示,慢性formoterol部分逆转的损失外围夹住受体在皮肤和中和增强夹住表达式在质膜上。我们的研究从而增加了现有文献指出潜在的兴趣重新定位β2肾上腺素能受体激动剂治疗神经性疼痛。

数据可用性声明

图像和原始数据将根据客户要求提供相应的作者。

道德声明

所有的实验都是批准的“拉西'Ethique en Matiere d 'Experimentation Animale de斯特拉斯堡”[授权号码201503041113547 (APAFIS # 300)。02)和在协议与欧盟指令2010/63 /欧盟动物实验。

作者的贡献

RC、IY CG-R, MB, ES, DM设计实验。RC、FP、SD、UA、PH值,IY, DM进行实验。RC, UA、FP和DM分析数据。RC、IY CG-R、MB和DM写的手稿。

资金

这项工作是由中心支持国家de la任职(CNRS),斯特拉斯堡大学(斯特拉斯堡大学)和国家卫生研究所et de la医学(INSERM;合同UPR3212、UMS3415 UMR7104和U964)和由欧盟第七框架计划fp7 -健康- 2013创新之下格兰特(1602919)。RC由Ministere de l 'Enseignement特级et de la矫揉造作的et de l 'Innovation和倒拉医学基金会(DPA20140629804)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们要感谢Chronobiotron动物设施(口头语3415 CNRS),和成像平台的des神经科学研究所Cellulaires et Integratives (UPS 3156 CNRS)为他们的援助。我们也感谢研究所de la倩碧de la对牛群(Illkirch、法国)动物设施,安妮长袍和大卫·赖斯在IGBMC育种和基因分型的Nav1.8 +夹住cKO鼠标线。他们愿意承认博士jean - luc Rodeau仪器帮助统计分析,耐莉波姆教授,教授雷米单叶和Sylvain Hugel博士为有价值的科学讨论,和伊丽莎白Waltisperger优秀技术贡献。

缩写

方差分析,方差分析;CGRP怎样,降钙素相关基因肽;cKO条件敲除;夹住,delta-opioid;DRG、背根神经节;eGFP增强型绿色荧光蛋白;IENF,表皮内的神经纤维;KS, Kolmogorov-Smirnov;千瓦,克鲁斯卡尔-沃利斯;佩恩表的编制者,爪子撤军阈值; SNRI, serotonin noradrenaline reuptake inhibitor.

引用

Benbouzid, M。,Choucair-Jaafar, N。Yalcin,我。,Waltisperger, E., Muller, A., Freund-Mercier, M. J., et al. (2008a). Chronic, but not acute, tricyclic antidepressant treatment alleviates neuropathic allodynia after sciatic nerve cuffing in mice.欧元。j .疼痛12日,1008 - 1017。doi: 10.1016 / j.ejpain.2008.01.010