腺嘌呤/ thymidine-rich区域积分RepL-mediated DNA复制
杨威欢
拉塞尔•布朗1和
宝骏王- 1生物科学学院、爱丁堡大学、爱丁堡,英国
- 2化学与生物工程学院& ZJU-Hangzhou全球科技创新中心、浙江大学、杭州,中国
- 3生物计算研究中心、浙江实验室,杭州,中国
裂解性噬菌体P1的复制需要RepL表达式和裂解阶段起源、oriL,假定位于repL基因序列。的确切顺序P1 oriL RepL-mediated DNA复制的机制(s),然而,并不完全理解。通过使用repL基因表达的诱导DNA复制绿色荧光蛋白和一个招标书记者质粒,我们证明了同义替换的腺嘌呤/ thymidine-rich地区的基地repL基因序列,称为at₂,显著抑制了RepL-mediated信号放大。与之相反,突变IHF和两个DnaA结合位点并不影响RepL-mediated信号显著放大。一个截repL序列与at₂地区允许RepL-mediated信号放大在反式因此验证at₂地区的一个重要的角色在RepL-mediated DNA复制。的组合repL基因表达和non-protein-coding副本repL基因序列(称为数控-repL)能够放大的输出一个砷生物传感器。此外,突变(s)在单个或多个位置at₂区域内产生不同程度的RepL-mediated信号放大。总体而言,我们的研究结果提供了新颖的见解P1 oriL的身份和位置以及演示使用的潜力repL结构增强和调节基因生物传感器的输出。
介绍
噬菌体P1温和噬菌体,可以在其宿主细胞以及lysogenise切换到的噬菌体裂解周期生产后代(Yarmolinsky和斯特恩伯格,1988年)。P1溶原性和溶解性之间的决策阶段的生命周期是由多种环境因素及其免疫电路,形成一个复杂的网络调控的水平C1抑制因子及其拮抗剂、细胞色素氧化酶(奥斯汀和亚伯,1983年;1989年汉森;海因里希et al ., 1995 a)。P1经由有两个,一个是前噬菌体的复制子含有一个复制称为oriR起源,维护基因组作为低拷贝数质粒溶原性周期期间,和一个单独的溶解性包含溶解阶段复制起源的复制子(oriL), DNA复制的启动在裂解周期(戈夫et al ., 1980;奥斯汀和亚伯,1983年;沃克,沃克,1983;1989年汉森;斯特恩伯格和科恩,1989;科恩et al ., 1996)。的溶解性复制子称为P1包含两个蛋白编码基因kilA和repL,其启动子称为P53基因表达调控,并可能由其他两个预测启动子称为PkilA和PrepL(科恩和斯特恩伯格,1989年;1989年汉森;斯特恩伯格和科恩,1989;Łobocka et al ., 2004)。P53启动子的转录抑制C1阻遏的绑定操作符序列,称为Op53,重叠子因此抑制kilA和repL基因表达在溶原性阶段(Eliason和斯特恩伯格,1987年;Velleman et al ., 1987)。的功能kilA基因产物是未知的但不是必不可少的P1溶解性表达时复制而致命大肠杆菌细胞(斯特恩伯格和科恩,1989;海因里希et al ., 1995 b)。与之相反,转录的远端repL基因对P1裂解阶段DNA复制(至关重要1989年汉森;斯特恩伯格和科恩,1989;海因里希et al ., 1995 b;科恩et al ., 1996)。
的确切位置和序列P1 oriL尚不清楚。P1基因序列的分析揭示了急剧变化在GC偏态3′的地区repL基因,恰逢两DnaA结合位点,因此前IHF绑定图案表明这个地区可能包含oriL序列(Lobry 1996;Łobocka et al ., 2004)。P1裂解周期期间,DNA复制启动一个在θoriL模式(θ),其次是占主导地位的滚环复制模式(σ)裂解生命周期的后期(科恩,1983)。虽然DNA复制的θ模式最有可能预测oriL在启动repL基因序列,滚动循环复制可能开始在其他网站(Łobocka et al ., 2004)。另一个可能的位置选择和/或额外的oriL谎言中rlf操纵子位于下游的repL,其中包含两个预测IHF结合位点(Łobocka et al ., 2004)。另外,滚动循环复制可能启动从DNA引入尼克P1 DNA包装酶(pacase)pac,这是规范P1 DNA包装信号(斯特恩伯格和Coulby, 1990)。
的repL基因产物是假定oriL启动DNA复制,坐落在其编码序列(1989年汉森;海因里希et al ., 1995 b;科恩et al ., 1996)。因此,感应repL基因表达会增加基因拷贝数在独联体,这可能是适应增加质粒的拷贝数。Nat的早期研究斯特恩伯格(1990)证明isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside IPTG诱导的虫胶监管P1裂解复制子可以放大质粒拷贝数的编码结构。在最近的研究中,感应的repL基因表达了放大质粒的拷贝数,从而表明了独联体表演,RepL-mediated DNA复制可以复制大肠杆菌不需要其他P1-derived因素(Sheth et al ., 2017;Dwidar Yokobayashi, 2019)。此外,Sheth et al。(2017)表明,密码子优化的repL基因序列减少了独联体作用,DNA复制,而蛋白质产品可以放大另一个质粒的拷贝数轴承非蛋白编码repL序列在反式。因此,RepL表达式可以脱离独联体代理质粒放大效应,通过引入突变破坏预测的oriL位于repL基因序列(Sheth et al ., 2017)。一致地,李et al。(2023)证明RepL表达式可以增加质粒的拷贝数,放大的信号大肠杆菌基于(3)生物传感器因此指示等构造一个信号放大器的潜在用途大肠杆菌细胞基因电路。
而使用RepL-mediated DNA复制增加质粒拷贝数在独联体和在反式被证明之前,P1的身份oriL,DNA复制RepL-mediated背后的分子机制仍然不明。我们假设区域内(s)repL基因序列的DNA复制RepL-mediated P1的代表oriL。因此,我们已经生成了绿色荧光蛋白记者提供P质粒坏监管,repL基因表达,从而允许评估实验室的RepL蛋白质的活动大肠杆菌(科尔曼et al ., 1977)。阿拉伯糖诱导repL基因表达增加了GFP荧光强度从而表明RepL-mediated放大的绿色荧光蛋白质粒拷贝数。此外,感应repL基因表达增加的输出招标书记者质粒含有非蛋白编码repL序列,因此展示RepL-mediated DNA复制在反式。同义替换下半年的基础repL基因显示一个腺嘌呤/ thymidine-rich区域(称为at₂以下)为RepL-signal放大是非常重要的。我们表明,截repL序列包含at₂地区允许RepL-mediated信号放大在反式。综上所述,我们的数据表明最小区域内repL可以作为基因包括at₂RepL-mediated质粒DNA复制的目标站点大肠杆菌因此缩小的潜在位置P1oriL。此外,单个或组合中的同义突变at₂地区产生了不同程度的反式表演,RepL-mediated信号放大,可以扩大到调节基因电路的输出信号。坚持,我们的列表repL和nc -repL构造提供放大和在实验室生物传感器输出应变的调制大肠杆菌,因此证明可能利用我们的合成生物学领域的结构提供一个理想的输出电平的信号放大。
结果
一个绿色荧光蛋白记者分析识别DNA序列(s) RepL-mediated DNA复制所必需的
虽然P1裂解阶段DNA复制的分子机制尚不清楚,repL基因产物被认为是启动DNA复制,通过针对oriL假定位于下半年repL基因序列(1989年汉森;斯特恩伯格和科恩,1989)。我们已经确定了两个24 bp和43 bp腺嘌呤/ thymidine-rich下半年的地区repL基因序列称为AT1和at₂以后(~ 70 ~ 80% / T分别组成),毗邻DnaA结合位点注释的一项研究(Łobocka et al ., 2004;图1一个;补充图1)。一段~ 20 bp / T-rich序列,也称为DNA解除元素(费),促进DNA变性在细菌复制起源由于其螺旋不稳定性(松井et al ., 1985;Coman Russu, 2005;Rajewska et al ., 2012)。AT1地区与先前确定IHF结合位点,可能参与促进DNA复制和其他pre-replication蛋白质复合体的组装,类似报道IHF的角色大肠杆菌oriC (瑞安et al ., 2002;家et al ., 2021)。此外,at₂区域包含一个13-mer喜欢主题3′端(5 ' -GATCTTTTTGTTT-3′)的共识GATCTnTTnnTTT重复促进DNA双融化了大肠杆菌oriC host-derived存在的因素(Bramhill科恩伯格,1988年)。因此,我们假设这两个/ T-rich区域和DnaA结合位点可能RepL-mediated DNA复制过程中发挥重要作用。Plasmid-derived, RepL表达了放大向量拷贝数在独联体(Sheth et al ., 2017;Dwidar Yokobayashi, 2019)。这样的向量可以用来识别如果/ T-rich区域和/或DnaA结合位点RepL-mediated DNA复制中起着重要的作用。因此,评估的水平RepL-mediated DNA复制方法,我们设计了一种低拷贝数,绿色荧光蛋白编码包含一个记者质粒repL基因由阿拉伯糖诱导启动子控制的P坏(图1 b)。阿拉伯糖诱导repL基因表达在大肠杆菌促进记者质粒DNA复制吗在独联体。因此,RepL活动水平将由增加GFP荧光信号,相比uninduced状态(图1 c)。
图1。一个绿色荧光蛋白记者质粒评估RepL-mediated DNA复制过程大肠杆菌。(一)的位置(相对于核苷酸位置repL开放阅读框,第一个核苷酸,核苷酸的AT1 at₂, DnaA结合位点1和2显示为数字)和序列/ T-rich区域1和2 (AT1、at₂、光橙色),IHF结合位点(浅蓝色),DnaA结合位点1和2 (DnaA 1, DnaA 2,浅绿色)在下半年repL基因(浅蓝色箭头)。这些DNA的元素的位置相对于完整的长度repL编码序列所示补充图1。(B)原理图的gfp.repL记者构造。repL(浅蓝色箭头)基因表达是由arabinose-inducible启动子控制的P坏。24 bp的编码序列kilA包括,这提供了本地核糖体结合位点(RBS)repL翻译(Sheth et al ., 2017)。oriL,裂解阶段复制起源假说是坐落在下半年repL基因。绿色荧光蛋白(绿色)表达式是由组成型启动子Bba_J23115疲软,RBS30人造核糖体结合位点。质粒可提供氨苄青霉素抗性,并有pSC101让奥赋予较低的质粒拷贝数。(C)原理图描述RepL-mediated GFP信号放大过程。阿拉伯糖诱导的RepL表达式non-P1溶原性的大肠杆菌将推动DNA复制的质粒在独联体在先前的研究证明(Sheth et al ., 2017;Dwidar Yokobayashi, 2019)。因此,水平独联体表演,RepL-induced质粒复制可以测量方法,这将是由GFP荧光强度的增加相比uninduced状态。
阿拉伯糖诱导repL基因表达增加的输出信号绿色荧光蛋白质粒编码记者
评估如果感应repL基因表达可能增加的输出信号绿色荧光蛋白记者质粒,大肠杆菌全球细胞被改变了的gfp.repL记者质粒和转化株诱导L-arabinose浓度范围。GFP荧光强度以及OD600年细胞的测量在一段10 h,和最终的输出表示为每OD GFP荧光强度600年(Fluo. / OD600年)。
GFP Fluo. / OD的增加600年的gfp.repL转化株后观察5 h后感应(hpi)阿拉伯糖的浓度,相比uninduced状态(图2一个)。1.33×10−4M L-arabinose浓度最低的要求给出一个最大~ GFP FIuo. / OD的12倍600年现病史值10点,相比uninduced状态(p< 0.0005)。与之相反,阿拉伯糖诱导的绿色荧光蛋白质粒不repL基因没有增加GFP FIuo. / OD600年全球的值转化株在所有时间点后感应相比uninduced状态(p> 0.05)(补充图2 a, B)。此外,取代之前的53个基点kilA编码序列和中等强度的场合,人造核糖体结合位点,RBS32,降低了最大GFP FIuo. / OD600年5到10之间的价值~ 9.2倍1.33×10的快乐指数−3M和1.33×10−4阿拉伯糖(p< 0.0005)(补充图3 a, B)。由于阿拉伯糖浓度的进一步增加没有改善GFP FIuo. / OD600年值(p> 0.05),1.33×10−4米被选为最佳的阿拉伯糖诱导的浓度repL基因表达在大肠杆菌全球(图2 b)。全球的感应gfp.repL转化株为1.33×10−31.33×10 M−4M树胶醛醣OD平均收益率600年现病史在8 ~ 0.5,显著降低相比,平均OD600年uninduced ~ 2.0记录的状态(p< 0.0005)(图2 c)。相反,平均OD600年全球的绿色荧光蛋白或绿色荧光蛋白.RBS32 -repL在8 ~ 2.0 ~ 1.8分别,hpi与1.33×10−31.33×10 M−4阿拉伯糖(图2 d;补充图3 c)。
图2。阿拉伯糖诱导repL基因表达增加了一个记者的GFP信号质粒。(一)每个OD GFP荧光强度600年(FIuo. / OD600年)大肠杆菌全球gfp.repL转化株,在1到10 3.33×10的快乐指数−6米(紫色和灰色圆圈),1.33×10−5米(棕色和黑色钻石),3.33×10−5(绿线用黑色三角形),1.33×10−4米(橙色与黑色三角形),3.33×10−4米(红色与黑色方块),1.33×10−3M L-arabinose(蓝色与黑色圆圈)。GFP FIuo. / OD600年值uninduced细胞(w / o树胶醛醣,在黑色与黑色三角形)添加了用于比较。(B)GFP FIuo. / OD600年全球的转化株8 3.33×10的快乐指数−6米,1.33×10−5米,3.33×10−5米,1.33×10−4米,3.33×10−4米,1.33×10−3L-arabinose M。(C)的OD600年全球的gfp.repL转化株,(D)绿色荧光蛋白只有转化株,在1到10 hπ为3.33×10−6米(紫色和灰色圆圈),1.33×10−5米(棕色和黑色钻石),3.33×10−5(绿线用黑色三角形),1.33×10−4米(橙色与黑色三角形),3.33×10−4米(红色与黑色方块),1.33×10−3M L-arabinose(蓝色与黑色圆圈)。OD600年值uninduced细胞(w / o树胶醛醣,在黑色与黑色三角形)添加了用于比较。GFP荧光强度都是标准化的全球细胞转化和空质粒绿色荧光蛋白和repL基因。归纳分析进行3生物复制和4技术复制。数据意味着±SEM。
综上所述,感应的repL基因表达在大肠杆菌全球可能增加的输出绿色荧光蛋白记者质粒,质粒拷贝数的显示放大RepL。
一个repLat₂等位基因显著降低RepL-mediated信号放大
阿拉伯糖诱导repL基因增加的输出信号绿色荧光蛋白记者质粒从而显示独联体表演,RepL-induced质粒DNA复制大肠杆菌全球。我们下一个试图确定DnaA结合位点和A / T-rich地区是重要的独联体表演,RepL-induced信号放大。同义基地替换(主要是A / T G / C)介绍了A / T-rich地区(称为AT1和at₂以后)和DnaA结合位点(以后称为D1和D2)而不影响的氨基酸序列repL基因产物(图3一)。评估如果突变影响RepL-mediated信号放大,大肠杆菌全球是改变了的绿色荧光蛋白记者有野生型质粒(WT,称为等位基因repLWT)或突变repL的等位基因,称为repLAT1,repLat₂,repLD1和repLD2。全球转化株诱导了1.33×10−4M树胶醛醣,GFP荧光强度以及OD600年细胞被记录在一段10 h。最终的输出是表示为每OD GFP荧光强度600年(GFP Fluo. / OD600年)。
图3。一个repLat₂等位基因显著降低RepL-mediated GFP信号放大。(一)两个A / T-rich区域称为AT1 at₂,以及两个DnaA结合位点称为D1和D2,对RepL-mediated DNA复制可能是重要的。同义替换被引入repL基因通过PCR而不影响氨基酸序列(即。codon-optimisation)。变异的基地(红色大写)以及野生型序列(黑色小写)。这些元素内的位置repL开放阅读框(ORF)显示。(B)每个OD GFP荧光强度600年(FIuo. / OD600年),(C)OD600年全球细胞转化的gfp.repLWT(黑与黑钻石),gfp.repLAT1(红色与黑色圆圈),gfp.repLD1(绿色颜色与黑色矩形),gfp.repLat₂(橙色与黑色三角形),或gfp.repLD2绿色荧光蛋白(蓝色与黑色三角形)记者质粒,在1到10 1.33×10的快乐指数−4L-arabinose M。GFP荧光强度都是标准化的全球细胞转化和空质粒绿色荧光蛋白和repL基因。归纳分析进行3生物复制和4技术复制。数据意味着±SEM。
的repLAT1和repLD1等位基因不改变GFP FIuo. / OD的增加趋势600年价值观在全球名列前阿拉伯糖诱导转化株,相比的绿色荧光蛋白。repLWT转化株(图3 b)。与之相反,repLat₂等位基因GFP Fluo. / OD减少600年全球的值转化株显著的2 ~ 6.8倍~ 10.7倍到10 hpi相比GFP Fluo. / OD600年的值绿色荧光蛋白。repLWT转化株(p< 0.0005)(图3 b)。现病史4到10之间,平均OD600年~ 0.5记录的绿色荧光蛋白。repLAT1,绿色荧光蛋白。repLD1和绿色荧光蛋白。repLWT转化株,~ 2 ~ 4倍低于OD600年的绿色荧光蛋白。repLat₂转化株(p< 0.0005)(图3 c)。的绿色荧光蛋白。repLD2转化株产生中间OD600年值~ 0之间。现病史6和0.9 ~ 4到10 (图3 c)。尽管阿拉伯糖诱导repLD2制作一个类似的GFP FIuo. / OD的增加趋势600年值,较低的OD600年的repLD2转化株可能提供了GFP Fluo. / OD略高600年现病史1到7之间的值,相比的repLWT转化株(图3 b,C)。
验证如果GFP信号放大与质粒拷贝数的增加直接相关,突变at₂地区的repL基因可以减少这种RepL-mediated质粒DNA复制,从全球提取质粒DNAgfp.repLWT和gfp.repLat₂转化株uninduced州立或8 h后归纳为1.33×10−4阿拉伯糖。全球的阿拉伯糖诱导gfp.repLWT转化株增加质粒DNA带的强度和质粒拷贝数/ OD估计600年,符合GFP FIuo. / OD的增加600年值相比uninduced状态(补充图4 a, B)。与之相反,全球的阿拉伯糖诱导gfp.repLat₂转化株没有增加质粒DNA带的强度,或质粒的拷贝数/ OD600年值得注意的是,相比uninduced的状态(补充图4 a, B)。
综上所述,同义基地替换at₂地区显著降低RepL-mediated GFP信号放大因此表明at₂地区可能在DNA复制RepL-mediated发挥重要作用。
突变at₂地区repL基因没有影响反式表演,RepL-mediated信号放大
的repLat₂等位基因的同义替换,这是不会影响RepL氨基酸序列和/或蛋白质产品的活动。如果这个假设是正确的,产品的蛋白质repLat₂等位基因可能促进一个质粒DNA复制在反式而独联体表演,质粒扩增过程将被抑制。因此,为了确定如果阿拉伯糖诱导repLat₂等位基因可以放大一个质粒的拷贝数在反式,RepL-induced DNA复制的水平是评估方法使用绿色荧光蛋白和招标书双系统(记者数字4,B)。一个截repL基因序列(称为数控-repL以后)源自P1 phagemid成立之前(Kittleson et al ., 2012;欢et al ., 2022),是组装的招标书记者质粒。nc -repL序列缺少起始密码子和之前的启动子序列,它只会作为目标站点的RepL蛋白质中提供反式(图4 b)。的招标书.nc -repL和gfp.repL质粒有或没有突变(s) (at₂区域repL基因和/或nc -repL被用于转换的序列)大肠杆菌全球,其次是阿拉伯糖诱导转化株。GFP和RFP荧光强度/ OD600年(Fluo. / OD600年)比uninduced状态。
图4。一个repLat₂等位基因减少了独联体代理RepL-mediated信号放大,同时保留其蛋白质产品的能力提高的输出招标书质粒在反式。(一)原理图的招标书记者构造。一个repL基因序列截短到40岁英国石油(bp) 5′端,是组装的招标书质粒编码的记者。这种非蛋白编码repL基因,称为数控-repL只会作为目标站点RepL提供在反式。招标书(橙色)既定的表示下一个弱组成型启动子,Bba_J23115, RBS30人造核糖体结合位点。的招标书。nc -repL质粒赋予卡那霉素抗性,RK2法oriV赋予质粒拷贝数低。(B)RepL-mediated DNA复制的示意图在独联体和在反式。在L-arabinose感应repL基因表达,蛋白质产品将目标oriL在自己的基因序列(在独联体)以及数控——中的一个repL序列(在反式)。这将导致两个记者质粒的拷贝数的增加,因此,绿色荧光蛋白的增加和RFP uninduced相比输出状态。褶皱的变化GFP(蓝色)和RFP(橙色)荧光强度/ OD600年(Fluo. / OD600年)值的全球转变(C)gfp.repLWT和招标书.nc -repLWT质粒,(D)gfp.repLWT。和招标书.nc -repLat₂记者质粒,(E)gfp.repLat₂和招标书。nc -repLWT记者质粒,或(F)gfp.repLat₂和招标书。nc -repLat₂记者质粒在1到10 1.33×10的快乐指数−4L-arabinose M。的OD600年的arabinose-induced全球细胞(黑色)+阿拉伯糖,和uninduced全球细胞(−阿拉伯糖,在灰色)(G)gfp.repLWT和招标书.nc -repLWT记者质粒,(H)gfp.repLWT和招标书.nc -repLat₂记者质粒,(我)gfp.repLat₂和招标书.nc -repLWT记者质粒,(J)gfp.repLat₂和招标书.nc -repLat₂现病史记者质粒测量在1到10。褶皱GFP和RFP FIuo. / OD的变化600年计算基于对比arabinose-induced和uninduced状态。GFP和RFP荧光强度都是标准化的全球细胞转化和空质粒绿色荧光蛋白和repL基因或不招标书基因和nc -repL序列。所有实验进行3生物复制和4技术复制。数据意味着±SEM。
阿拉伯糖诱导的gfp.repLWT和招标书。nc -repLWT转化株产生了一个最大~ 5.2倍(p< 0.0005)和~ 10.5倍(p< 0.0005)GFP和RFP Fluo. / OD600年分别相比uninduced状态(图4 c)。的OD600年的gfp.repLWT和招标书。nc -repLWT现病史6到10之间的转化株~ 0.5,低于OD ~ 4倍600年uninduced细胞(p< 0.0005)(图4 g)。阿拉伯糖诱导的gfp.repLWT和招标书。nc -repLat₂转化株产生低~ 7.4倍RFP Fluo. / OD600年值(p< 0.0005),无显著差异的GFP Fluo. / OD600年值(p> 0.05)现病史4到6之间,相比的gfp.repLWT和招标书。nc -repLWT转化株(图4 d)。平均啊600年~ 0.5记录的gfp.repLWT和招标书.nc -repLat₂现病史6到10之间的转化株,低于O ~ 4倍600年uninduced细胞(p< 0.0005)(图4 h)。
与之相反,阿拉伯糖诱导的gfp.repLat₂和招标书.nc -repLWT转化株产生GFP Fluo. / OD低~ 4.7倍600年值(p< 0.0005),而RFP Fluo. / OD600年增加了~ 4倍(p< 0.0005)在现病史10,相比的gfp.repLWT和招标书。nc -repLWT转化株(图4 e)。出乎意料地,增加OD600年的gfp.repLat₂和招标书.nc -repLWT现病史2到6之间观察转化株,OD无显著差异600年值相比uninduced现病史6到10之间的状态(p> 0.05)(图4我)。没有显著增加GFP和RFP FIuo. / OD600年的值gfp.repLat₂和招标书.nc -repLat₂转化株,相比uninduced状态10 hpi (p> 0.05)(图4 f)。的OD600年的gfp.repLat₂和招标书.nc -repLat₂现病史2到10之间的转化株均呈增长趋势,但平均OD600年相比低~ 1.3倍的uninduced现病史6到10之间的细胞(p< 0.05)(图4 j)。
综上所述,阿拉伯糖诱导repLat₂等位基因增加的输出信号招标书记者质粒在反式而独联体代理绿色荧光蛋白质粒扩增抑制因此表明at₂地区的突变repL基因可能没有影响蛋白质产品的活动。
在其他实验室菌株RepL-mediated信号放大大肠杆菌
来确定的独联体- - -反式代理RepL-mediated信号放大可以复制在其他实验室的大肠杆菌,阿拉伯糖诱导的gfp.repLWT和招标书.nc -repLWT记者结构重复大肠杆菌NCM3722和大肠杆菌BL21。细菌细胞的质粒转化,其次是阿拉伯糖诱导repL基因的表达。GFP和RFP荧光强度/ OD600年(Fluo. / OD600年)比uninduced状态。
GFP和增加RFP FIuo. / OD600年值观察NCM3722和BL21转化株,现病史2到10之间相比,uninduced细胞(补充图5 a, B)。的NCM3722转化株产生了(~ 4.3倍p< 0.0005)和~ 16.6倍(p< 0.0005)GFP和RFP FIuo. / OD600年值分别为3和4之间的hpi相比uninduced状态(补充图5一个)。然而BL21转化株,产生了最大~ 4.7倍(p< 0.0005)和~ 26.5倍(p< 0.0005)GFP和RFP FIuo. / OD600年值分别为2和6之间hpi相比uninduced状态(补充图5 b)。现病史1到10之间,OD600的NCM3722转化株从~ 0.5 ~ 2.0(增加补充图5 c)。与之相反,OD600BL21的转化株逐渐增加从0.5 ~ 0.3 ~ 2到5之间的快乐,其次是大幅增加从大约2.1 ~ 0.5 ~ 6到10之间的居民(补充图5 d)。
总的来说,阿拉伯糖诱导repL基因大肠杆菌BL21和大肠杆菌NCM3722增加输出招标书和绿色荧光蛋白记者质粒,这是暗示独联体- - -反式代理RepL-mediated DNA复制在两个实验室菌株大肠杆菌。
截断nc -repL序列允许RepL-mediated信号放大在反式
我们试图确定一个较短的repL序列可以支持一个反式代理RepL-mediated DNA复制,数据将缩小P1 oriL的位置和顺序。三截断版本的nc -repL序列(称为T1 T3 nc -repL)设计和组装成的招标书记者质粒(图5一个)。大肠杆菌全球co-transformed了gfp.repLat₂质粒(参考图4 e),这将提供RepL表达式在反式没有放大的repL基因拷贝数,以及招标书记者质粒有完整或截断nc -repL序列。转化细胞诱导为1.33×10−4阿拉伯糖和评估每个OD RFP荧光强度的变化600年(RFP FIuo. / OD600年)相比,uninduced状态。
图5。截断nc -repL序列可以作为目标站点RepL-mediated信号放大在反式。(一)原理图显示一个完整的非编码的长度和截断版本repL(nc -repL)序列,组装到一个招标书记者质粒。截断1 (T1)和3 (T3)数控-截断repL不包含at₂区域(43 bp)。截断的大小数控-repL顺序显示。量化的折叠每OD RFP荧光强度的变化600年(FIuo. / OD600年)的全球细胞co-transformed绿色荧光蛋白。repLat₂质粒和招标书质粒和(B)完整的长度,(C)截断1 (T1),(D)截断2 (T2),(E)截断3 (T3),(F)截断4 (T4),或(G)截断5 (T5)版本的nc -repL序列在1到10 1.33×10的快乐指数−4M L-arabinose(橙色)。褶皱的变化RFP FIuo. / OD600年计算基于对比arabinose-induced和uninduced状态。RFP荧光强度值都是标准化的全球细胞转化和空质粒招标书基因和nc -repL序列。归纳分析进行3生物复制和4技术复制。数据意味着±SEM。
T2 nc -repL构造了最大~ 43.3倍增加RFP Fluo. / OD600年现病史值10点,相比明显不同,记录完整的数控-repL序列(p> 0.05)(图5 b,D)。相反,T1和T3 nc -repL构造了一个RFP Fluo. / OD低~ 22.4倍600年现病史值10点,相比全长度和T2 nc -repL构造(p< 0.0005)(图5 b- - - - - -E)。综上所述,T2 nc -repL支持序列应包含所有必要的元素反式代理RepL-mediated DNA复制过程。之前的数据显示,at₂地区位于3′端T2 nc -repL序列可能是重要的RepL-mediated DNA复制过程(图3 b)。与之相反,同义基地替换前AT1地区和DnaA结合位点没有影响独联体表演,RepL-mediated GFP信号放大大肠杆菌全球(图3 b)。因此我们假设AT1地区DnaA结合位点可能并不需要反式代理RepL-induced DNA复制和T2 nc -repL序列可以进一步从5′端截短。T2 nc -repL是进一步截断为T4 nc -repL其中包含AT1、at₂区域和DnaA结合位点1,以及T5 nc -repL序列只包含at₂地区(图5一个)。T4和T5 nc -repL序列的组装招标书质粒,阿拉伯糖诱导试验在全球名列重复gfp.repLat₂和招标书质粒co-transformants。T4和T5 nc -repL构造了最大~ 43.2倍增加RFP FIuo. / OD600年值在10 hpi uninduced状态相比,并没有显著不同,记录完整的数控-repL或T2 nc -repL构造(p> 0.05)(图5 f,G)。一个OD600年~ 2.0 ~ 1.6的范围被记录为全球转化株与T2, T4和T5 nc -repL现病史6到10之间的之间的结构,这是类似于全球全长nc -转化株repL构造(p> 0.05)(补充图6)。
综上所述,截断nc -repL序列与一个完整的at₂地区允许RepL-mediated RFP信号放大,这表明这些序列有可能作为目标站点反式代理RepL蛋白质。
单一或组合突变的nc - at₂地区repL序列提供了不同级别的RepL-mediated信号放大
的repLat₂突变的DNA碱基替换在11个职位完全抑制了RepL-mediated信号放大反应。因此,我们假设突变(s)在单一或组合中的位置at₂可能产生不同程度的RepL-mediated信号放大,这可能有助于biosensor-based应用程序。来验证这个假设,突变在每个at₂地区内的11个位置了repL基因,紧随其后的是组装的repL的等位基因,称为SLrepL等位基因以后,绿色荧光蛋白质粒(图6)。全球细胞被改变了的绿色荧光蛋白记者有野生型质粒,repLat₂或SL之一repL等位基因。转化细胞诱导为1.33×10−4阿拉伯糖和评估每个OD GFP荧光强度的变化600年(GFP FIuo. / OD600年)在10 hpi uninduced相比。出乎意料,没有明显差异的GFP Fluo. / OD600年野生型之间的值repL和所有的SLrepL转化株(p> 0.05)(图6 b)。来确定组合突变区域内at₂在3或4的位置会影响RepL-mediated信号放大,相应的SLrepL等位基因是组装的绿色荧光蛋白记者质粒和阿拉伯糖诱导试验重复大肠杆菌全球质粒转化株。同样,所有的SLrepL等位基因产生GFP Fluo. / OD ~ 10倍增加600年uninduced状态相比,并没有显著的不同,观察经过感应的野生型repL等位基因(p> 0.05)(图6 b)。
图6。碱基替换单个或组合的nc - at₂地区内的位置repL序列产生不同程度的RepL-mediated RFP信号放大。(一)示意图显示DNA碱基的差异和野生型(WT)之间repLat₂(at₂*)序列。字符用红色表示DNA碱基(s)代替,和突变编号从1到11 at₂区域内基于他们的立场。碱基替换在单一位置将命名为“SL(核苷酸替换的位置),”虽然组合突变将命名为“SL(核苷酸替换的位置)+(核苷酸替换的位置)。“一个repLat₂等位基因或nc -repLat₂序列包含基础替换的11个职位。(B)折叠每OD GFP荧光强度的变化600年全球的细胞(GFP FIuo. / OD600年SL)转换gfp.repL,gfp.repLat₂(at₂)或gfp.repLWT(WT)质粒在10 1.33×10的快乐指数−4L-arabinose M。褶皱GFP FIuo. / OD的变化600年计算基于对比arabinose-induced和uninduced状态。GFP荧光强度值都是标准化的全球细胞转化和空质粒绿色荧光蛋白和repL基因。比较的褶皱GFP Fluo. / OD的变化600年值之间WT SLrepL等位基因与韦尔奇的方差分析了p值为0.7654,表明无显著差异在不同样本之间的GFP输出电平。(C)量化的折叠每OD RFP荧光强度的变化600年全球的细胞(RFP FIuo. / OD600年)co-transformedgfp.repLat₂质粒和SL招标书。数控repl,招标书。数控replat₂(at₂)或招标书。nc -repLWT(WT)质粒在10 1.33×10的快乐指数−4L-arabinose M。褶皱的变化RFP Fluo. / OD600年计算基于对比arabinose-induced和uninduced状态。比较折中的变化RFP Fluo. / OD600年WT和所有SL nc -值repL构造与韦尔奇的方差分析了p值为0.028,表明显著差异在不同样本之间的RFP输出电平。n代表无显著差异(s)的RFP Fluo. / OD600年WT和SL5 nc -之间的值repL构造(p> 0.05)。RFP荧光强度值都是标准化的全球细胞转化和空质粒招标书基因和nc -repL序列。归纳分析了4个生物学重复,每个数据点的平均值代表3生物复制。数据意味着±SEM。
在阿拉伯糖诱导repL基因表达、基因转录和/或更高层次的RepL蛋白由于其基因拷贝数放大可能克服SL的调节效应(s)突变(s),如果有的话,独联体表演,RepL-mediated DNA复制。如果这是真的,单个或组合突变at₂地区的非蛋白编码repL序列(nc -repL)可能会产生不同程度的反式-表演RepL-mediated DNA复制。因此,碱基替换(s)在每个内的11个职位介绍了nc - at₂区域repL序列和组装招标书记者质粒。大肠杆菌全球co-transformed了gfp.repLat₂质粒,这将提供RepL表达式在反式没有扩增的基因拷贝数(参考图3 e),以及一个招标书野生型质粒,nc -repLat₂或SL nc -之一repL序列。转化细胞诱导为1.33×10−4阿拉伯糖和评估每个OD RFP荧光强度的变化600年(RFP FIuo. / OD600年)在10 hpi uninduced相比。所有的SL nc -repL转化株,除了SL5 nc -repL,产生了一系列~ 16.2 ~ 40.4倍增加RFP Flou. / OD600年10点hpi uninduced州相比,中介WT的nc -repL和nc -repLat₂转化株(图6 c)。与之相反,SL5 nc -repL转化株产生了~ 45.7倍增加RFP Fluo. / OD600年现病史10点,相比明显不同的WT nc -repL转化株(p> 0.05)(图6 c)。我们下一个试图确定的组合基本数控- at₂地区内替换repL序列可以给更大范围的RFP输出。因此,我们引入了基地替换在几个nc - at₂地区内的位置repL序列和SL nc -组装repL序列的招标书记者质粒。阿拉伯糖诱导试验是在全球名列细胞co-transformed重复gfp.repLat₂。质粒和招标书野生型质粒,nc -repLat₂或SL nc -之一repL序列。结合数控- at₂地区内的突变repL序列产生一系列~ 1.2 - 19.0 ~ -褶皱增加RFP Fluo. / OD600年现病史值10点,nc -之间的中介repLat₂和SL nc -repL构造有碱基替换(s)在单个位置(图6 c)。
综上所述,在单个或多个碱基替换nc - at₂地区内的位置repL序列产生不同程度的RepL-mediated RFP信号放大,这表明,突变可能引起不同程度的反式表演,RepL-mediated DNA复制。
SL nc -repL序列可以调节输出砷的生物传感器
单一或组合的基础nc - at₂地区内替换repL序列产生不同程度的RepL-mediated RFP信号放大,因此表明SL nc -repL序列可能调节其他基因电路的输出。作为一个概念验证,我们综合了repLat₂等位基因和nc -repL序列GFP-expressing,大肠杆菌基于砷生物传感器由Wan et al . (2019)(图7)。修改后的生物传感器将提供一个arsenic-induciblerepLat₂表达式,它将产生RepL蛋白促进DNA复制在反式没有放大的repLat₂基因拷贝数(图7)。大肠杆菌全球与质粒转化和GFP荧光强度以及OD600年测量5点hpi与一系列亚砷酸钠(NaASO吗2)。最终的输出是表示为每OD GFP荧光强度600年(GFP Fluo. / OD600年)。
图7。SL nc -repL可以调节的输出序列大肠杆菌基于砷生物传感器。(一)原理图显示的repLat₂基因和T2 nc -repL序列为一个arsR基于砷生物传感器。生物传感器电路包括两个独立的质粒。亚砷酸钠和砷的存在引起的表达hrpR,合,以及男性,tev和repLat₂。RepL蛋白质将推动DNA复制的绿色荧光蛋白记者包含数控-质粒repL序列。这将给GFP荧光强度的增加。突变repLat₂等位基因将抑制扩增的基因拷贝数在独联体。GFP有Tev蛋白酶降解标签(Tsc),减少了背景蛋白质水平uninduced状态。(B)GFP荧光强度/ OD600年全球的细胞(Fluo. / OD600年)改变了野生型(nc -砷生物传感器repLWT在黑),数控-repLat₂(蓝色),SL4 nc -repL(红色),SL8 nc -repL(橙色),SL2 nc -repL(黄色),SL2 + 7 nc -repL(绿色),SL4 + 5 + 6数控-repL(蒂尔)序列,在现病史5 0.0781μM, 2.0 0.031μM, 0.125μM, 0.5μMμM亚砷酸钠(NaAsO2)。归纳分析与3生物复制技术进行复制。数据意味着±SEM。
最大GFP Fluo. / OD ~ 17.8倍增加600年值观察全球nc -repLWT转化株在现病史5 2μM NaASO2相比,在uninduced状态(p< 0.0005)(图7 b)。我们接下来试图确定SL nc -repL和nc -repLat₂序列可以修改RepL-mediated信号放大。我们选择SL2、SL8 SL2 + 7或SL4 + 5 + 6 nc -repL更换数控-repLWT序列从这些结构产生不同的,中介的水平相比RepL-mediated信号放大的nc -repLWT和数控repLat₂构造(图6 c)。在2μM NaASO2nc -repLat₂构造显著降低GFP FIuo / OD600年价值~ 6.9倍,相比,数控-repLWT构造(p< 0.0005)(图7 b)。与之相反,SL4 SL8、SL2 SL2 + 7, SL4 + 5 + 6 nc -repL构造了~ 1.2倍(p> 0.05)~ 1.6倍(p< 0.05)~ 2.2倍(p< 0.005),(3.4倍p< 0.0005)和~ 4.5倍(pGFP Fluo. / OD < 0.0005)低600年分别相比,数控-repLWT建立在2μM NaASO2(图7 b)。
综上所述,结合repLat₂等位基因和nc -repLWT序列的GFP输出放大砷生物传感器,在nc - at₂地区的突变repL序列产生不同程度的GFP信号放大,因此展示的潜在用途repL结构调整生物传感器的输出。
讨论
RepL表达裂解性噬菌体的复制P1是至关重要的,在蛋白质被认为从oriL启动DNA复制,假设是位于第二个一半的基因序列。尽管RepL活动背后的分子机制仍然未知,蛋白质活动可能引起质粒DNA复制大肠杆菌,这将允许调查身份P1 oriL序列,以及候选人宿主因素(s) RepL-mediated所需的过程。我们已经确定了一个/ T-rich区域,称为at₂,这个序列显著影响RepL-mediated同义突变信号放大因此提出一个重要的角色在RepL-mediated DNA复制的未知元素。此外,截repL88 bp的大小允许RepL-mediated序列信号放大在反式因此表明最小的序列,可以作为RepL目标站点,包含所需的所有DNA元素RepL-mediated质粒DNA复制。与以前的研究一致Sheth et al。(2017),Dwidar和Yokobayashi (2019),李et al。(2023),我们已经表明,砷生物传感器的RepL可以放大信号。此外,我们的数据表明,基地替换(s)在一个或几个职位at₂地区产生不同程度的RepL-mediated信号放大。综上所述,我们的研究提供了新的见解独联体代理DNA元素(s)所需RepL-mediated DNA复制大肠杆菌,以及证明repL等位基因和非蛋白质编码repL可以集成到基因序列实现不同程度的信号放大电路。
at₂地区可能积分P1裂解复制子
/ T-rich区域通常作为DNA解除元素(由于)起源的复制,通过促进DNA双螺旋结构的开放(Coman Russu, 2005;Rajewska et al ., 2012)。的定位和序列/ T-rich重复至关重要的功能,即点突变和单基地插入可以灭活原点(萨哈et al ., 2004;Kowalczyk et al ., 2005)。同样,同义的碱基替换11 at₂地区内的一个位置repL序列明显受损RepL-mediated信号放大反应,这表明at₂地区可能由于P1 oriL。AT1地区替换与之相反,基地与先前确定IHF结合位点,以及两个DnaA结合位点并不影响RepL-mediated显著信号放大。此外,截断nc -repL序列没有IHF和DnaA绑定网站允许RepL-mediated信号放大在反式。因此,IHF DnaA可能不是RepL-mediated质粒DNA复制所必需的在反式。有趣的是,之前at₂地区富含序列的胞嘧啶鸟嘌呤/然而这种急剧变化的作用DNA组成RepL-mediated DNA复制并没有决定在这个研究。然而,我们不能确定RepL将直接绑定到at₂地区和/或前面的序列,以及功能冗余RepL和其他宿主蛋白质之间参与DNA复制,如果任何。因此,RepL蛋白质的结构研究,以及使用AT2-containing DNA序列和纯化RepL蛋白质,可以提供洞察RepL-mediated at₂地区DNA复制的作用。除了RepL活动的分子研究,能够净化RepL蛋白质会有用验证同义突变,如果有的话)repL基因会影响蛋白质的活动,尽管阿拉伯糖诱导repLat₂另一个质粒的等位基因可以放大信号在反式。我们的初步实验表明,添加PolyHistidine Tag-encoding糖基的序列repLWT和repLat₂基因(6 x PolyHis)并不影响RepL-mediated信号放大在独联体和在反式(补充图7)。然而,我们有经验丰富的几个问题在净化His-tagged RepL蛋白质,如多个蛋白质洗脱后污染物的存在(数据未显示),这促使优化的RepL净化协议在未来的研究。虽然RepL-mediated反应评估在记者质粒,值得注意的是突变的效应(s)repL基因序列并不是在P1基因组DNA的环境中,学习的变化repL基因表达在其本地启动子,以及差异的核苷酸组成和修改(如果有的话)相比,质粒DNA,可能需要其他的主机和/或P1-derived因素支持RepL-mediated P1 DNA复制。因此,IHF和DnaA绑定网站的作用,以及at₂地区P1基因组DNA的复制裂解阶段仍被阐明。此外,其他核蛋白质,如H-NS和Fis与/ T-rich相关区域,可能扮演重要的角色在RepL (s)介导的DNA复制过程。综上所述,截断版本的nc -repL构建本研究将提供一个很好的平台,探针DNA结合的宿主因素(s) RepL-mediated DNA复制所必需的过程,以及识别RepL活动的分子机制。
高水平的RepL活动可能是细胞毒性大肠杆菌全球
虽然两者的机制独联体- - -反式代理RepL-mediated DNA复制是将相似,a独联体代理RepL-mediated信号放大减少了OD600年的大肠杆菌相比全球显著uninduced状态。与此前曾报导过RepL活动相关的细胞毒性Dwidar和Yokobayashi (2019)在全球,但它没有被观察到绿色荧光蛋白质粒转化株没有repL基因,也不能当独联体行为抑制了信号放大repLat₂等位基因在这项研究中。此外,我们的研究结果表明OD之间的反比关系600年全球的gfp.repLWT转化株和阿拉伯糖浓度。因此,高水平的独联体代理RepL活动,造成的基因剂量的放大,可能是细胞毒性大肠杆菌全球的细胞。意外的存在独联体表演,RepL-mediated信号放大并没有减少OD600年的大肠杆菌NCM3722显著的相比大肠杆菌全球。因此,其他host-derived因子(s)可能会减轻细胞负担与高水平的NCM3722 RepL活动有关。一个这样的候选人将是RecA重组酶,蛋白质编码基因被删除大肠杆菌全球(安东,罗利,2006)。RepL蛋白质活动可能导致DNA链刀具磨损和/或直接复制叉的停滞,它们可能会激活SOS-mediated反应,导致细胞分裂(逮捕考克斯et al ., 2000;彭宁顿和罗森博格,2007)。另外,高水平的独联体代理RepL活动可能增加co-directional的频率或正面碰撞replisome和转录单位repL基因序列,间接导致DNA损伤DNA复制和/或中断可能逮捕细胞分裂(法国,1992年;墨金墨金,2005年;Dutta et al ., 2011;Merrikh et al ., 2012)。如果这是真的,RecA活动可以修复DNA损伤(Robu et al ., 2001;Lusetti和考克斯,2002年)和/或可能解决其他RepL活动的后果,这将缓解高水平的RepL活动引起的细胞毒性大肠杆菌NCM3722。因此,恢复recA基因表达在全球名列细胞,其次是RepL蛋白质水平和活动的直接测量,以及研究纯化RepL蛋白之间的相互作用及其DNA基质,可以提供深入了解独联体代理RepL-mediated DNA复制是细胞毒性大肠杆菌全球。
SL nc -repL序列可以调节生物传感器的输出和本研究的局限性
而数控-repL序列与基地内替换at₂地区可能产生不同程度的RepL-mediated信号放大,这些突变的调节效应没有被观察到的独联体表演,RepL-mediated信号放大。转录前大肠杆菌oriC序列显示促进开放的DNA双DnaA (贝克和科恩伯格,1988年),以及改变13-mer区域的拓扑可能促进DNA融化(Asai et al ., 1992)。此外,之间的直接交互大肠杆菌RNA聚合酶和噬菌体λO复制发起者蛋白质建议之间的耦合机制和噬菌体的起始转录DNA复制(Szambowska et al ., 2011)。因此,的存在repL基因转录和/或更高层次的RepL活动由于扩增的基因拷贝数,可能克服SL的调节效应repL等位基因的独联体代理RepL-mediated DNA复制。有趣的是,SL nc -的调节效应repL序列表明碱基替换(s)在某些位置在at₂地区生产更大的抑制作用比其他人反对RepL-mediated DNA复制。我们只有少数SL检查repL等位基因从而影响的其他形式的突变(即。,insertion and deletion) as well as base substitutions at different positions within AT2 and its adjacent sequences remained to be elucidated. Furthermore, the RepL-mediated signal amplification should be repeated in different strains of大肠杆菌和在体外如在细胞free-based系统中,波动和增长速度的差异不同大肠杆菌压力会影响效率的生物传感器和RepL-mediated信号放大的效果。虽然绿色荧光蛋白和招标书记者质粒允许无缝的时间点评估RepL-mediated反应,质粒拷贝数的变化,以及repL基因表达在这项研究没有直接测量。然而,我们试图从全球中提取的DNA琼脂糖凝胶电泳后转化株诱导repLWT和/或repLat₂基因的表达,结果表明质粒拷贝数的放大在独联体的拷贝数,以及11.6 kbp nc -repLWT编码粘粒在反式分别为(补充图4、8)。然而,更大的面板区域内at₂突变以及DNA碱基的替换相邻地区,再加上记者的直接量化基因表达水平,repL基因表达以及目标质粒的拷贝数与不同长度和核苷酸组成,将帮助建立一个全面的列表repL等位基因和/或nc -repL序列提供精确的信号放大为未来biosensor-based应用程序。
材料和方法
菌株、质粒和媒体
在这项研究中使用的所有菌株中列出补充表1在质粒中列出补充表2。细菌在Luria-Bertani经常培养(磅)肉汤和琼脂,除非另有规定。磅肉汤准备10 g / l的氯化钠(费舍尔科学,7647),10 g / l的胰蛋白胨(VWR, 9000-71-9)和5 g / l的酵母提取物(中小YEA03)。磅琼脂,琼脂粉20 g / l(中小AGA03)添加到磅中等。抗生素用于这项研究包括氨苄青霉素(100μg /毫升)和卡那霉素(50μg /毫升)。
热休克的变换大肠杆菌
的变换大肠杆菌全球和BL21通过热休克方法。化学主管细菌细胞准备通过选择单个菌落和接种3毫升的磅中等。细胞培养16 h,在37°C,用颤抖的。一夜之间文化是亚文化圈1/100 1/100在新鲜LB培养基稀释系数没有抗生素,直到达成OD600年约为0.33。细菌培养是在冰上冷却15分钟,随后在4000 X g离心5分钟在4°C。上层清液被和细胞颗粒被CaCl 25毫升的5毫米2每50毫升细菌培养的解决方案。在4000 X g细胞旋转下来5分钟。清洗步骤是重复,最终细胞颗粒resuspended CaCl 25毫升的5毫米2解决方案和留在冰30分钟。在4000 X g细胞离心5分钟,和细胞颗粒是resuspended CaCl 2毫升的5毫米2解决方案与15%的甘油,每50毫升的细菌培养和留在冰2 h。细胞被整除为1.5毫升微型离心机管,以及存储在−80°C。同时转换、50μL化学主管大肠杆菌全球和BL21细胞DNA与10 ng预混(为每一个质粒)。在43°C细胞孵化热块50年代。细胞立即在冰上冷却3分钟,其次是除了450μL SOC的媒介。转化细胞在SOC恢复1 h,在37°C,用颤抖的。三十μL 50μL恢复细胞被镀上磅琼脂与适当的抗生素(s)和孵化37°C 16 h。
聚合酶链反应
所有PCR反应进行了使用Q5®高保真2 x大师混合(内,M0491)制造商的协议后,与1 ng的DNA样本模板。引物浓度为0.5μM是用于所有PCR反应。变性的模板进行了30年代在98°C。引物的退火温度是决定使用内T米计算器,这一步是30年代。扩展步骤是设置在72°C, 30年代每kbp的DNA样本。最后一个在72°C扩展步骤2分钟了。三十周期放大。突变引入repL序列通过PCR,引物设计包含理想的突变(补充表3)。IDT密码子优化工具(IDT)被用来替代选择的基地repL基因序列,强调在T / G / C基地替换,如果适用的话。引物的退火温度内T决定米计算器是减少3°C,以确保适当的退火的引物与模板DNA突变(s)不匹配。DNA的大肠杆菌EMG16, P1溶素原是作为模板分子克隆repL基因序列通过菌落PCR和Q5®高保真2 x大师混合。细菌的殖民地在100年被稀释μL的水,和1μL的细菌悬液作为模板。5分钟加热步骤95°C添加热循环前的步骤。引物的退火温度是决定使用内T米计算器,这一步是30年代。扩展步骤是设置在72°C, 1分钟/ kbp的DNA样本。最终在72°C扩展步骤3分钟了。三十周期放大。
组装和质粒的准备
本研究的质粒都是组装的通过吉布森组装、使用NEBuilder®HiFi DNA组装主混合(内,E2621),遵循制造商的协议。引物设计有20个基点,至30基点DNA片段之间的重叠区域。总共有80 ng的DNA用于每一个反应,一个向量:插入1:2的比例。DNA片段都准备通过PCR。单链DNA (ssDNA)是用于组装T5 nc -repL在一个序列招标书质粒(参考图5一个)。两个引物设计有28日英国石油公司之间的重叠区域和向量DNA (补充表3)。总共有80 ng的DNA用于每一个反应,一个向量:插入(双链DNA, dsDNA):插入(ssDNA) 1:2:5的比例。两个反应的微升混合添加到50μL化学主管大肠杆菌全球对热休克细胞转换。50微升的细胞恢复转换后镀上磅琼脂与适当的抗生素和孵化37°C 16 h。三个殖民地和用于制备一夜之间文化。提取质粒和phagemid DNA进行了使用Qiaspin 250 Miniprep工具包(试剂盒,27106),在制造商的协议。质粒都sequenced-verified通过桑格测序由源生物科学(诺丁汉)。质粒序列中列出补充表4。
电穿孔的大肠杆菌
的变换大肠杆菌NCM3722进行通过电穿孔。准备electrocompetent细胞,一夜之间文化是文化在新鲜LB培养基1/100稀释系数没有抗生素,直到达成OD600年约为0.40。细菌培养是在冰上冷却15分钟,随后在4000 X g离心5分钟在4°C。上层清液和细胞颗粒被删除25毫升的10%甘油解每50毫升的细菌培养。在3000 X g细胞离心5分钟。清洗步骤重复了两次,最后细胞颗粒在250年resuspendedμL 10%甘油解每50毫升的细菌培养。细胞被整除到存储在−1.5毫升微型离心机管和80°C。40微升化学主管细胞DNA预混10 ng大肠杆菌NCM3722。细胞被转移到一个基因脉冲发生器/矩形脉冲发生器电穿孔比色皿,0.1厘米的差距(Biorad, 1652083),并使用矩形脉冲发生器进行了电穿孔Electroporator (Biorad, 652100),“细菌”设置。后立即电穿孔,细胞转移到pre-chilled, 800μL SOC。转化细胞在SOC恢复1 h,在37°C,用颤抖的。二十μL 30μL恢复细胞被镀上磅琼脂与适当的抗生素(s)和孵化37°C 16 h。
阿拉伯糖诱导repLGFP的表达,量化,RFP荧光强度和OD600年
RepL-mediated DNA复制水平的评估方法,通过测量输出的变化记者在阿拉伯糖诱导质粒(s)repL基因的表达。一夜之间文化准备与适当的抗生素(s)磅,使用至少3 X随机挑选殖民地,37°C用颤抖的。一夜之间文化被稀释的1/100,200年μL新鲜LB培养基与适当的抗生素(s), 96年黑井μClear微型板块(GBO, 655096)。板是在CLARIOstar 37°C +孵化BMG标(BMG Labtech),双轨道振动模式设置为700 rpm。细胞培养,直到一个OD600年1.33 ~ 0.2,(不同浓度或×10−4M) L-arabinose添加诱导的表达repL。OD600年GFP和RFP荧光强度记录在每一个小时,一段10 h。OD600年值被记录在离散波长600 nm,通路长度修正为200μL反应和5.88毫米长度、沉淀时间0.5秒,20个闪光和测量0年代的开始时间。用于GFP的激发和发射波长分别为485 - 12海里和520海里,虽然这对RFP 584 nm和620 nm,分别。荧光强度记录从底部的,结算时间为0.2 s,测量10 0和闪光的开始时间。数据分析使用ω软件(BMG Labtech)。所有数据被第一个规范化阅读获得空白井中只包含磅,紧随其后的是归一化的细胞转化的荧光强度值(没有空向量repL和绿色荧光蛋白或招标书和nc -repL),除非另有规定。荧光强度除以OD600年(Fluo. / OD600年)。
砷诱导repLGFP的表达和量化输出
的arsR砷的生物传感器是由我们实验室以前设计(Wan et al ., 2019)。亚砷酸诱导试验进行大肠杆菌使用协议建立了全球Wan et al ., 2019。简而言之,在一夜之间改变了全球的文化细胞准备与适当的抗生素(s)磅,使用3随机挑选殖民地,在37°C用颤抖的。一夜之间文化被稀释的1/100,200年μL新鲜LB培养基与适当的抗生素(s), 96年黑井μClear微型板块。细胞与不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO诱导2,σ,35000),其次是在CLARIOstar孵化+ BMG标(BMG Labtech) 37°C, 700 rpm的双重轨道振动模式设置。GFP荧光强度和OD600年细胞被记录在5 h后感应,量化描述的设置相同的GFP和RFP输出。所有数据被第一个规范化阅读从空白井获得只含有磅中等。GFP荧光强度除以OD600年的细胞(Fluo. / OD600年)。
统计分析
本研究的数据是来自至少3生物重复(宿主细胞测试)和3技术重复,除非另有规定。本研究的计算是使用Microsoft excel(美国微软,微软,佤邦)。韦尔奇的方差分析或双向方差分析比较(即包括两个独立的变量。,data involving different concentration of arabinose and at multiple time points post induction ofrepL表达式)被用来确定p的价值年代,其次是邓恩的多重比较因果测试调整ps的各自的价值,通过Graphpad棱镜6。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义的研究。Graphpad棱镜6本研究用于生成图表。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
作者的贡献
BW:构思和监督。BW, YH, RB:设计实验。决断力进行了试验和数据分析。所有作者参加的解释结果。决断力和BW写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作是由比尔和梅林达•盖茨基金会支持下“探索大挑战”格兰特(OPP1139488)和英国的研究和创新未来领导人奖学金(先生/ S018875/1)。BW基础研究基金支持的中央大学(226-2022-00178,226-2022-00214),中国的自然科学基金(32271475)和浙江省鲲鹏措施项目奖。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1095671/full补充材料
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关键词:RepL,噬菌体P1, DNA复制,质粒拷贝数,生物传感器信号放大
引用:欢YW,布朗R和王B(2023)腺嘌呤/ thymidine-rich区域积分RepL-mediated DNA复制。前面。Microbiol。14:1095671。doi: 10.3389 / fmicb.2023.1095671
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