原创研究文章

前面。Microbiol。，06 March 2023
第二节食物微生物学
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1139386

红参膳食纤维促进益生菌特性Lactiplantibacillus杆菌改变细菌的新陈代谢

全贤智 ^{1 __}，

Seung-Hwan你 ^{2 __}，

尹浩南^3、4，

Van-Long Truong¹，

刘振国爆炸¹，

Yeon-Ji Bae¹，

Razanamanana H. G.拉里森¹，

Sang-Kyu金 ²，

Woo-Sik宋 ¹，

郑永勋 ^{1 *}而且

Minhye胫骨 ^{3、4 *}

¹韩国大邱庆北大学农业与生命科学学院食品与生物技术学院食品与生物工业研究所
²功效研究实验室，韩国人参公司，大田，大韩民国
^3.大韩民国仁川仁荷大学医学院微生物学系
⁴韩国仁川仁荷大学生物医学科学与工程专业生物医学科学系

红参作为一种草药被广泛使用。红参膳食纤维(RGDF)是经过加工的人参产品的残留物，但仍含有可作为益生元使用的生物活性成分。在本研究中，我们评估了属于家族的菌株的发酵谱和益生菌特性的变化乳杆菌科补充RGDF通过代谢组学分析，了解RGDF对代谢改变的具体机制，并发现添加RGDF的益生菌菌株分泌的新的生物活性化合物。添加RGDF促进了短链脂肪酸(SCFA)的产生、碳源利用和肠道上皮粘附Lactiplantibacillus杆菌并抑制肠道病原体的附着。细胞内和细胞外代谢组分析表明，RGDF诱导代谢改变，特别是与中枢碳代谢相关，并产生RGDF特异性代谢产物l .杆菌,分别。具体地说,l .杆菌细胞内的油酸、烟酸、尿嘧啶和甘油酸代谢产物减少，而包括油酸、2-羟基丁酸、己醇和乙酸丁酯在内的几种代谢产物细胞外分泌增加。补充RGDF对l .杆菌与补充低聚果糖代谢比较。这些发现表明了RGDF作为益生元和补充RGDF产生的生物活性化合物的潜在应用l .杆菌作为人类疾病预防和治疗的新型生物代谢产物。

简介

人参是该属植物的根人参在东亚被广泛用作草药(所以等，2018年)．它的典型特征是人参皂苷的存在，这是具有抗氧化，抗增殖和神经保护特性的主要生物活性成分(Tam等人，2018年)．近年来，人参的生物学特性得到了广泛的证实;其中包括增强免疫系统性能和记忆力，以及改善血液循环(耿等，2010；Cho等人，2018；Su等，2022)．

红参(人参C.A. Meyer)是将新鲜人参反复蒸干而成的加工产品，以延长保质期，减少毒性作用，增强生物效益(他等人，2018)．红参传统上是作为含有高浓度人参皂苷的水提取物食用的。这些残留物通常被丢弃，但它们仍然含有生物活性成分，如未提取的人参皂苷、酸性多糖、矿物质元素和膳食纤维(Yu等，2020年)．充分利用这些残留物的许多尝试包括制药、保健功能食品和化妆品应用(Truong和Jeong, 2022)．

膳食纤维是来自植物性食物的碳水化合物聚合物，不能被人体酶消化或被肠道吸收。聚合物有助于人体肠道健康，增加粪便重量和规律，增厚肠道内容物，促进肠道微生物的生长(Makki等人，2018)．特别是，膳食纤维可以成为大肠内细菌的良好发酵来源，并影响细菌群落的组成以及产生短链脂肪酸(SCFAs)等发酵最终产物的微生物代谢活动。这些益生元可发酵纤维促进细菌群落之间的代谢相互作用，交叉喂养益生菌并抑制病原体的增殖(Holscher 2017)．

乳杆菌科(包括新定义的乳酸菌-通过分类学变化的相关属，如Lactiplantibacillus而且Limosilactobacillus),双歧杆菌是最著名的益生菌属，通常存在于人类胃肠道。益生菌是活的微生物，通过产生有用的生理生物活性化合物对宿主有益。这些化合物对宿主具有免疫调节、抗癌、抗衰老和抗菌作用。然而，由于对这些化合物的分子机制、菌株特异性行为和安全性缺乏了解，这些化合物的使用目前受到限制。Bourebaba等人，2022年)．为了解决这些局限性，最近的研究集中在阐明微生物代谢和发现后生物分子，其定义为无细胞上清液中益生菌分泌的代谢产物(Nataraj等人，2020年)．

代谢组学是对特定细胞过程产生的独特化学分子(称为代谢物)的系统研究。Jordan et al.， 2009)．代谢组学数据用于表型分子相互作用，识别潜在的生物标志物，并发现新的治疗靶点。在本研究中，我们旨在寻找一种有效的利用红参渣作为益生元膳食纤维来源的策略，并评估其益生元特性对益生菌生长、代谢和上皮附着能力的变化乳杆菌科菌株。通过综合代谢组学分析，研究红参膳食纤维(RGDF)对细菌代谢的影响，并发现添加了RGDF的益生菌株分泌的新的生物活性化合物。

材料与方法

菌株和培养基

这种LimosilactobacillusKCTC 3594和Lactiplantibacillus杆菌KCTC 3108来自韩国类型文化收藏(KCTC, jeong geup, Republic of Korea)。菌株在50 ml的锥形试管中，在50 ml的MRS培养液(BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)中预培养，并在37°C下不摇晃孵育过夜(Biofree，首尔，韩国)。然后在37°C下，在添加0.5、1或2% RGDF的50 ml MRS肉汤中培养益生菌菌株(韩国人参公司，大田，大韩民国)。MRS肉汤组成如下:10 g/L蛋白蛋白胨、10 g/L牛肉提取物、5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、1 g/L聚山梨酯80、2 g/L柠檬酸铵、5 g/L乙酸钠、0.1 g/L硫酸镁、0.05 g/L硫酸锰、2 g/L磷酸二钾。

RGDF的制备

红参在87℃水提24小时后剩余的残渣由韩国人参株式会社(大韩民国大田)提供。通过115°C干燥，粉碎至50目制备RGDF。RGDF的理化特性如先前报道所述进行了分析(Yu等人，2022)，本研究使用相同的RGDF材料。

测量细菌生长和细胞质量

集落形成单位/毫升的益生菌菌株培养在汤夫人或太太补充了0.5,1或2%的RGDF衡量系列稀释(0)3、6、12、24 h。干电池的菌株在24小时测量由离心收集细胞颗粒在4000 rpm和4°C 15分钟,洗丸三次10毫升的1% (w / v)磷酸缓冲盐,和干燥烘箱(JS研究公司,自然对流烤箱,Gongju,使用pH计(Ohaus, Parsippany, NJ, USA)测量培养基的pH值。

SCFAs分析

使用LC-6000系统(FUTECS，大田，韩国)，用高效液相色谱法(HPLC)测定甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度。每1.5 ml培养液采用离心(Eppendorf, Hamburg, Germany)，转速13000 rpm，离心5 min，温度4℃，经0.45 μm尼龙膜过滤器过滤。HPLC分析使用Aminex HPX-87X有机酸柱(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)， 0.005 M H₂所以₄为流动相，55℃恒定洗脱流量0.5 ml/min。

碳源利用分析

使用API试剂盒(BioMérieux, Marcy l’Étoile, France)比较益生菌菌株利用特定碳源的能力。接种样品通过从浊度大于麦克法兰标准4的每种培养基中收集培养菌株制备。将100微升样品接种到API条中，在37°C下孵育4小时。孵育后，加入试剂进行读取，孵育10分钟，并在1000 W强光下暴露10秒，以脱色任何多余的试剂。利用数值剖面进行识别和解释。

肠道上皮细胞的细菌附着分析

Caco-2细胞系购自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)，在添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的最低必需培养基(MEM)中培养，37℃，5% CO₂的气氛。大肠杆菌从ATCC购买，在Luria肉汤(LB)中过夜。大肠杆菌rgdf预处理的益生菌在5000 rpm下离心10 min，用无菌PBS洗涤两次，重新悬浮在血清和无抗生素MEM中。

粘附实验中，Caco-2单分子层接种约10⁸CFU /毫升这种l .或l .杆菌在5%的CO中孵育2小时₂孵化器。培养后，用无菌PBS清洗单层膜三次以去除非粘附细菌。用胰蛋白酶- edta溶液分离有粘附细菌的Caco-2细胞。细菌计数采用菌落计数法在MRS琼脂板上进行。粘附结果用粘附菌百分比除以初始添加菌数表示。

对于竞争分析，大约10⁸每种益生菌的CFU/ml和大肠杆菌与Caco-2单分子膜共孵育1小时在5% CO₂孵化器。无菌PBS冲洗无结合菌3次，用胰蛋白酶- edta溶液分离有粘附菌的Caco-2细胞。可粘附的数量大肠杆菌采用LB琼脂平板菌落计数法测定。竞争指数用抑制率表示大肠杆菌粘附力在每个益生菌菌株存在时除以细菌在没有益生菌菌株时的粘附力。

代谢组分析

与LC-MS相比，GC-MS具有更高的色谱分辨率和更大的光谱库的优势，尽管代谢组覆盖的化学范围比LC-MS窄(Aretz和Meierhofer, 2016)．近年来，越来越多的研究使用LC-MS检测出更多的峰，但除了分子量较大的脂质分子外，LC-MS鉴定的代谢物大多与GC-MS有较大的重叠。GC-MS因其高重复性、易标注代谢物的硬电离方法而成为代谢物谱分析最常用的技术，至今仍广泛应用于代谢物谱分析和鉴定(Baiges-Gaya等人，2023年；Kurbatov等人，2023年；Neag等人，2023年)．

对于代谢组分析，每个细胞内和细胞外代谢物测量l .杆菌而且这种l .在MRS培养基中分别添加不同的RGDF、低聚果糖或不添加低聚果糖。为了从益生菌中提取胞内和胞外代谢物，每个菌株在15 ml培养基中培养，直到通过测量其生长曲线确定指数中期阶段。每种益生菌培养物15毫升，在4°C下以4000转/分的速度离心15分钟。上清液经聚偏氟乙烯组成的0.2 μm注射器过滤器过滤，提取细胞外代谢物。将过滤后的上清液等分(750 μL)与2.25 ml 4°C甲醇(gc级100%;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)并涡旋1分钟。混合物在13000 rpm和4°C下离心10分钟，收集每个上清0.1 ml，并使用Spin Driver Lite VC-36R (TAITEC Corporation, Koshigaya City, Saitama, Japan)在2000 rpm下完全干燥24小时。

为了从细胞球中提取细胞内代谢物，在球中加入1 ml 0.9%冷NaCl (w/v)，用0.2 μm注射器过滤器过滤。然后转移到15 ml锥形管中，用10 ml 0.9%冷NaCl (w/v)洗涤两次。最后洗净的颗粒与2毫升甲醇混合，漩涡10分钟，并在冰上超声1分钟。材料与2毫升氯仿混合，漩涡10分钟，用冰超声1分钟。加水(1.8 ml)，重复旋流和超声检查。最终混合物在13000转/分、4℃下离心10分钟，收集各上层清液0.1 ml，在相同条件下使用上述Spin Driver Lite VC-36R完全干燥，提取细胞外代谢产物。甲氧基化和硅基化进行衍生化的细胞内和细胞外代谢产物。甲氧基化时，将10 μL含20,000 ppm甲基羟氯胺的吡啶与每个干燥样品混合，30℃孵育90 min。然后加入45 μL n -甲基- n -三甲基硅基-三氟乙酰胺(Fluka, Buchs, Switzerland)和30 μL氟蒽作为内标，漩涡进行硅基化，37℃孵育30 min。衍生样品转移到带插入物的气相色谱(GC)瓶中。

使用Crystal 9000色谱仪(chrootec, Val-de-Virvée，法国)与chrootec -晶体质谱仪(光电倍增检测器)进行气相色谱，用于分析非靶向代谢物。将一微升衍生样品注入VF-5MS色谱柱(Agilent, Santa Clara, CA, USA)。烘箱温度最初为50°C，持续2min，然后以5°C/min的速率上升到320°C，并在320°C保持10 min。氦气载气以1.5 ml/min的速率流动。

统计分析

对于质谱(MS)数据的反褶积和代谢物的鉴定，MS- dial ver。使用4.70。使用Fiehn RI文库的所有记录通过匹配MS峰值来识别代谢物。以正构烷烃混合物为基础，保留指数计算采用Kovats保留指数公式:

国际扶轮 ＝ One hundred. \times （ n ） + One hundred. \times （ 米 - n ） \times \frac{t r 我 - t r n}{t r 米 - t r n}

式中RI，代谢物“i”的保留指数;N，在“i”之前洗脱的烷烃的碳数;M，在“i”后面洗脱的烷烃的碳数;Tri，“i”的保留时间;Trn，在“i”前洗脱的烷烃的滞留时间;trm为“i”后洗脱的烷烃的滞留时间。将每个代谢物的保留指数与NIST 2020质谱库(NIST, Gaithersburg, MD, USA)中注册的标准值进行比较，并根据保留指数和质量碎片分布确定代谢物。

使用MetaboAnalyst (Ver. 5.0)进行单方差和多方差分析、主成分分析(PCA)、层次聚类分析和代谢物集富集分析(MSEA)。使用Cytoscape软件进行MetaMapp等网络分析。

结果

补充RGDF可促进短链脂肪酸的生成和碳源利用l .杆菌

红参含有人参皂苷，对癌症、糖尿病和衰老有重要的药理作用(袁等，2012；Yu等，2020年；Hong等，2022)．红参加工的副产品仍然含有几种生物活性成分，如酸性多糖和膳食纤维，以及剩余的人参皂苷(Park和Kim, 2006)．RGDF是一种副产品，由约31%的膳食纤维(314.3 mg/g)和0.66%的人参皂苷(总人参皂苷的6.63 mg/g)组成(Yu等人，2022)．

由于膳食纤维是众所周知的促进细菌生长和益生菌功能的益生元成分，我们首先筛选了RGDF对益生菌菌株代谢谱的影响，包括这种l .，l .杆菌，嗜酸乳杆菌，Lacticaseibacillus干酪乳杆菌,Lactococcus lactis（补充表1)．我们选择了两种益生菌，l .杆菌而且这种l .，它们分别受RGDF补充的积极和消极影响最大。虽然RGDF的添加对两种益生菌的生长都有一定的促进作用乳杆菌科菌株，与对照组相比差异不显著(图1A、B)．对照组与RGDF添加组培养基pH值变化无显著性差异。为了揭示RGDF与益生菌功能之间的可能联系，我们接下来用RGDF测量了SCFAs的产生和碳源利用情况。l .杆菌RGDF以剂量依赖的方式增加了SCFAs的产生，特别是乳酸和醋酸盐。这种l .减少这些代谢物的产生(图1C、D)．RGDF还提高了碳源利用能力l .杆菌但没有影响这种l .（图1 e)．因此，补充RGDF可以促进有益代谢产物(乳酸和醋酸盐)的产生和碳源的利用l .杆菌．

图1

图1所示。发酵概况l .杆菌而且这种l .．(A, B)细菌生长,(C, D)培养基pH值，(E, F)乳酸和醋酸盐的生产(G)碳源利用。差异在95%的显著性水平(＊)及99% (**)，由Dunnett的单因素方差分析确定因果分析。误差条表示标准差(SD)。RGDF，红参膳食纤维;肋,一小;ARA L-arabinose;人,D-mannitol;琼,山梨糖醇;LAC D-lactose;D-trehalose混乱关系;犬,菊粉; RAF, D-raffinose; AMD, starch; GLYG, glycogen; +, positive; –, negative.

补充RGDF促进肠道上皮粘连l .杆菌并预防肠道病原体

膳食纤维通过促进益生菌、限制病原微生物的生长和粘附以及刺激纤维来源的短链脂肪酸的产生来帮助维持肠道稳态(蔡等，2020)．RGDF的添加显著提高了粘结力l .杆菌对肠道上皮细胞的影响。黏附在0.5% RGDF (图2一个)．粘附的l .杆菌而且这种l .通过添加RGDF (图2 b)．这种l .是一种具有良好粘附能力的益生菌(对照中约30%)(Gao等，2016)．这种行为在本研究中得到了证实;与对照组相比，对照组粘连率明显较高l .杆菌(对照组中约2%)。

图2

图2。肠道上皮粘附(A, B)以及抑制大肠杆菌附件(C, D)的l .杆菌而且这种l .．采用Dunnett 's单因素方差分析，差异显著性水平分别为95%(*)和99% (**)因果分析。

为了评估rgdf补充菌株对肠道致病菌与宿主上皮细胞结合的竞争性抑制作用，大肠杆菌rgdf预处理的益生菌与Caco-2单层共孵育(图2C、D)．添加RGDF可显著降低大肠杆菌两者都存在的依恋l .杆菌而且这种l .；差异较大的是l .杆菌．类似于的上皮粘附这种l .，该菌株对病原菌附着表现出较高的基础竞争力l .杆菌．然而，添加RGDF显著改善了肠道上皮细胞的粘附，并能预防大肠杆菌附件的l .杆菌这可以扩大该菌株作为益生菌的适用性。研究发现，影响菌株上皮粘附的因素包括表面蛋白的存在、自聚集和细菌表面疏水性。细菌粘附是基于非特异性的物理相互作用和聚集能力，也形成了防止病原体定植的屏障(科斯等人，2003)．Dell 'Anno等人(2021)，表明两者l .杆菌而且这种l .显示自聚集和上皮粘连。l .杆菌而且这种l .分别具有较高的疏水性和较大的自聚集性，反映了它们不同的定殖能力。综合研究结果表明，补充RGDF促进肠道上皮粘连，并对存在的肠道病原体具有保护作用l .杆菌．

补充RGDF改变细胞内代谢谱l .杆菌，但不是这种l .

虽然两l .杆菌而且这种l .利用膳食纤维作为益生元，我们的结果表明，RGDF补充有效l .杆菌，但不在这种l .．为了确定RGDF对细菌代谢的影响，我们首先确定了添加RGDF与对照组之间的细胞内代谢组的变化l .杆菌而且这种l .．共鉴定出106种代谢物，包括糖、氨基酸、脂肪酸、有机酸和多胺(补充表2)．PCA结果清楚地显示，添加0.5% (w/v) RGDF后，代谢发生了变化l .杆菌的代谢谱这种l .与RGDF没有区别(图3一)．PC1和PC2的负载表明富马酸(PC1为−0.834)、尿嘧啶(PC1为−0.924)、吡啶甲酸(PC1为0.791)和2-羟基丁酸(PC1为0.763)是决定两者代谢差异的重要代谢产物l .杆菌而且这种l .．

图3

图3。细胞内代谢组学分析l .杆菌而且这种l .与对照MRS肉汤相比，用0.5% (w/v) RGDF培养。(一)主成分分析(PCA)评分和加载图。(B)火山分布图l .杆菌．显著减少的代谢物用蓝色三角形表示。(C)MetaMapp的l .杆菌用RGDF与对照MRS肉汤进行培养。每个节点都是一个经过结构鉴定的代谢物。蓝色节点为减少的代谢物，黄色节点为不变的代谢物。节点和标签的大小反映了折叠变化和p值的t以及分别。(D)MSEA的l .杆菌．(E)细胞内代谢产物的归一化丰度l .杆菌与对照MRS肉汤相比，用0.5% (w/v) RGDF培养。数据用六种确定的小提琴图表示。代谢物丰度之间的差异均在95%(*)和99%(**)的显著性水平上显著，由学生确定t以及。

MetaMapp，一个基于生化途径和化学和质谱相似性的代谢物网络图，显示了显著改变的代谢物(p与对照组相比，RGDF < 0.05)l .杆菌（图3 c)．MSEA也支持显著改变细菌代谢的结果，特别是糖(半乳糖、淀粉和蔗糖)代谢和不饱和脂肪酸生物合成(图3 d)．考虑到乳酸和醋酸盐产量的显著增加和碳水化合物的利用l .杆菌与RGDF (图1)，我们认为糖酵解代谢流量和膜弹性分别会受到RGDF的影响。

此外，我们使用火山图(火山图)比较了RGDF对每种代谢物强度的影响。图3 b)．在添加RGDF后，四种代谢物(油酸、烟酸、尿嘧啶和甘油酸)的强度下降l .杆菌（图3 e)．RGDF也显著降低了这些代谢物的相对丰度，验证了与四种代谢物相关的代谢过程被RGDF特异性地改变了(补充图1)．总之，这些发现表明l .杆菌，但不是这种l .，特别是通过中枢碳代谢补充RGDF。

补充RGDF促进特定代谢产物的生物合成l .杆菌

后生物制剂是在宿主体内具有生物活性的不可存活的细菌代谢产物(Nataraj等人，2020年)．与益生菌相比，这些分子在安全性和有效性方面具有一些优势，例如仅通过已定义的机制触发靶向反应，更好地获取微生物相关分子模式，以及易于生产和储存(Nataraj等人，2020年)．系统地描述由RGDF补充产生的生物后代谢产物l .杆菌，我们进一步分析了细胞外代谢组l .杆菌而且这种l .用0.5% RGDF生长，定义为从细菌培养到基准培养基中代谢产物强度的废培养基中的相对代谢产物强度(Jain et al.， 2012)．如PCA结果所示，菌株之间以及RGDF补充组和对照组之间的外代谢组谱明显分离(图4一)．

图4

图4。的细胞外代谢组学分析l .杆菌而且这种l .与对照MRS肉汤相比，用0.5% (w/v) RGDF培养。(一)主成分分析(PCA)评分和加载图。细胞内代谢产物的归一化丰度l .杆菌(中)与对照MRS肉汤相比，用0.5% (w/v) RGDF培养。数据用六种确定的小提琴图表示。代谢物丰度之间的差异均在95%(*)和99%(**)的显著性水平上显著，由学生确定t以及。

红参膳食纤维特异性细菌代谢产物与培养基成分的区别主要基于三个标准:(1)废培养基中代谢产物强度减去未培养培养基中代谢产物强度的平均值为正;(2) RGDF与对照之间的统计学显著性应在95%置信水平以下;(3)与对照组相比，代谢物强度随RGDF的绝对变化为>2。基于这些标准，我们确定了四个标准l .杆菌代谢产物(油酸，2-羟基丁酸，己醇和醋酸仲丁酯)的生物合成，特别响应RGDF补充(图4中)．综合研究结果表明，RGDF的补充促进了特定代谢产物的生物合成l .杆菌．这些代谢物包括油酸、2-羟基丁酸、己醇和乙酸丁酯。

补充RGDF对l .杆菌与补充低聚果糖代谢比较

膳食纤维是一种来自植物的成分，不能被人体的酶完全消化，由非淀粉多糖组成，包括纤维素和低聚糖(Veronese等人，2018)．低聚果糖(FOS)是一种膳食纤维，由β-(2,1)键连接的线性果糖单元链(Sabater-Molina等人，2009年)．它们自然存在于植物中，如洋葱、菊苣和香蕉，并越来越多地用于食品中，因为它们的益生元作用，刺激益生菌肠道菌群的生长(Sabater-Molina等人，2009年)．比较不同类型膳食纤维对大鼠代谢变化的影响l .杆菌，我们培养l .杆菌对照MRS, 0.5% RGDF MRS, 0.5% FOS MRS。与RGDF的生长结果相似图1，补充RGDF或FOS对细菌生长没有影响(补充表3)．

相比之下，细菌生长缺乏可观察到的差异，代谢组的概况l .杆菌添加RGDF显示MRS和FOS在细胞内和细胞外状态之间的过渡(图5A、B)．类似于RGDF的效果图3C、D， FOS还降低了糖和中枢碳代谢中特定代谢物的丰度，而亮氨酸的丰度与对照组相比，添加FOS后明显增加(图5 c)．MSEA分析表明，FOS处理改变了柠檬酸循环及其相关途径，如丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢以及糖代谢(图5 d)．比较RGDF与FOS的细胞内代谢物丰度发现，添加RGDF导致棕榈酸和硬脂酸的丰度降低，而RGDF中尿嘧啶、棉子糖、抗坏血酸和2-羟基丁酸的丰度相对增加(图5E, F)．

图5

图5。的代谢组学分析l .杆菌用0.5% (w/v) RGDF或0.5% (w/v) FOS培养。主成分分析(PCA)评分及细胞内负荷图(一)和细胞外(B)代谢物。MetaMapp的l .杆菌与对照MRS肉汤相比，用FOS培养(C)用RGDF与FOS进行比较(E)．每个节点都是一个经过结构鉴定的代谢物。蓝色节点为代谢物减少，红色节点为代谢物增加，黄色节点为代谢物不变。节点和标签的大小反映了折叠变化和p值的t以及分别。MSEA的l .杆菌与对照MRS肉汤相比，用FOS培养(D)用RGDF与FOS进行比较(F)．

接下来，我们比较了FOS处理与对照组产生的细胞外代谢物差异，应用与RGDF处理相同的标准(图6)．正如预期的那样，用FOS培养的细胞培养上清含有比用RGDF培养的细胞更丰富的糖和糖衍生物，包括棉子糖、d -葡萄糖胺和蒎醇。FOS没有显著诱导rgdf特异性代谢产物的产生，包括油酸、2-羟基丁酸、己醇和乙酸仲丁酯，这表明这些分子的代谢是rgdf特异性的。因此，补充RGDF对l .杆菌代谢的变化。

图6

图6。细胞外代谢产物的归一化丰度l .杆菌用0.5% (w/v) RGDF或0.5% (w/v) FOS培养。数据用六种确定的小提琴图表示。经Tukey 's单因素方差分析，差异显著性水平分别为95%(*)和99% (**)因果分析。

讨论

人参衍生产品中的膳食纤维和相关植物化学物质提供各种功能和健康益处。在这项研究中，我们评估了RGDF作为益生元成分对益生菌生理和代谢变化的影响。在生长培养基中添加RGDF，l .杆菌与其他益生菌相比，短链脂肪酸(SCFAs)产量最高，特别是乳酸和醋酸盐，碳水化合物发酵能力最强乳杆菌科物种,特别是这种l .．此外，RGDF还能改善小鼠肠道上皮粘连l .杆菌还能抵御肠道病原体。细胞内代谢组的分析l .杆菌表明糖和不饱和脂肪酸的代谢物减少，油酸、烟酸、尿嘧啶和甘油酸的丰度显著降低。补充RGDF还促进了特定代谢产物的分泌，如油酸、2-羟基丁酸、己醇和乙酸丁酯l .杆菌．比较红参衍生膳食纤维与代表性膳食纤维FOS的代谢改变，显示了两种不同类型的纤维之间可区分的影响l .杆菌．

虽然膳食纤维通常促进益生菌的生长，但其作用是菌株特异性的。我们的研究结果一致表明，RGDF的补充改善了益生菌的特性l .杆菌，但不是这种l .．l .杆菌与大多数益生菌不同乳杆菌科物种，表现出生态和代谢的灵活性，从而保持多样化的功能基因组，促进了在各种环境中殖民的灵活性(Fidanza等人，2021年)．例如,l .杆菌菌株在暴露于低ph值条件下，通过诱导细菌膜脂肪酸组成的改变而表现出耐酸性(Huang等，2016)．165人的基因组分析l .杆菌菌株中存在大量碳水化合物代谢基因和调节生理过程的双组分系统和信号转导系统，与其他乳酸菌甚至益生菌相比，促进了物种在各种环境中的适应性乳杆菌科压力(Cui等，2021)．此外,l .杆菌产生称为植物素的细菌素，可有效抑制肠道致病菌，如大肠杆菌，在特定情况下(帕尔和斯里瓦斯塔瓦，2014年)．这些基于不同功能遗传特征的发现支持了我们的结果l .杆菌极大地调节和改善了它们的代谢功能，包括酸的产生，碳水化合物的利用，以及在RGDF存在时抑制病原体的生长。

为了解释RGDF如何促进细菌代谢改变l .杆菌，但不在这种l .，以及RGDF的效果与其他膳食纤维有何不同，这超出了RGDF的遗传灵活性l .杆菌的细胞内代谢变化l .杆菌而且这种l .当提供RGDF和FOS时。添加RGDF导致油酸、烟酸、尿嘧啶和甘油酸的丰度显著降低。油酸[独联体9-octadecenoic酸;18:1(9c)]是动物和蔬菜中最常见的单不饱和脂肪酸。它被纳入在培养基中生长的乳酸菌的膜中，但不是合成的(Johnsson等人，1995年)．在l .杆菌，我们的代谢组学分析表明，添加RGDF后，细胞内油酸丰度降低，而细胞外油酸丰度增加。这些发现表明，油酸从介质中吸收的较少，可能是由于RGDF改性了膜刚性。烟酸，也称为烟酸，是维生素B3的一种形式，是一种人体必需的营养物质，可以由植物和细菌提供。几种细胞过程需要该化合物作为辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NAD磷酸(NADP)的组成部分。在益生菌乳杆菌科一般而言，游离烟酸随着细胞活性的增加而减少，因为它主要以辅助因子的形式被吸收(McIlwain等人，1949年)．烟酸也是乳酸脱氢酶的重要辅助因子，是发酵过程中乳酸产量的限制因子，这可能与RGDF降低细胞内丰度和提高乳酸产量有关(Colombié和Sablayrolles, 2004)．甘油酸是几种磷酸衍生物的前体，是糖酵解过程中重要的生化中间体。3-磷酸甘油酸是一种对丝氨酸和半胱氨酸生物合成特别重要的衍生物。最近的一项研究证明了这一点l .杆菌添加2% RGDF会上调丝氨酸(sdhA, sdhB和sdaC)和半胱氨酸代谢(cysE)相关基因的表达(Yu等人，2022)．虽然需要进一步验证特定代谢和生理机制的变化，但我们的结果支持补充RGDF改变细胞和代谢过程的观点。

乳酸杆菌被认为能够分泌许多有益的代谢物，如短链脂肪酸、吲哚衍生物和维生素(王等，2018；汤普森等人，2020年；Sugimura等，2022)．我们的外代谢组学分析显示，2-羟基丁酸、己醇和乙酸丁酯作为代谢物，在补充RGDF时被特异性分泌。这些化合物通常在丙酸盐生物合成和丁醇代谢过程中作为最终产物排出。在哺乳动物组织中，2-羟基丁酸，也称为α-羟基丁酸，在半胱硫氨酸被切割成半胱氨酸以解毒对抗氧化应激时，作为副产物释放出来。虽然它已被用作2型糖尿病和乳酸中毒的生物标志物，但2-羟基丁酸的新作用已被提出，以保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤和对病毒感染的免疫调节(刘等，2018；郑等，2020；Shi等，2021)．例如，据报道，与健康对照组相比，包括人乳头瘤病毒或SARS-CoV-2在内的病毒感染患者的血清2-羟基丁酸水平升高(刘等，2018；Shi等，2021)．这可能是激活抗氧化反应和控制细胞氧化还原平衡的结果。己醇是一种用于香水工业的有机酒精;它的气味像刚割过的草，还有一点草莓的味道。其健康相关的功能尚不清楚，但据报道，它调节肌动球蛋白马达的功能(小松等人，2004年)．与己醇类似，醋酸丁酯具有独特的风味和香蕉或苹果的甜味气味(Holland等人，2005年)．它还具有抗菌活性，对化妆品中的不良微生物，如金黄色葡萄球菌而且大肠杆菌（Lens等，2016)．补充RGDF刺激后这些代谢物分泌的具体机制以及与FOS的比较研究将提供一些证据，证明代谢物的产生对RGDF高度特异性，而不是碳水化合物聚合物膳食纤维。需要进一步的遗传学研究来阐明潜在的机制。

结论

添加红参膳食纤维可促进小鼠的益生菌特性l .杆菌包括SCFAs(乳酸和醋酸盐)的产生、碳水化合物的利用、上皮附着和病原体抑制。比较代谢组学分析表明，rgdf相关的细胞和代谢过程的修饰，包括膜生物学和中枢碳代谢。此外，还探讨了rgdf补充后产生的生物活性化合物的潜在应用l .杆菌被认为是一种新的生物代谢产物。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

作者的贡献

S-HY, YJ和MS设计了这项研究，并起草和修改了手稿。HJ, V-LT, J-HB, Y-JB, RR进行实验，分析数据，收集样本和数据解释。EN, S-KK和W-SJ对手稿进行了修改并获得了资助。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

资金

本研究由韩国国家研究财团(NRF)向MS提供的基础科学研究计划(NRF- 2022r1c1c1008574)支持。

利益冲突

S-HY和S-KK是高丽人参公社的职员。

其余作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

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参考文献

Aretz, I.和Meierhofer, D.(2016)。系统生物学中基于代谢组谱分析的优势与缺陷。Int。理学。17:632。doi: 10.3390 / ijms17050632