一个肺炎克雷伯菌ndm - 1 +噬菌体:自适应多价和异构生物膜的破坏
艾迪·b·Gilcrease
舍伍德r . Casjens
Ananda保护好
拉梅什高尔- 1大学土木与环境工程系,犹他州,盐湖城犹他,美国
- 2大学生物科学学院的犹他州,盐湖城犹他,美国
- 3微生物学和免疫学、病理学,犹他大学,美国犹他盐湖城
- 4环境科学部门,加州大学河滨分校,CA,美国
噬菌体kl - 2146是一种溶解性病毒隔离感染肺炎克雷伯菌BAA2146,病原体携带广泛抗药性基因新德里metallo-betalactamase-1 (ndm - 1)。在完整的描述,显示了病毒属于Drexlerviridae家庭和属于Webervirus属位于噬菌体的(以前)T1-like集群。其基因组双链(dsDNA)长47844个基点,预计有74个蛋白质编码序列(CDS)。后,挑战各种各样的k .肺炎与噬菌体菌株kl - 2146,生长在ndm - 1阳性菌株baa - 2146,多价是显示一个antibiotic-sensitive应变,k .肺炎13883年,在液体培养最初的感染效率非常低。然而,在一个或多个周期的感染k .肺炎13883年,近100%的感染效率实现,而感染效率对其原始主机,k .肺炎baa - 2146,是降低了。这种宿主特异性的改变是可逆的再次感染ndm - 1积极应变(baa - 2146)使用噬菌体种植在ndm - 1负应变(13883)。在生物膜传染性实验中,多价的本质kl - 2146耐多药和杀害了k .肺炎baa - 2146和非13883年一系列的生物膜。能够感染一个替代,antibiotic-sensitive应变使kl - 2146的有用模型研究噬菌体感染ndm - 1 +应变,k .肺炎baa - 2146。
1。介绍
噬菌体感染细菌的病毒,目前重要的感兴趣的研究人员关心的环境中耐药基因的扩散和增加需要替代疗法(Domingo-Calap Delgado-Martinez, 2018)。这个利益是合理的,在某种程度上,由于噬菌体的积极抗菌性质,负责地球上细菌的营业额的20% (净重2007)。噬菌体摧毁antibiotic-resihreferstant细菌具有相同的功效和其他主机和自动传输的,较低的初始剂量后增加它们的数量成倍增长。噬菌体疗法已被证明有效的治疗危及生命的感染中传统的抗生素都失败了(黄et al ., 2022)与phage-based商用产品,包括品牌如PhageGuard(李斯特菌的控制)或Intralytix(治疗大肠杆菌感染)。尽管有这样的例子,增加支持研究人员和医生认识到潜在的噬菌体疗法,阻碍其广泛实现持久化(Sulakvelidze et al ., 2001;Loc-Carrilloand Abedon, 2011;Brussow 2019)。限制主要包括(1)困难噬菌体有关主机网站以合理的效率,(2)大量的病毒粒子,可能需要有一个效果,和(3)一般有限病毒宿主范围(Sulakvelidze et al ., 2001;Duckworth和Gulig, 2002)。
最后一个障碍,噬菌体宿主特异性,也被认为是噬菌体疗法的优点之一是可能的目标细菌的同时,仍能保留其他具体问题,也许有用,细菌物种。然而,限制噬菌体infectibility单一物种也成为一个挑战,当一个人需要噬菌体疗法适用于多个致病细菌物种或多个细菌co-present环境应用程序(例如,对生物膜或丝状膨胀)。即使在同一物种,细菌的变化可以排除噬菌体治疗的功效,需要精确的诊断以及现有的噬菌体大型银行(尼尔森,2014)。应用广泛的宿主范围是有利的,例如当面对多样化的社区结构存在于生物膜,寻找多价噬菌体(噬菌体感染主机不同的属或物种)正在上升。
虽然从一个物种的细菌生物膜形成,它们通常由多种多样的生物,包括不同种类的细菌、藻类、真菌和原生动物(Wimpenny et al ., 2000;Balcazar et al ., 2015)。在复杂异构这样的社区,最有效的生物膜是为微生物提供物理屏障对环境压力如抗生素和噬菌体捕食(大厅,2017 Mah,)。细胞内生物膜也较少新陈代谢活跃,呈现许多抗菌素无效(斯图尔特,2015)。这些只是几个原因造成细菌感染和工程挑战生物膜的形成是如此难以解决。用抗生素和消毒剂证明他们明确的生物膜的能力有限,噬菌体呈现一个有前途的治疗选择。
这手稿提出了裂解性噬菌体,kl - 2146,孤立从污水处理厂(WWTP)在盐湖城犹他州。它的主人,肺炎克雷伯菌baa - 2146(哈德逊et al ., 2014),原本孤立的从2010年美国医院病人最近在印度的一家诊所接受医疗服务。k .肺炎baa - 2146具有多重抗生素抗性基因在多个质粒(ARG),包括广泛ARG新德里Metallo-β-lactamase 1 (ndm - 1),使其耐大多数已知的抗生素(勇et al ., 2009)。噬菌体kl - 2146确定了多价,它可以感染另一个克雷伯氏菌主机物种,k .肺炎13883年,也就是antibiotic-sensitive。也证明了有效地破坏生物膜具有多个克雷伯氏菌菌株相比另一个孤立的物种non-polyvalent噬菌体感染只有一个应变的能力。
详细研究潜在的有用的噬菌体受益于实验基因淘汰赛,替换,融合,标签,和针对内切酶,如CRISPR (陈et al ., 2019)。因为这些方法主要涉及使用抗生素选择标记在宿主菌株,进行这些实验菌株对抗生素不敏感是非常困难的。出于这个原因,因为固有风险的处理这类细菌噬菌体的能力如kl - 2146感染多个主机(多价),包括antibiotic-sensitive主机,是一种非常重要的功能。这份报告提供了第一个例子中的多价噬菌体感染ndm - 1阳性克雷伯氏菌菌株。它还讨论了一个观察开关主机感染宿主菌株之间的效率K。肺炎baa - 2146和K。肺炎13883年。
2。材料和方法
2.1。主机的特点和发展过程
肺炎克雷伯菌写明ATCC # baa - 2146,具有ndm - 1 (哈德逊et al ., 2014),是一种革兰氏阴性,non-motile、封装、杆状细菌。这个菌株耐大多数已知的抗生素(勇et al ., 2009),与多个窄和广泛的抗生素耐药性基因出现在几个大的质粒。第二个潜在的宿主,kl - 2146测试k .肺炎无性系种群。肺炎写明ATCC 13883 # (Daligault et al ., 2014)。这一毒株具有相同的基本结构特点的ndm - 1 +压力,培养使用相同的方法,没有已知的抗生素抗性。其他菌株用于确定噬菌体的多价kl - 2146包括k .肺炎写明ATCC 35657 # (香鱼et al ., 2014),克雷伯氏菌oxytoccaCCUG # 15788 (辛格et al ., 2016),这是密切相关的k .肺炎临床分离株k .肺炎(19 c5a和19 c6a)来自犹他大学的马特《博士的实验室(《和Simor的职务,2009年)。增长曲线k .肺炎baa - 2146和K。肺炎13883年测定实验从单一的殖民地组织生长在磅(米勒,1972在37°C)。新1:10 0接种文化都摇动了(190 RPM) 37°C和1毫升的样品进行光度测量(OD595年每10分钟)。集落形成单位(CFU /毫升)在指数增长是由冷却样品在冰上10分钟,在LB系列稀释,磅电镀+ 0.7%琼脂。详细的其他潜在的增长曲线没有建立主机,没有产生斑块从噬菌体用于这项研究。
2.2。噬菌体分离、传播、和物理特性
噬菌体kl - 2146从活性污泥分离从污水处理厂获得(犹他州盐湖城)感染k .肺炎baa - 2146使用方法在连续过滤和离心之前描述(Delfan et al ., 2012;保护好et al ., 2017;Hockett Baltrus, 2017)。单个斑块被感染因而孤立和传播相同的主机在液体培养(恩萧et al ., 1976)。噬菌体溶菌产物与氯仿和文化都摇动了离心20分钟6000 g。然后清除溶解产物是效价为下游感染大(500毫升)培养使用莫伊= 10。溶解后,这些文化被隔夜离心浓缩(15302克,JA 16.25贝克曼转子)和resuspended SMG缓冲区(50毫米Tris-HCl pH = 7.5, 100毫米氯化钠,MgSO 10毫米4,0.01%明胶)。噬菌体是由中海等密度的离心净化(恩萧et al ., 1976使用协议中描述)Gilcrease et al。(2020)。噬菌体是分层集中到一个步骤SMG + 10%蔗糖梯度,SMG + 1.4 g / mL中海,和SMG + 1.6 g / mL中海SW41 Ultraclear™SW41贝克曼转子离心管。这些准备然后离心机在220000 g 2小时20°C。乐队含有噬菌体,位于1.4/1.6中海接口,提取了注射器和透析SMG缓冲区使用光谱/为什么™7 50000 MWCO透析膜。DNA提取使用一起噬菌体DNA测序隔离设备(猫# 46800)。蛋白质的成熟病毒粒子与12%丙烯酰胺sds - page凝胶使用可视化Mini-PROTEAN II凝胶系统,一种蛋白质分级标准(基准Thermofisher蛋白质梯。猫# 10748010),和程序中描述普尔酒馆et al。(1991)。基本噬菌体的结构形态是由负染法透射电子显微镜(TEM、模型JEOL jem - 1400)中描述的使用方法Gilcrease et al。(2020)。噬菌体缺乏多价也比较孤立噬菌体感染效率向一系列的生物膜。是孤立的k .肺炎13883使用前面描述的方法,只会使斑块应变。这non-polyvalent应变,称为噬菌体kl - 13883,并没有进一步描述在这个研究。详细的一步生长曲线分析噬菌体kl - 2146 (n= 3)是由感染100毫升主机在指数增长阶段(OD文化595年在37°C = 0.5),感染复数(MOI) 10噬菌体/集落形成单位(CFU)。这高于典型莫伊确保所有细菌感染(Nale et al ., 2021)和莫伊用于大型批量噬菌体净化是一样的。这产生的总溶解后第一轮感染并允许易于确定空斑形成单位(PFU) /细胞使用CFU /毫升已知感染时从先前的细菌生长的分析。两个1毫升样品然后每10分钟,其中一个是涡与100年μL氯仿。然后离心5分钟在6000年克,转移到新鲜的埃普多夫管,连续稀释,而使用琼脂覆盖法(Hockett Baltrus, 2017)。生长曲线绘制PFU产量除以细菌浓度在文化、确定实验是1.2×108在OD CFU /毫升595年= 0.5 (图1)获得空斑形成单位/细胞。在其他实验感染效率比较,一个使用莫伊= 0.026,采集标本后只有70分钟的感染进行比较分析。这是详细的增长曲线显示最大溶解后发生第一轮复制的文化。空斑形成单位(PFU)可视化使用琼脂覆盖法和量化。
图1。(一)(n= 3)生长曲线的比较k .肺炎13883年,NDM1 +压力k .肺炎baa - 2146。在指数增长阶段表示,CFU /毫升(B1)TEM的噬菌体kl - 2146,(B2)13%丙烯酰胺中海的sds - page凝胶纯化噬菌体kl - 2146隔绝k .肺炎baa - 2146和k .肺炎13883(分别)。在乐队观察模式没有区别,(C)(n= 3)一步生长曲线噬菌体kl - 2461感染k .肺炎baa - 2146。
2.3。噬菌体kl - 2146基因组测序、组装和注释
病毒DNA提取后,质量由16 s rDNA PCR扩增(确保没有宿主DNA污染)和分光光度法(热科学量化。NanoDrop 1000)。Illumina公司TruSeq DNA库制备(450意味着插入大小)UDI进行,其次是Illumina公司MiSeq 150 -周期paired-end在犹他大学的产量很高基因组测序核心设施。303年大约29日paired-end读取都基于一个28岁,质量分数(phr分数)新创装配使用软件(Geneious™)。GeneMarkS (Besemer et al ., 2001)预测基因被用来搜索NCBI冗余(nr)守恒的域,齿轮,InterPro数据库和注释使用Blast2GO 2.5.0 (Conesa et al ., 2005伴随人工管理。阿拉贡(Laslett Canback, 2004)和tRNAScanSE (Schattner et al ., 2005)是用于检测tRNA基因。噬菌体kl - 2146国防部(kl - 2146 re-isolated 13883株)的制备,新创组装,并分析了使用相同的程序在33212年削减paired-end读取。比较分析的序列数据噬菌体kl - 2146和kl - 2146国防部是通过使用Snapgene™。分类被告知使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)的959个基点主要负责人基因(H1O04_gp48)对NIH序列数据库。
2.4。切换的宿主特异性和研究多价
调查多价和观察到的切换的宿主特异性,噬菌体分别与kl - 2146不同的感染克雷伯氏菌主机。噬菌体kl - 2146上传播k .肺炎baa - 2146从单个斑块称为kl - 2146。kl - 2146国防部是由传播kl - 2146k .肺炎13883年。在kl - 2146国防部,k .肺炎13883年是用于个人的孤立斑块kl - 2146 (MOI = 0.26)。这允许斑块扩散到1毫升磅过夜,然后使用50毫升的感染k .肺炎13883年生产效价股票。这只股票后来被用来制造更大,cesium-purified噬菌体制剂在13883年的压力。在随后的实验中,纯化的kl - 2146国防部,感染k .肺炎13883年近100%的感染效率,用于感染原来的主机,k .肺炎baa - 2146。类似于kl - 2146国防部隔离,导致感染的斑块,并用于使再感染k .肺炎baa - 2146年文化。新的噬菌体股票称为kl - 2146新。这些实验的空斑形成单位/毫升值给定平均从[n≥3]实验重复。
2.5。一系列的生物膜感染
包含两个主要的异构生物膜k .肺炎菌株生长使用两种不同的方法。在第一种方法,生物膜生长在显微镜玻片改编自使用方法保护好et al。(2015)。来弥补固有增长率到13883年,更多的压力比增长较快的baa用来接种文化- 2146菌株。因此,25毫升的磅是接种1:10 0隔夜的文化k .肺炎13883年和摘要k .肺炎baa在50 - 2146毫升锥形管。75毫米×25毫米玻璃幻灯片插入文化管和孵化在直立位置在一夜之间在37°C。媒体被小心翼翼地将幻灯片包含新鲜管磅每24 h 4天。
在这个时候,噬菌体kl - 2146 kl - 2146国防部kl - 2146新和kl - 13883增加到25毫升新鲜的最终浓度1×10磅7在四个独立的50毫升锥形管。五分之一管是没有噬菌体作为控制准备的。玻璃幻灯片包含生物膜被淹没在媒体+噬菌体12 h 37°C。幻灯片然后通过仔细在PBS溶液浸泡清洗。CFU量化的两个菌株存在于生物膜后6天,只是在染色之前,样品的生物膜被刮的CFU分析在幻灯片使用1厘米宽的中心金属刮刀。上的生物膜物质抹刀然后转移到1毫升的冰冷的磅1.5毫升埃普多夫管。样本连续稀释和电镀两琼脂+磅盘子,一个50μg /毫升氨苄青霉素和其他“任何药物。“一夜之间,盘子被孵化37°C,第二天和菌落数。
上述取样后立即生物膜的幻灯片,幻灯片浸入一个固定甲醇浴,空气干燥,用革兰氏染色法染色工具包(布朗和Brenn猫# KTBBR)后提供的指令。生物膜的照片被使用在100 x光显微镜放大。
对于第二种方法,使用一个定制的滴流动反应器生物膜生长。显微镜玻片被播种6 h在室温25毫升的1:10 0主机文化50毫升锥形管。被放置在一个轻微的角度陷入滴流动反应器,磅媒体被允许滴在幻灯片(1.5毫升/小时)的速度使用蠕动泵为4天。幻灯片被洗在PBS和染色使用Baclight细菌生存工具包(表达载体猫# L7012)按手册中包含的说明。生物膜被可视化使用尼康宽视野显微镜60 x放大。
2.6。透射电子显微镜法
TEM可视化,1×1011空斑形成单位/毫升的集运纯化噬菌体在SMG透析缓冲区。3μL混合物是铺设在Formvar 200目铜网格,20年代之前进行了等离子体电离治疗。1分钟后,多余的噬菌体的解决方案是用滤纸移除。3μL 1%醋酸双氧铀是添加到网格,留给45 s,并提取滤纸。所有负染色TEM图像获得使用TEM模型JEOL jem - 1400。
2.7。统计分析
至少3技术重复的平均菌落和空斑形成单位值,标准差酒吧或错误的百分比。确定统计差异的斑块数量增长曲线的结果,单向分析(方差分析、Excel)之间进行了两个不同的数据集。意义确定的α水平0.05 (p≤0.05)和标准设置(n≥3]给出的数据。
3所示。结果
3.1。结构和孤立的裂解性噬菌体与宿主的生长特征
在所有的实验中,细菌菌株k .肺炎13883年观察到的增长慢于baa - 2146落后baa在达到对数期- 2146 ~ 30分钟,见的生长周期图1一个。k .肺炎35657年,k . oxytocca和测序的临床分离株k .肺炎19 c5a和19 c6a增长率相似k .肺炎baa - 2146(数据未显示)。
所有的kl - 2146分解动作用于这项研究(kl - 2146 kl - 2146国防部,kl - 2146新)有着相同的病毒形态由负染色TEM;因此只有kl - 2146提供的图片(图1 b1)。在TEM, kl - 2146结构观察是Drexlerviridae家族(以前的成员Siphoviridae)拥有一个等距头直径约60 nm和~ 150 nm长丝状,non-contractile尾巴。利用sds - page分析纯化后的kl - 2146病毒粒子(图1 b2显示7个可观察到的结构蛋白。kl - 2146和kl - 2146国防部(此句噬菌体分离在不同的菌株k .肺炎)不显示任何大小或数量的差异蛋白sds - page的乐队。噬菌体kl - 2146所示一步生长曲线的释放量约142微升/细胞世代时间约30分钟,噬菌体所示的生长周期图1 c。是致命的(或裂解)噬菌体基于明确斑块形成和缺乏基因序列分析中发现可能表明溶原性的生活方式出现在装配序列,如整合或对位/ B基因(爱默生et al ., 2012)。
3.2。噬菌体基因组测序和分析
描述kl - 2146和的遗传组成进行系统发育分析,全基因组测序的纯化噬菌体通过Illumina公司,与完整基因组存入基因库下加入MN379832数量。kl - 2146 G + C基因组长47844个基点和50.8%与圆形排列。七十四编码的蛋白质在基因组注释,包括一个可辨认的大型terminase主要衣壳蛋白,几尾蛋白质包括尾巴卷尺,溶解蛋白质、蛋白质和核酸代谢包括DNA解旋酶,引发酶,单链DNA结合蛋白,核酸外切酶、DNA甲基化酶。基因组序列分析发现噬菌体kl - 2146的一员Webervirus属在以前所谓的T1-like集群尾随噬菌体(Casjens格罗斯,2016)或Tunavirinae。
3.3。噬菌体传染性其母主机和其他菌株
kl - 2146被证明是高度传染性宿主baa - 2146(隔离)的原始主机,30分钟后完全溶解文化可见莫伊= 10感染或感染莫伊= 0.026的90分钟。评估多价属性,噬菌体kl - 2146传染性是使用各种测试k .肺炎压力系统类似于baa - 2146 (补充表1)。使用空斑叠加的方法,一个微弱的清除的细菌在现场测试k .肺炎35657在低稀释,但没有产生斑块。没有模糊结算集中溶解产物或观察斑块试图感染菌株k .肺炎临床分离株19 c5a 19 c6a或k . oxytocca压力。在压力测试中,只有k .肺炎菌株13883显示明确证据的感染(斑块的形成)。kl - 2146因而被认为是多价噬菌体,它可以感染不同的菌株,或型,k .肺炎。然而,斑块kl - 2146的浓度k .肺炎13883年产生显著减少空斑形成单位(大约1.6%)比原始主机上的效价k .肺炎baa - 2146。七十分钟的感染baa - 2146年和13883年被进行并行使用原来的氯化铯密度梯度纯化噬菌体kl - 2146被孤立使用baa - 2146作为主机。在这些液体培养感染,这些噬菌体传播baa 13883 - 2146时显示感染产生更低的收益率(0.17%)而感染的baa - 2146t= 70分钟(图2)。观察收益率之间的差异直接空斑实验噬菌体和斑块化验进行液体培养感染后仍不清楚,但可能是由于(1)更有利的接触条件(例如,更多的时间用于附件)的条件下直接滴定或(2)初始破裂大小的差异不会观察到的直接滴定法(或阻碍)噬菌体收益率下降以来从第一轮感染会产生相同数量的斑块在一夜之间高/正常产量。评估是否kl - 2146感染效率仍将阻碍从13883或隔离后成为适应新的宿主,感染通常,斑块从低效率的13883例确诊病例进一步传播13883年的液体培养。浓度和净化后,得到的噬菌体(现在叫kl - 2146国防部)被发现感染正常的效率对这种新的13883主机毒株,PFU收益率近似kl - 2146感染baa - 2146 (图2)。kl - 2146国防部(以13883年为新的主机)噬菌体,因而“驯化”举办13883年显示后,减少了特异性对原来的主机,baa - 2146。这是实验中观察到的噬菌体kl - 2146国防部,再次纯化从感染的13883年,是生产低噬菌体收益率(~ 15.4%)感染原baa - 2146菌株(图2)。为了确定特异性kl - 2146国防部对baa - 2146菌株可以获得丢失后,从噬菌体溶菌产物kl - 2146国防部效价在原始主机baa - 2146。斑块被孤立,baa - 2146主机上进一步传播,由此产生的股票现在称为噬菌体kl - 2146新。这是用于感染baa - 2146。70分钟后,PFU baa的感染与kl - 2146 - 2146新溶菌产物确实显示了一个逆转的总infectability baa - 2146菌株(图2)。
图2。(n= 3)感染k .肺炎13883和baa - 2146使用cesium-purified噬菌体kl - 2146(原隔离由baa - 2146,感染ndm - 1 +应变)和kl - 2146国防部(股票由噬菌体感染的13883株)。kl - 2146新从噬菌体溶菌产物kl - 2146吗国防部传播在baa - 2146。这个测试的能力kl - 2146国防部获得宿主特异性baa - 2146。DT =直接滴定到主机的草坪。LCT = 70分钟后滴定液体培养感染。百分比值从空斑形成单位的浓度进行比较(新菌株/亲本菌株)。误差棒表示标准偏差。
3.4。一系列的生物膜的感染
组成的异构生物膜细菌从两个不同的菌株k .肺炎构建演示多价病毒感染的相对效率和non-polyvalent当两个宿主菌株感染。生物膜是显微镜载玻片上开发使用浸和滴流方法和可视化用革兰氏染色剂和Baclight生存装备,分别。证实了生物膜异质性CFU计数的感染控制氨苄青霉素板块(1×107/毫升±3×106),英国机场管理局(1.8×10 - 2146和无毒盘子7±2×106细菌的总数。这表明一个近似1:1的比例baa - 2146与13883年antibiotic-sensitive应变,给出误差。生物膜感染实验,相对于未受感染的生物膜控制、幻灯片接触多价噬菌体主要是清除的生物膜感染菌株(图3)。背光/病死颜色标签表明,幻灯片上的相对剩余一些细菌感染后使用混合菌噬菌体已经死了。没有观察到的差异多价隔离kl - 2146 kl - 2146国防部,kl - 2146新关于清理一系列生物膜的功效。non-polyvalent噬菌体生物膜滑动接触,kl - 13883,清除显示显著低于未感染控制由于其只感染的能力k .肺炎13883株。幸存的CFU值几乎相同的未感染的控制,这意味着快速更换13883的耐药菌株。这表明混合菌菌株更有效地清除一系列生物膜non-polyvalent应变,无论低效率的初始感染主机或另一个。
图3。六天的异构生物膜k .肺炎13883年,baa 1×10 - 2146被感染7噬菌体/毫升12 h。上面一行:幻灯片播种与细菌和淹没新的媒体(取代日报)在100 x是革兰氏染色和可视化。底下一行:60 x放大的生物膜滴流动反应器(顺序上图)沾BacLite。绿色=生活,红色=死。生物膜破坏了所有的幻灯片后除了控制和感染non-polyvalent噬菌体kl - 13883。CFU值(n从约6厘米= 3)2采样的滑动表面resuspended 1毫升磅。误差百分比标准偏差/ CFU。
4所示。讨论
4.1。噬菌体基因组结构和
这一分析的时候,有133的完整基因组Weberviruses在公共数据库,其中大部分适合一打子组家庭之前调用Tunavirinae(Korf et al。(2019)和未发表的结果)。图4显示的例子7这些子组,大胆的横线隔开。kl - 2146适合的子群称为“subcluster D”(格罗斯和Casjens, 2014)或“Webervirus“属(以前KP36like属),但其中一个感染k .肺炎(Mishra et al ., 2012;待遇et al ., 2015)。在kl - 2146的近亲是噬菌体Sanco (MK618657) MezzoGao (MF612072) GML-KpCol1 (MG552615), KPN N141 (MF415412), kl - 2146 pn1 (KT001920) KpKT21phi (MK278861) F20 (NC_043469.1)和NJR15 (MH633487),被孤立在德克萨斯州,马里兰、土耳其、韩国、爱尔兰、以色列、俄罗斯、分别和中国(Nir-Paz et al ., 2019;理查森et al ., 2019;祖拉波夫和Zhilenkov, 2019;霍et al ., 2020)。这群密切相关克雷伯氏菌噬菌体,> 95%相同的核苷酸序列,似乎是常见的和非常广泛的地球。kl - 2146基因组不同的特性,使其特别适应宿主防御。kl - 2146,喜欢的很多Webervirus噬菌体,明显缺乏限制股票网站如HindIII NsiI, NcoI PaeI, SnaBI (Hockett Baltrus, 2017)和表达自己的DNA腺苷酸甲基转移酶(kl - 2146 _2)表明类似的限制逃避策略的大肠杆菌噬菌体T1 (奥氏小体和Schweiger, 1984年)。此外,研究克雷伯氏菌噬菌体,噬菌体KP36,编码的tail-spike capsule-targeting解聚酶能够降解细菌的(AXI63_gp50)胶囊和生物膜(Majkowska-Skrobek et al ., 2016)。kl - 2146尾蛋白质H1O04_gp67 90.32%相同的蛋白质。
图4。点矩阵分析中的噬菌体基因组DNA比对T1-Cluster噬菌体,由一个单词长度设置使用Gephard 13 (Krumsiek et al ., 2007)。从基因库的序列显示,噬菌体在T1-cluster(之前所知的多样性Tunavirinae)。对角线的连续性表明序列相似性噬菌体基因组。主机属是颜色编码。子群D包含最近的亲戚的kl - 2146Webervirus属。
4.2。噬菌体感染效率向主机
适应宿主特异性发现,最佳的感染效率似乎在主机之间来回切换,是有趣的和必要的进一步探索。噬菌体逃避宿主防御和获得新的宿主特异性使用各种策略。这些包括受体结合蛋白的进化tail-spike或tail-fiber区域允许识别的新主机,DNA甲基化和DNA序列修改,防止主机限制性内切酶和CRISPR-acquired免疫(莱柏瑞et al ., 2010)。几次因而分析机制这个可逆开关主机感染效率的实验数据。(1)避免限制:限制修改(RM)系统在已知干扰噬菌体感染细菌。在这些系统中,细菌的DNA被修改特定序列的甲基化,防止主机核酸内切酶行动序列,同时允许目标退化unmethylated外国(如病毒)可能进入细胞的DNA,从而流产感染(格里高利et al ., 2010)。在这些情况下,一个噬菌体可能有效地附加到主机,但缺乏host-derived DNA甲基化模式,将无法成功地完成感染。这可以克服低频罕见的感染事件时允许进入的病毒DNA逃脱DNA限制和获得感染的甲基化模式在单轮,从而产生后代,RM对主机系统(莱柏瑞et al ., 2010)。这是与kl - 2146的观察结果一致图2关于其反复宿主特异性和是最可能的解释。噬菌体的多样性、restriction-modification系统和宿主细胞很难提供一个通用的频率限制避免。这种现象用restriction-sensitive噬菌体λ突变体的研究表明这通常发生在一个较低的频率,0.1 - -0.00001% (乔木,1965;Rambach Tiollais, 1974)比在这里观察kl - 2146 (1.6%)。健壮的kl - 2146(即限制避免机制。,lack of restriction sites in the genome) may increase the frequency of this avoidance beyond expectations, however. (2) Differences in Host Growth Rate: While in all infectivity experiments, the bacterial straink .肺炎13883年增长慢于baa - 2146 (图1一个),这似乎并不影响感染的产量增长放缓kl - 2146国防部在传播k .肺炎13883年。这表明,13883年的经济增长放缓而baa - 2146不是一个因素在kl - 2146年观察到的噬菌体收益率下降13883感染。3所示。主机偏好改变的突变:这些实验,样品被感染的70分钟后,表明收购总感染效率之前或之后发生感染的第二轮。随机突变频率不太可能可以解释观察到的主机开关在这个时期。无论如何,以决定是否KL2146国防部获得了感染效率反对k .肺炎13883年通过突变,这种隔离的全基因组序列分析(kl - 2146国防部斑块生长在13883株)。这个序列的DNA序列比对kl - 2146基因组显示只有一个碱基对同义替换这不是预测影响宿主特异性(图5)。总之,主机切换机制似乎是最接近限制避免,鉴于其行为一致性与了解的现象,考虑到其他机械的候选人都被排除了。
图5。对齐的kl - 2146国防部(kl - 2146生长k .肺炎与原kl - 2146株(13883)生长在k .肺炎baa - 2461)。假设蛋白质被排除在外。只有一个同义突变(黑色箭头)。
5。结论
噬菌体kl - 2146显示能够感染菌株baa - 2146和13883年以同样的效率只有在单个步骤的低效的传播其他菌株,使它可能有用的模型系统研究噬菌体感染ndm - 1 +的病原体。该研究将受益于多价态包括噬菌体感染ndm - 1进行比较研究。孤立地观察到,然而,这些噬菌体的废水有大幅减少噬菌体感染应变比antibiotic-sensitive ndm - 1菌株和更少受多个菌株,包括ndm - 1菌株。事实上,kl - 2146是唯一成功孤立的多价噬菌体的传播者k .肺炎ndm - 1 +。这也许是信息丰富的抗药细菌这类废水中的隔离源(Yahya et al ., 2015)。
的扩散肺炎k . ndm - 1 +和其他广泛耐药性菌株在选择性水库(如医院和污水处理厂)立即关注,定期与多药耐药性基因成为WWTP废水和更大的生态系统(亚历山大et al ., 2020)。噬菌体是潜在的一个有效的和生态安全的抗菌工具,剩下为数不多的能够控制WWTPs这种细菌的数量。此外,他们可以这样做有针对性的方式,保留那些细菌种群所必需的治疗过程。需要更多的研究来有效地利用噬菌体的抗菌性质等实际使用的应用程序。病毒多价是一种财产,不仅允许感染主机之外的一个菌株和增强去除生物膜,但也允许的详细研究和遗传操作噬菌体感染这些细菌,尤其是那些有广泛的抗生素抗性。这将会是非常困难的由于缺乏可用的选择性标记(如抗生素抗性基因)可用抗宿主。利用多价antibiotic-sensitive应变和开展研究工作,现代DNA编辑方法可用于构建噬菌体与增强的传染性、药物输送功能,编辑和DNA等机制CRISPR目标和消除特定的宿主基因(Gholizadeh et al ., 2020)。噬菌体的研究和表征kl - 2146因此环境的一个重要的新兴领域噬菌体疗法。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以发现:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/,MN379832。
作者的贡献
AB的初始隔离和测序进行kl - 2146。AB和如传播/纯化噬菌体和生长曲线进行研究。SC、AB和如噬菌体基因组进行分析。如多价的研究设计和执行序列和DNA分析kl - 2146国防部和噬菌体的结构分析。如和AB起草了手稿,RG回顾。所有作者的文章和批准提交的版本。
确认
作者感谢戴夫Belnap犹他大学的生物化学部门援助与透射电子显微镜。作者还想承认马特。《从犹他大学的病理学部门分享non-NDM不同克雷伯氏菌菌株。这项工作是由美国国家科学基金会支持格兰特# 1804158授予RG。表达的观点在这个手稿的作者,不一定反映任何资助机构的认可。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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缩写
新德里metallo-betalactamase-1 ndm - 1;dsDNA,双链脱氧核糖核酸;K, Klebsiell;一个菌落,菌落;PFU,空斑形成单位;国家卫生研究院,国立卫生研究院;爆炸,基本的局部比对搜索工具;莫伊,感染复数;写明ATCC,美式文化集合;CCUG、文化收集哥德堡大学; SMG, Saline Magnesium Gelatin; LB, Luria Broth; PCR, Polymerase chain reaction; TEM, Transmission electron microscopy; p, probability; n, number of repeats. SDS-PAGE; mod, modified; RM, Restriction modification.
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关键词:裂解性噬菌体,抗生素耐药性,肺炎克雷伯菌ndm - 1, polyvalency
引用:Gilcrease EB, Casjens SR,保护和高尔R (2023)肺炎克雷伯菌ndm - 1 +噬菌体:自适应多价和异构生物膜的破坏。前面。Microbiol。14:1100607。doi: 10.3389 / fmicb.2023.1100607
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