米德酸抑制retinol-induced刺激性接触性皮炎通过过氧物酶体proliferator-activated受体α

介绍

视黄醇通常是局部使用在各种皮肤病如牛皮癣和鱼鳞癣,被广泛用于护肤品改善皮肤衰老和治疗痤疮,皱纹和疣(Kafi et al ., 2007;李et al ., 2009;艾尔Tanoury et Al ., 2013;Sadick et al ., 2019;西曼斯基et al ., 2020)。然而,许多人接受局部类维生素a如视黄醇、视黄酸,和他们的衍生品开发一个刺激性接触性皮炎(ICD),称为retinoid-induced皮炎,表现为红斑、缩放、干燥、燃烧和瘙痒。这些不受欢迎的副作用导致一些人停止治疗(大卫et al ., 1988;金正日et al ., 2003;布坎南和吉尔曼,2016年)。ICD通常被描述为一种多因子的紊乱,发生直接回应化学性质如碱性或酸性。然而,retinoid-induced ICD背后的机制被认为是复杂的,不同于其他类型的刺激:类维生素a是由受体的刺激诱导,包括视黄酸受体(rar)和类维生素a X受体(rxr) (Matsunaga et al ., 2012;西曼斯基et al ., 2020)。

在retinoid-induced皮炎,heparin-binding表皮生长因子生长因子(HB-EGF)是一个主要在角质细胞通过旁分泌因子合成RAR和RXR激活。它介导上皮增生,这是一个特征类维生素a皮炎(斯托尔和老人,1998年)。标记HB-EGF对维甲酸诱导的基因表达是治疗人类和小鼠的皮肤,还有这个表达式之间的正相关和角化细胞的增生(肖et al ., 1999;Yoshimura et al ., 2003)。此外,无毛小鼠的研究表明,水平的提高HB-EGF和表皮增生更突出的特性在retinol-induced ICD non-receptor-mediated ICD诱导苯扎氯铵(李et al ., 2010)。因此,表皮增生和高架HB-EGF retinoid-induced皮炎的公认为主要特征。

膳食脂肪酸影响免疫功能,包括炎症和过敏反应;人们普遍认为来自ω- 3多不饱和脂肪酸的代谢产物,它有一个双键在第三位置的甲基,作为功能性抗炎介质解决炎症反应(Cucchi et al ., 2019)。我们之前报道,代谢物的ω- 3脂肪酸二十碳五烯酸,如12-hydroxyeicosapentaenoic酸,15-hydroxyeicosapentaenoic酸,17日18-epoxyeicosatetraenoic酸,和14-hydroxyeicosapentaenoic酸,显示抗炎和抗过敏活性,或者两者兼有,通过各种各样的机制(Kunisawa et al ., 2015;Nagatake et al ., 2018;Sawane et al ., 2019;Saika et al ., 2021)。几种脂肪酸代谢产物来自欧米珈- 3脂肪酸已成为有前途的候选人为治疗各种炎症性疾病(Herrera Vielma et al ., 2021)。此外,欧米茄9 mono的生物功能和多不饱和脂肪酸,如油酸、米德酸,和反油酸,最近收到了广泛的关注,以应对新兴研究和发现揭示其生物的好处(法拉克和迦得,2022)。米德酸(5 8 11-eicosatrienoic酸)是一个功能多不饱和欧米茄9脂肪酸来自油酸(格拉姆利克et al ., 2019)。Mead酸抑制乳腺致癌作用的开发和进展通过抑制癌细胞的扩散,包括人类乳腺癌细胞系MCF-7和KPL-1 (木下光男et al ., 2014)。在炎性疾病,与米德酸补充对indomethacin-induced肠道病变治疗效果通过抑制白三烯B₄(LTB₄)合成(吉田et al ., 2003)。我们发现以前的腹腔内注射米德酸改善皮肤炎症的小鼠模型dinitrofluorobenzene (DNFB)全身过敏性接触过敏通过抑制中性粒细胞迁移网站的炎症和抑制血管通透性的增加(女子et al ., 2019)。此外,我们表明,米德酸抑制中性粒细胞的二级涌入压制他们的LTB₄生产(女子et al ., 2019)。然而,详细的分子机制和功能受体负责这些抗炎作用仍然是未知的。

在这里,我们使用retinol-induced ICD小鼠模型研究的潜在角色mead酸抑制类维生素a治疗的副作用,我们证实了米德的监管活动酸角化细胞。我们发现,米德酸改善皮肤炎症retinol-induced ICD通过过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) -α-mediated通路通过抑制角化细胞异常角化细胞增生和中性粒细胞化学引诱物的基因表达。此外,我们发现,米德酸抑制p38增殖的磷酸化蛋白激酶(MAPK),这是一个重要的信号通路,增强了视黄醇引起的角化细胞异常。

材料和方法

老鼠

在实验之前,雌性BALB / c小鼠(6 - 7周)从日本购买SLC(日本滨松)和维护specific-pathogen-free动物设施NIBIOHN(美国国立卫生研究院生物医学创新,和营养、茨城、大阪,日本)。小鼠安乐死与异氟烷麻醉下颈椎脱位(AbbVie,北芝加哥,伊利诺斯州,美国)。所有的实验按照指南的动物保健和使用委员会和动物实验的伦理委员会NIBIOHN。

Retinol-induced ICD小鼠模型

Retinol-induced ICD诱导如前所述,一些修改(李et al ., 2010;金正日et al ., 2012)。短暂,两只耳朵的老鼠受到局部连续4天每天一次10µL 0.05% (w / v) all-trans-retinol (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)溶解在4:3:3二甲基乙酰胺(Sigma-Aldrich)、丙酮(Nacalai Tesque,京都,日本),和乙醇(Nacalai Tesque)。米德酸(10µg / 10μL、开曼化工、安阿伯市密歇根,美国),油酸(10µg / 10μL、开曼化工),或车辆控制3:1乙醇磷酸盐(PBS)局部使用两边的耳朵45分钟后每一个炎症的侮辱。耳朵厚度评估千分尺MDC-25MJ 293 - 230 (Mitsutoyo、川崎、日本)。

在实验中使用受体拮抗剂,GSK0660(100μg / 10μL Sigma-Aldrich) GW6471(100μg / 10μL Sigma-Aldrich),或车辆控制1:1二甲亚砜(DMSO, Nacalai Tesque)和50% (v / v)乙醇在PBS局部使用两边的耳朵。三十分钟与拮抗剂治疗后,米德酸或车辆控制局部使用,45分钟后视黄醇是局部使用上面描述的剂量率。这些治疗序列进行每天一次连续4天。在实验中使用激酶抑制剂,SB202190 (Sigma-Aldrich),或U1026 (Sigma-Aldrich),或SP600125 (Sigma-Aldrich),或车辆控制1:1 DMSO溶液和50% (v / v)乙醇在PBS应用于20 mM / 10μL局部两边的耳朵视黄醇的45分钟后,局部应用上述剂量率。这些治疗序列继续每天一次连续4天。耳肿胀(Δµm)计算(Ear厚度[µm]表示天)——(Ear厚度(µm)第一个视黄醇应用程序之前)。

细胞隔离和流仪分析

细胞隔离和流式细胞术进行如前所述(Nagatake et al ., 2018)。总之,小鼠耳样本消化,搅拌,60或90分钟在37°C 2毫克/毫升胶原酶(Wako纯化学物质,日本大阪)RPMI 1640介质(Sigma-Aldrich)含有2% (v / v)新生小牛血清(Equitech-Bio Kerrville,德克萨斯州,美国)。我们把样品和胶原酶90分钟为60分钟,分析免疫细胞和角化细胞。70 -µm细胞细胞悬浮液过滤过滤器(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)和FITC染色(异硫氰酸荧光素)-anti-mouse-Ly6G抗体(BioLegend,圣地亚哥,加州,美国;1:10 0),APC (allophycocyanin) -Cy7 anti-CD11b抗体(BioLegend;1:10 0)、PE(藻红蛋白)-anti-CD31抗体(BD生物科学;1:10 0),FITC-anti-CD34抗体(BD生物科学;1:10 0),APC-anti-CD49f抗体(BioLegend;1:10 0),pe -反- ki - 67抗体(BioLegend;1:10 0),或者BV(亮紫)421 -反- cd45抗体(BioLegend; 1:100). Murine keratinocytes were isolated as the CD45^{- - - - - -}CD31^{- - - - - -}CD34^{- - - - - -}CD49f⁺细胞分数,如前所述(Saika et al ., 2021)。样品进行了分析通过使用MACSQuant (Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)或FACSAria (BD生物科学)细胞分选仪,FACSAria和细胞被孤立。数据分析使用Flowjo 9.9(树明星,亚什兰,俄勒冈州,美国)。

组织学分析

如前所述执行(组织学分析Nagatake et al ., 2018)。实验的老鼠牺牲了4天,之后耳朵立即收集的样本。冷冻组织切片(6μm厚)是由低温恒温器(徕卡,位于德国,CM3050S)和用于苏木精和伊红染色和immunohistological分析。下面的抗体被用于immunohistological分析:anti-cytokeratin 10 (K10)抗体(Abcam,剑桥,英国),FITC-anti-Ly6G抗体,pe -反- ki - 67抗体,APC-anti-CD49f抗体。房颤(Alexa-Fluor) 488 -反兔免疫球蛋白(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)被用作二次抗体检测K10。细胞核染色有4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, AAT Bioquest,桑尼维尔加利福尼亚,美国)。组织部分荧光显微镜下检查(模型bz - 9000,日本基恩士,大阪,日本)。染色区域的图像进行了分析通过使用分析仪软件BZ-X700(日本基恩士)。

记者化验

靛蓝生物科学(美国宾夕法尼亚州州立大学)记者分析系统是用于测定荧光素酶的记者。脂肪酸的能力进行测试,以激活核受体通过人类PPARαPPARβ记者分析系统(靛蓝生物科学)中描述的程序包。总之,记者细胞表达Gal4 dna结合域融合组成的混合受体的配体结合域特定的核受体,萤火虫荧光素酶报告基因,与记者分析系统提供。几个浓度(0.3,3,30µM)米德酸和油酸用于试验。油酸是用作控制mead酸。经过24小时的潜伏期(37°C公司5%₂)这些混合物测试化合物的核受体的活动被量化为相对光单位通过测量光的发射与微型板块光度计(下午X2,珀金埃尔默,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。

细胞培养

HaCaT细胞(人类角质细胞永生化)从CLS细胞系获得服务(德国,德国)(Boukamp et al ., 1988和培养如前所述Saika et al ., 2021)。培养HaCaT细胞浓度的5×10被播种⁵细胞/ 10毫升杜尔贝科修改鹰的介质高葡萄糖(Sigma-Aldrich)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco)和100 U /毫升与100年青霉素μg /毫升链霉素(Nacalai Tesque)和孵化24小时37°C的5%股份₂。中被替换为杜尔贝科的修改鹰中没有的边后卫,和细胞治疗3µM mead酸或车辆(乙醇)刺激前30分钟HB-EGF (1 ng / mL, PeproTech Cranbury,新泽西,美国)1 h在37°C的5%股份₂。

免疫印迹分析

HaCaT细胞收获300年被刮µL里帕(Radioimmunoprecipitation化验)裂解缓冲(EMD密理博公司,伯灵顿,马萨诸塞州,美国)含有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)鸡尾酒和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士)。样品中的蛋白质被使用量化BCA (bicinchoninic酸)蛋白质化验设备(热费希尔科学)按照指令的工具包。等量的蛋白质分离NuPAGE 4% - -12% Bis-Tris凝胶(热费希尔科学)和转移到聚乙二烯二氟化物膜(EMD密理博公司)。使用的抗体是anti-phospho-p38 MAPK和anti-p38 MAPK多克隆抗体(细胞信号,丹弗斯,马萨诸塞州,美国)和horseradish-peroxidase-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白(BioLegend)。免疫印迹分析了信号利用图像分析仪(ImageQuant拉斯维加斯——4000年,通用电气医疗集团,东京,日本)。

基因表达分析

视黄醇的日常应用程序或工具4天后,耳样本收获XXTuff microvials (BioSpec产品,巴特尔斯维尔,俄克拉何马州,美国),中断使用不锈钢珠(φ48×1、φ32×4,多美,东京,日本)在4800转10 s,然后五次脉冲通过组织均质器(Precellys 24日,贝尔坦公司仪器、Montigny-le-Bretonneux、法国)。组织总RNA分离利用ReliaPrep RNA Miniprep系统(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)。在一些实验中,角化细胞被隔绝的耳朵样本;总RNA制备用Sepazol试剂(Nacalai Tesque)和氯仿(Nacalai Tesque),沉淀与丙胺(Nacalai Tesque),用75% (v / v)乙醇洗净(Nacalai Tesque),和对待DNaseΙ(Promega)。

互补脱氧核糖核酸从样品准备利用cDNA合成装备(表达载体,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)。定量rt - PCR分析LightCycler 480 II PCR平台(罗氏)由于“快速上手”项目必不可少的DNA探针主反应混合PCR(罗氏)或SYBR绿色我主人试剂(罗氏)。

基因表达水平正常化的β-actin基因Actb。以下引物序列用于PCR与鼠标由于“快速上手”项目重要的DNA探针的主人:处于受控向前,5′-gactccagccacactccaac-3´;处于受控相反,5′-tgacagcgcagctcattg-3′;Cxcl2向前,5′-aaaatcatccaaaagatactgaacaa-3′;Cxcl2相反,5′-ctttggttcttccgttgagg-3′;Hbegf向前,5′-tcttcttgtcatcgtgggact-3′;Hbegf相反,cacgcccaacttcactttct-3′;Actb向前,5′-aaggccaaccgtgaaaagat-3′;和Actb相反,5′-gtggtacgaccagaggcatac-3′。以下引物序列用于PCR SYBR绿色我主试剂对人类:DUSP1向前,5′-agtaccccactctacgatcagg-3′;DUSP1相反,5′-gaagcgtgatacgcactgc-3′;DUSP6 shp向前,5′-gaaatggcgatcagcaagacg-3′;DUSP6 shp相反,5′-cgacgactcgtatagctcctg-3′;MKK3向前,5′-gactcccggaccttcatcac-3′;MKK3相反,5′-ggcccagttctgagatggt-3′;MKK4向前,5′-tgcagggtaaacgcaaagca-3′;MKK4相反,5′-ctcctgtaggattgggattcaga-3′;ACTB向前,5′- catgtacgttgctatccaggc-3′;和ACTB相反,5′-ctccttaatgtcacgcacgat 3´。

分析细胞生存能力

细胞生存能力计算通过使用CellTiter 96非放射性细胞增殖试验装备(Promega)按照制造商的指示。简单地说,在1×10 HaCaT细胞被播种⁴细胞/在96 -孔板,然后孵化24小时37°C的5%股份₂。Mead酸或添加油酸,板块含有脂肪酸在每个浓度的300点到300μM孵化1 h或24 h。每次曝光时间后,培养基被移除,和3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化染料溶液添加到每个好。盘子被孵化4 h公司37°C的5%₂,增溶/停止的解决方案是补充道。在OD一夜孵化后,吸光度_570年测量使用iMark标(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国)。乙醇为0.2% (v / v)的培养基被用作车辆控制。可行的细胞的百分比计算通过使用下列公式:(%)=(100%×(样本OD_570年)/(车辆OD的控制_570年)]。

统计分析

数据分析使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较检验,Mann-WhitneyU以及,韦尔奇的t以及(棱镜6,GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。一个p值小于0.05被认为是显著的。

结果

米德酸改善炎症迹象retinol-induced ICD小鼠模型

鉴于局部视黄醇治疗会导致表皮增厚(李et al ., 2010;香港et al ., 2016),我们首先评估炎症迹象retinol-induced ICD的小鼠模型。在这个模型中,外用两边视黄醇连续4天的耳朵和耳朵的厚度(因此肿胀)是衡量天1,2,3,4。耳肿胀时间的方式增加retinol-treated老鼠但不是未经处理的天真的老鼠(图1一个)。此外,在2 - 4天,米德酸处理降低了耳肿胀引起的维生素a治疗相比,车辆(图1一个)。组织学分析vehicle-treated老鼠的耳朵部分显示增加耳朵厚度、表皮层的厚度,细胞渗透到真皮与天真的老鼠相比(图1 b)。然而,这些炎症迹象是改善与米德的耳朵cotreated酸(图1 b)。因为米德酸代谢物来源于油酸,我们还研究了油酸是否也有抗炎活动,但是没有发现抗炎活动(图1 c),这表明retinol-induced ICD的抑制效应是一个特定的米德酸处理的特征。

米德酸抑制中性粒细胞炎症招聘网站

我们之前报道,腹腔内注射米德酸抑制中性粒细胞趋化性炎症的网站在DNFB-induced过敏性接触过敏小鼠模型(女子et al ., 2019)。此外,我们表明,米德酸直接作用于中性粒细胞和抑制中性粒细胞迁移通过抑制其伪足的形成和LTB₄生产。中性粒细胞积聚在真皮报道视黄醇皮炎和DNFB-induced过敏性接触过敏(Varani et al ., 2008)。根据我们之前的研究结果,我们检查是否mead酸调节中性粒细胞retinol-induced ICD。我们在以前的报告显示(女子et al ., 2019),米德酸减少中性粒细胞数量的增加在耳朵发炎的皮肤(图2 a, B)。Immunohistological分析显示,Ly6G的丰度⁺真皮的中性粒细胞降低老鼠的耳朵部分收到米德酸co-treatment (图2 c)。这些结果表明,米德酸抑制中性粒细胞浸润retinol-induced ICD发炎的皮肤。

嗜中性粒细胞的招聘由中性粒细胞化学引诱物的间接机制处于受控和Cxcl2等(Saika et al ., 2021)。角化细胞的主要来源neutrophil-attracting趋化因子(李et al ., 2013诱导炎症后),中性粒细胞数量减少的表达抑制neutrophil-attracting角质细胞趋化因子(Cattani et al ., 2006;Saika et al ., 2021)。因此,我们的表达水平进行了分析处于受控和Cxcl2在角化细胞分离的小鼠耳朵揭示间接neutrophil-regulating mead酸的活性。我们发现增加的表达处于受控和Cxcl2从小鼠耳后皮肤角化细胞排序视黄醇刺激抑制了米德酸co-treatment (图2 d)。因此米德酸抑制中性粒细胞浸润到发炎的皮肤直接机制,正如先前所显示的(女子et al ., 2019),间接的机制。

米德酸抑制表皮增生通过抑制角化细胞增殖

在retinol-induced ICD小鼠模型中,表皮增生和随之而来的地方皮肤厚度增加的增强伴随着角化细胞增殖(Chapellier et al ., 2002)。不仅因为我们发现米德酸调节中性粒细胞功能还角化细胞功能,我们采用组织学分析评价表皮增生的程度。为此,我们对K10彩色耳朵部分,棘层上的表达。而视黄醇治疗K10-positive角质细胞层的厚度增加,与米德co-treatment酸减少这一层的厚度(图3 a, B)。我们下一个评估ki - 67的表达,扩散的一个标志,在角化细胞。当我们隔离CD49f表达式基底角质细胞的表皮干细胞的标志,ki - 67表达细胞主要位于基底角化细胞层的上部天真的老鼠。视黄醇治疗增加这些ki - 67表达细胞的数量,但米德酸co-treatment ki - 67阳性细胞计数下降(图3 c)。流仪分析确认结果表明大量的ki - 67 CD45阳性细胞^{- - - - - -}CD31^{- - - - - -}CD34^{- - - - - -}CD49f⁺角化细胞增加了维生素a治疗,而增加抑制了米德酸co-treatment (图3 d)。这些结果表明,米德酸抑制retinol-induced表皮增生通过抑制角化细胞增殖。

米德酸改善retinol-induced ICD通过PPARα-Mediated通路

识别的功能受体mead酸在抗炎活动retinol-induced ICD,我们下一个执行一个记者分析。PPARs受体为长链的游离脂肪酸和减少相关的炎症条件如皮炎、结肠炎、炎症性肠病,糖尿病,哮喘(Sertznig et al ., 2008;Staumont-Salle et al ., 2008;埃切维里亚et al ., 2016)。因此,我们评估PPAR活动。我们发现,与油酸、米德酸激活PPARα和PPARβ/δ浓度的方式(图4一)。我们证实,米德酸和油酸并不在任何浓度有毒HaCaT细胞从300点到300μM,包括使用的-30 - 0.3μM浓度在体外化验。(S1A补充数据,B)。作为米德酸激活PPARγ几乎相同级别的其他免费的长链脂肪酸(数据未显示),我们旨在评估只有PPARα和PPARβ/δ来确定他们是否作为功能性的米德酸受体retinol-induced ICD的改进。为此,我们评估的影响mead酸各自的局部应用受体拮抗剂米德酸处理之前。我们发现,米德酸的抑制作用与GW6471表皮增生被co-treatment取消(PPARα拮抗剂),但不是GSK0660 (PPARβ/δ拮抗剂)(图4 b, C)。此外,米德酸的调制效应的增加大量的ki - 67阳性细胞角化细胞中被取消了由co-treatment GW6471但不是GSK0660治疗(图4 d)。此外,米德酸预防中性粒细胞浸润的能力通过的控制处于受控和Cxcl2表达在发炎的皮肤角质细胞和嗜中性粒细胞的数量被co-treatment GW6471(取消图4 e, F)。因此,co-treatment与GW6471导致缺乏抑制米德耳肿胀的酸(图4 g)。这些结果表明,米德酸作为配体的受体,PPARαPPARβ/δ,但PPARα是功能性受体的抑制皮肤炎症retinol-induced ICD。

P38 MAPK的主要信号通路诱导的角化细胞异常

视黄醇是增强MAPK途径,发挥重要作用在调节细胞增殖和炎症细胞因子和趋化因子的生产(日圆et al ., 1998;李et al ., 1999;Yu et al ., 2003;李et al ., 2008;Piskunov Rochette-Egly, 2012)。底层信号加速retinoid-induced炎症没有完全理解。因此,通过使用特定抑制剂,我们首先评估主要信号通路,即p38 MAPK、MAPK /细胞外signal-regulated激酶(ERK),或c-Jun伴激酶(物),参与retinol-induced角化细胞异常。

揭示与米德酸的抗炎特性相关的通路,我们评估表皮增生,角化细胞增殖与视黄醇治疗后激酶抑制剂对治疗的反应。我们发现的K10-staining层表皮和沾K10面积减少了治疗SB202190 (p38 MAPK抑制剂)和U0126 (MAPK / ERK抑制剂),但不是通过治疗SP600125(物抑制剂)(图5 a, B)。此外,ki - 67的比例增加积极的角化细胞和表达的增加处于受控和Cxcl2在角化细胞减少只有SB202190治疗(图5 c, D)。符合这一发现,SB202190治疗后视黄醇的应用减少了网站的中性粒细胞炎症(图5 e)。此外,尽管U0126对角质细胞没有影响(即治疗。、细胞增殖和趋化因子生产)(图5 c, D),其应用的数量减少中性粒细胞炎症的网站(图5 e)。反映这些抑制效应在角化细胞和嗜中性粒细胞活动,耳朵肿胀SB202190或U0126降低了治疗,但不是通过SP600125治疗(图5 f)。

从中性粒细胞含有蛋白酶分泌颗粒,引起进一步的伤害,和激活,角化细胞。我们发现的局部应用U0126减少中性粒细胞浸润(图5 e)建议MAPK / ERK通路调节中性粒细胞功能,从而降低角化细胞增生。相反,考虑到局部应用SB202190减少角化细胞增殖和趋化因子等生产活动,我们认为p38 MAPK途径是必不可少的角化细胞异常引起的视黄醇的感应。此外,我们进一步证实,抑制角化细胞异常角化细胞扩散和增强等中性粒细胞化学引诱物的生产,和耳朵肿胀没有观察到co-treatment SB202190和米德酸(补充数据S2A-C)。这些结果表明,p38 MAPK通路是一个候选目标路径由米德酸。

米德酸抑制p38 MAPK在HaCaT细胞活动

利用人类的角化细胞细胞系HaCaT,我们下一个检查是否mead酸抑制p38 MAPK通路。HB-EGF是角化细胞增生的诱导物Hbegf角化细胞上表达增强通过RAR和RXR异质二聚体的激活,激活的视黄醇(Rittie et al ., 2006)。我们发现,米德酸没有减少Hbegf表情视黄醇治疗后角化细胞(补充图S3),这表明米德酸的抑制作用是下游HB-EGF信号。因此,我们接下来分析了通过刺激HaCaT p38的磷酸化细胞与HB-EGF mead酸处理后30分钟。免疫印迹分析表明,p38的表达水平是由米德酸处理没有改变,而phospho-p38的表达明显减少了米德酸处理(图6 a, B)。减少phospho-p38的识别机制,我们专注于两个酶催化磷酸化p38和已知激活p38 MAPK;和蛋白质磷酸酶催化脱磷酸作用,负phospho-p38监管机构(Kidger Keyse, 2016)。我们确认MAPK激酶的表达水平MKK3和MKK4没有受到mead酸处理后视黄醇应用程序(补充图S4)。最大的蛋白磷酸酶专门调节哺乳动物细胞MAPK活性是dual-specificity磷酸酶(DUSP)磷酸酯酶家族,这被称为MAPK磷酸酶(MKPs) (Kidger Keyse, 2016;陈et al ., 2019)。我们下一个评估MKP基因表达与HB-EGF HaCaT细胞刺激后。米德酸调节的表达MKP1/DUSP1和MKP3/DUSP6 shp与汽车相比治疗(图6 c)。这些结果表明,米德酸解决p38磷酸化增强MKP在角化细胞表达,因此减少p38 MAPK激活。

讨论

我们以前报道,米德直接调节中性粒细胞迁移和LTB酸₄生产,因此抑制DNFB-induced过敏性接触过敏(女子et al ., 2019)。这里,我们新显示mead酸的抗炎活性retinol-induced ICD通过监管不仅中性粒细胞功能,而且角化细胞功能通过PPARα-mediated通路。我们进一步发现retinol-induced激活p38 MAPK的感应是至关重要的角化细胞异常,由米德酸表达下调。

脂肪酸代谢产物作为核受体的内源性配体,如rxr PPARs,他们对皮肤炎症产生有益的影响。例如,12-hydroxyeicosapentaenoic酸、二十碳五烯acid-derived代谢物,抑制DNFB-induced过敏性接触过敏通过抑制中性粒细胞化学引诱物的生产处于受控和Cxcl2通过RXRα(Saika et al ., 2021)。此外,αKetoA (10-oxo -独联体-12 -独联体15-octadecadienoic酸),一个α-linolenic酸代谢物由肠道细菌,抑制DNFB-induced过敏性接触过敏通过抑制核易位NF-κB(激活B细胞的核转录因子kappa-light-chain-enhancer)巨噬细胞通过PPARγ(Nagatake et al ., 2022)。在这里,我们评估了PPAR的米德酸配体活动记者化验,我们表明,米德PPARα酸是一种有效的配体和PPARβ/δ;然而,只有PPARα,不是PPARβ/δ,是改善retinol-induced ICD功能。

PPARα配体已被广泛证明有抗炎作用通过调节角化细胞激活中观察到各种皮炎、包括刺激性和过敏性接触性皮炎,过敏性皮炎,紫外线(UV)全身红斑(张文雄et al ., 2002);Dubrac Schmuth, 2011;Shin et al ., 2016)。PPARα配体的抗炎活动皮肤病已观察到人类(Kippenberger et al ., 2001)。此外,PPARα激活参与调节细胞增殖和炎症趋化因子和细胞因子的生产。例如,PPARα激活氯贝酸通过抑制细胞增殖体内和在体外研究(Komuves et al ., 2000)。此外,局部应用王寅- 14643 (pirinixic酸),特定PPARα配体,减少促炎细胞因子的表达IL-1β和il - 6和特应性皮炎减弱皮肤炎症(Staumont-Salle et al ., 2008)。一致通过PPARα激活这些先前的报道显示抗炎作用,我们在这里显示,米德酸调节角化细胞异常通过retinol-induced ICD PPARα-mediated通路,是一种很有前途的候选人压制视黄醇的副作用的治疗。相比之下,PPARβ/δ激活促进角化细胞增殖和是一个关键事件在牛皮癣的增生,因为Hbegf我年代的一个直接目标基因PPARβ/δ(Romanowska et al ., 2008)。此外,PPARα生产减少皮炎病变,而PPARβ/δ生产,由中央调节炎症反应的介质,如肿瘤坏死因子α和γ干扰素,增加表皮特异反应性皮炎和牛皮癣病变与正常区域的皮肤(Westergaard et al ., 2003;Romanowska et al ., 2008)。这种差异的基因表达模式PPARα和PPARβ/δ皮炎表明PPARβ/δ过程中激活相关炎症的恶化。我们发现,米德酸减少retinol-induced ICD通过PPARα与先前的报道是一致的,表明的功能两个亚型,PPARα和PPARβ/δ,不完全重叠(Icre et al ., 2006),PPARα激活是一个有前途的有效减少retinol-induced ICD的候选人。此外,由于PPARα配体被发现有不同的健康影响在高脂血症,老年痴呆症,和酗酒,米德酸可能是一个有前途的工具,不仅缓解皮肤疾病,多种炎性疾病(黑客et al ., 2012;Beckenbach et al ., 2015;pswlak et al ., 2015)。

所需的信号的角化细胞的增生retinol-induced ICD尚未阐明,但在银屑病皮肤p38 MAPK激活是一个关键事件发展的临床症状,包括表皮增厚(樱井et al ., 2019)。我们发现这里p38 MAPK也是一个主要的下游信号通路诱导的角化细胞异常引起的视黄醇刺激,如角化细胞增生和炎症趋化因子表达。另外,我们的在体外研究利用HaCaT细胞造成p38 MAPK的差别表明,对这些米德酸应用程序是由增加的表达MAPK磷酸酶MKP1和MKP3发挥重要作用在调优MAPK家庭成员的活动。特别是,p38 MAPK MKP1灭活更有效地比MAPK / ERK,而MKP3 MAPK / ERK灭活而不是p38 MAPK信号(欧文斯和Keyse, 2007年;Kidger Keyse, 2016)。一些报告显示MKPs减少炎性介质的参与生产和炎症反应。例如,12-hydroxyheptadecatrienoic酸上调MKP表达和抑制p38 MAPK激活,从而减少的表达il - 6在UV-B-irradiated HaCaT细胞(李et al ., 2012)。此外,老鼠缺乏MKP1过度分泌的促炎细胞因子,和MKP1基因敲除小鼠极易受imiquimod-induced牛皮癣、增强p38磷酸化和增加处于受控和Cxcl2表达式也观察到(赵et al ., 2018)。减少衰减p38 MAPK的激活和炎症也可能发生至少部分通过MKP3增强,因为MKP3生产过剩抑制lipopolysaccharide-induced p38磷酸化,减少炎症在人类脐静脉内皮细胞(Unenkhuu et al ., 2021)。这些报告支持假设upregulation MKP1和MKP3降低角化细胞增生和趋化因子生产retinol-induced ICD通过p38 MAPK衰减。这些结果表明之间的串扰可以解释差别PPARα激活和p38 MAPK对这些MKP函数。然而,PPARα配体5、8、11、14-eicosatetraenoic酸增加MKP1 mRNA稳定诱导户珥(人工抗原R),已知一个rna结合蛋白提高mRNA的稳定性,抑制趋化因子表达主要星形胶质细胞通过PPARα-independent通路(李et al ., 2012)。因此,我们需要研究之间的交互PPARα激活和MKP upregulation更多的深度。

米德酸调节不仅角化细胞功能,而且减少LTB中性粒细胞激活₄生产的中性粒细胞和嗜中性粒细胞炎症通过减少伪足形成的招聘网站推广fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)管理局(女子et al ., 2019)。PPARα激活减少LTB₄生产和LTB进一步加速₄新陈代谢(Narala et al ., 2010)。中性粒细胞表达PPARα,米德酸可以直接抑制LTB₄生产的中性粒细胞和进一步招募中性粒细胞通过PPARα-mediated通路。我们在这里显示,米德酸减少p38 MAPK激活,这是至关重要的角化细胞促进异常。此外,我们发现中性粒细胞炎症的网站的数量与SB202190不仅降低了治疗,而且U0126。然而,评价嗜中性粒细胞趋化性通过使用p38 MAPK抑制剂已经表明,中性粒细胞仍然能够向fMLP迁移,但不像未经处理的中性粒细胞(有效金姆和海恩斯,2013年)。事实上,在p38 MAPK抑制剂的存在,中性粒细胞减少展示表达粘附分子表面标记如CD11b和CD66b和化学引诱物受体如甲酰肽受体2,LTB₄受体,科学家趋化因子受体1,需要识别化学引诱物和内皮细胞(中性粒细胞粘附金姆和海恩斯,2013年)。这些报告显示,p38 MAPK-dependent通路发挥作用在中性粒细胞趋化性,在一定程度上通过调节表面标记和受体表达。相比之下,MAPK / ERK通路中扮演一个重要的角色在促进中性粒细胞迁移(Ichiki et al ., 2016),它起着关键作用在中性粒细胞转导信号“走”,不仅他们的移民来自小静脉,但也在迁移期间在组织(美津浓et al ., 2014)。此外,MAPK / ERK活化的内皮细胞中性粒细胞浸润(需要斯坦et al ., 2003)。符合这些发现,我们表明,治疗与MAPK / ERK抑制剂U0126减少耳肿胀炎症和中性粒细胞数量上没有降低角质细胞的增生或中性粒细胞化学引诱物在角化细胞的基因表达;然而,它确实减少retinol-induced ICD。因为MKP3强烈抑制MAPK / ERK激活,它可能是负责米德的直接影响酸中性粒细胞(Kidger Keyse, 2016)。因此,米德酸可能直接调节中性粒细胞功能衰减MAPK / ERK通路或p38 MAPK通路,或两者,通过增强MKP1和MKP3表达式。然而,在我们的研究目前还不清楚是否MAPK / ERK激活中性粒细胞被米德减酸治疗。此外,PPARα之间的关系、MAPK / ERK和p38 MAPK和中性粒细胞功能,和这些分子的mead-acid-stimulated功能信号在中性粒细胞,尚未透露。未来的研究需要准确地揭示如何由米德酸中性粒细胞的功能。

总之,我们在这里显示,米德酸减少retinol-induced ICD通过抑制中性粒细胞化学引诱物的角化细胞和基因表达的增生处于受控和Cxcl2通过PPARα-mediated通路。此外,我们表明,米德酸表达下调p38 MAPK在HaCaT激活细胞的表达上调MKP1和MKP3。我们表明,局部应用米德的酸可以减少ICD观察类维生素a治疗的副作用。局部管理米德似乎很有希望改善类维生素a酸治疗。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究伦理委员会审查和批准的国家生物医学研究院的创新、健康和营养。

作者的贡献

,PT、TN和JK的构思和设计研究,进行数据分析,撰写了手稿。PT,恩,和KH进行了实验和讨论结果。TH和KK提供了技术帮助皮肤炎症动物模型并讨论了结果。

资金

这项工作得到了教育部,文化,体育,科学和技术(下边了)/日本社会的促进科学KAKENHI(格兰特数字21 k20769;19 k07617 TN;22 k15004 KH;和21 h02757 JK);日本医学研究和发展机构(艾湄湾;格兰特数量22 ae0121035s012 KH和格兰特号码22 fk0108145h0003 22 ae0121042h0002,和223年fa727001h0001 JK);日本卫生部和福利和公共/私人研发投资战略扩张计划:棱镜(批准号20 ac5004 JK);联席战略创新推广计划23 (SIP)(批准号18087292 JK);格兰特的医学科学研究所的联合研究项目,东京大学(JK);小野医学研究基金会(JK); and the Canon Foundation (to JK).

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

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补充图S1|米德酸和油酸不是有毒HaCaT细胞。HaCaT细胞(1×10⁴细胞)与米德孵化酸和油酸调整为1 h和指定的最终浓度(B)24 h。可行的细胞的百分比计算通过使用下列公式:(%)=[100×(样本OD_570年)/(车辆OD的控制_570年)]。从两个独立的实验数据相结合,n= 7或8。之间没有明显差异在细胞生存能力mead酸和油酸治疗在每个浓度或浓度的酸。

补充图S2|米德酸没有进一步抑制影响co-treatment p38 MAPK抑制剂。局部应用引起的刺激性接触性皮炎是视黄醇连续4天。小鼠局部收到p38 MAPK抑制剂或车辆(1:1 DMSO溶液和50% (v / v)乙醇在PBS)。米德酸或车辆(75% (v / v)乙醇在PBS)应用。(一)在4天耳朵厚度测量。耳肿胀(Δµm)计算(Ear厚度[µm] 4天)——(Ear厚度(µm)第一个视黄醇应用程序之前)。(B)耳朵样本获得的第四天。ki - 67表达角质细胞的百分比作为CD45封闭⁻CD31⁻CD34⁻CD49f⁺流式细胞仪测定。增加的ki - 67⁺细胞(Δki - 67(%))是计算(ki - 67[%] 4天)——(ki - 67 [%] retinol-untreated小鼠平均4天)。(C)耳组织均质隔离mRNA,处于受控和Cxcl2表达式是由定量rt - pcr分析测量和规范化的Actb。从四个独立的实验数据相结合。单杠表示中位数的值。NS,不重要;*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。

补充图S3|米德酸不减少Hbegf表情角质细胞在老鼠身上。老鼠用mead酸预处理或车辆(75% (v / v)乙醇在PBS)前30分钟的刺激与视黄醇或车辆。八小时后,CD45⁻CD31⁻CD34⁻CD49f⁺角化细胞分离,然后信使rna提取执行定量rt - pcr分析。Hbegf表达式,它是标准化的Actb测量。从两个独立的实验数据相结合。单杠表示中位数的值。NS,不重要。

补充图S4|米德酸不抑制MKK3和MKK4角化细胞表达。HaCaT细胞(2×10⁶细胞)是用蜂蜜酒酸预处理或车辆前30分钟的刺激与HB-EGF (1 ng / mL)表达水平的1 h。MKK3和MKK4测量定量rt - pcr分析和归一化的Actb。从四个独立的实验数据相结合。单杠表示中位数的值。NS,不重要。

引用