代谢组学和培养洞察spacecraft-associated的宽容不动杆菌向Kleenol 30,洁净室地板清洁剂

1。介绍

保持低生物污染cleanroom-type设施空间飞行器装配关键部件(Rummel 1992;美国国家航空航天局,2011年;弗里克et al ., 2014)、载人飞船探索(敏捷et al ., 2020),提供医疗设施(Shams et al ., 2016;Rutala和韦伯,2019年)和药品生产(八婆,2015)。常见的这些限制环境和努力是非关键硬表面和支持设备的日常清洁和v / v酒精≥70%,v / v异丙醇70%,v / v 3%过氧化氢和/或一次性消毒湿巾含有季铵化合物(Agalloco卡尔顿,2007;Rutala et al ., 2008;黄et al ., 2013;弗里克et al ., 2014;Checinska Sielaff et al ., 2019)。

制药设备,以及较小程度上相应的医疗设施,地板此外清洗消毒剂和/或洗涤剂,如苯扎氯铵(和其他季铵化合物)、过氧化氢、次氯酸钠、和其他替代方案(Murtough et al ., 2001;Rutala et al ., 2008;八婆,2012;Eissa et al ., 2014;汉et al ., 2021;Tembo et al ., 2022)。在讨论功效(Daschner et al ., 1982;迈耶和Cookson, 2010;苏莱曼et al ., 2018),表面清洗剂往往旋转这些设施最小化潜在的抗微生物和/或选择向清洁条件(Murtough et al ., 2001;八婆,2012)。

为NASA无尘室(ISO类8)火星和木卫二航天器组装,地板经常清洗与-1.6% ~ 0.8 v / v Kleenol 30 (大亨et al ., 2018;丹科et al ., 2021),这是一种碱性洗涤剂配方。由于Kleenol 30的所有权性质,缺乏信息关于精确的化学成分。可用的安全数据表指示成分含有钠十二烷基苯磺酸盐(1% w / w),聚乙二醇mono-nonylphenyl醚1 - 5% (w / w),偏硅酸钠w / w(1 - 5%),乙二胺四乙酸(EDTA);2% w / w),偏硅酸钠w / w(1 - 5%),氢氧化钾(KOH;~ 2% v / v;可能从集中准备KOH)和2-butoxyethanol 10 - 15% (w / w)。当考虑清洗Kleenol 30的机理,结合化学成分意味着调整对碱度(KOH),隔绝的过渡和碱土金属通过metal-binding螯合试剂(EDTA和硅酸钠),和隔离,乳化,去除有机物(非极性、极性和带电有机物)洗涤剂行动(聚乙二醇mono-nonylphenyl醚、十二烷基苯磺酸钠和硅酸钠)。

然而,尽管这些健壮的清洗实践,空间飞行器装配设施港持久但低丰度微生物微生物污染水平(丹科et al ., 2021;Hendrickson et al ., 2021)。进一步揭示分子措施的存在一个核心微生物在空间飞行器装配设施,国际空间站(Checinska et al ., 2015;Checinska Sielaff et al ., 2019),临床和操作设施(Shams et al ., 2016;埃林森et al ., 2020;Perry-Dow et al ., 2022)。在空间飞行器装配设施,微生物通常相当多样化虽然低总数量~ 10的措施³-10年⁴16 s rRNA米⁻²(完整的细胞)~ 10⁴-10年⁵16 s rRNA米⁻²第1 - 40(总细胞),OTU m⁻²~ 10²-10年⁴集落形成单位米⁻²,~ 10¹孢子米⁻²(La Duc et al ., 2012;Mahnert et al ., 2015;Moissl-Eichinger et al ., 2015)。

占主导地位的成员之间的核心微生物在航天器和医疗设施不动杆菌(La Duc et al ., 2012;莫拉et al ., 2016;Hendrickson et al ., 2021)。的不动杆菌是一个与脱水耐性相关的革兰氏阴性细菌属(McCoy et al ., 2012;法罗et al ., 2018),辐射公差(La Duc et al ., 2003;McCoy et al ., 2012),bioemulsification (Pirog et al ., 2021)、生物膜的形成(Yeom et al ., 2013;任et al ., 2021)和耐多药(法勒et al ., 2008)。

在大亨et al。(2018),我们表明,不动杆菌radioresistens50 v1,隔绝的表面飞行前的火星奥德赛号轨道飞行器,可以种植的1% v / v Kleenol 30岁的地板清洁剂,而利用乙醇,表面清洁,作为唯一的碳源。另外,查看答:radioresistens50 v1 Kleenol 30被证明收益率三,五,与octaethylene乙二醇,暗示部分降解的聚乙二醇mono-nonylphenyl醚(组件Kleenol 30配方)通过醚键的分离(白色,1993)- - -产生混合聚乙二醇(例如,三,五,octaethylene乙二醇)。

此外,研究表明,临床菌株不动杆菌baumanii容忍苯扎氯铵,杀虫剂和表面清洁,通过生物膜的形成(Rajamohan et al ., 2009)和外排泵基因的表达增加(Fernandez-Cuenca et al ., 2015;Srinivasan et al ., 2015)。此外,对cleanroom-associated生存能力的研究不动杆菌揭示极端公差对过氧化氢水溶液,和地板表面消毒剂;公差的地方也许是最高的革兰氏阴性细菌(McCoy et al ., 2012;Derecho et al ., 2014;大亨et al ., 2018)。这些组合的生存特点可能是关键因素不动杆菌是宇宙飞船的主要成员和医疗微生物。

因此,为了获得分子和定量洞察cleanroom-associated的公差不动杆菌,我们测量的影响Kleenol 30掩藏,培养动力学,细胞内和细胞外代谢物。通过设计,我们异形不动杆菌菌株中分离出不同的进占NASA无尘室飞船装配(如地板和航天器表面)受到不同清洁机制(例如,Kleenol 30层与异丙醇或乙醇对航天器表面)。因此,在这些方面比较支持的假设,重复清洗条件下空间飞行器装配作为选择压力支持或促进生化公差对当地的清洁状况。

2。材料和方法

2.1。材料和条件

菌株的答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens50 v1是通过喷气推进实验室的行星保护文化集合。股票的乙醇(ENG科学)和Kleenol 30(任务实验室、洛杉矶CA;克洛维斯家居)无菌过滤和储存200μL整除在4°C。25毫米Fe的股票的解决方案^{2 +}准备使用硫酸亚铁铵(Fe (NH吗₄)₂(所以₄)₂h·6₂O;他们在超纯水(18 MΩ科学)⁻¹),其次是无菌过滤(0.2μm注射器过滤器,VWR)和存储200μL整除在4°C(没有明显的降水在长期存储)。

集中最小媒体(5 x毫米)准备使用30.0 g Na₂HPO₄h·7₂O(σ),15.0 g KH₂阿宝₄科学(EM), 2.50克氯化钠(费舍尔科学),5.00 g NH₄Cl (EM科学)每升的超纯水。Low-osmolarity媒体(0.2 x M9)通过添加0.4929克MgSO准备₄h·7₂O (EM科学)和0.0147 g CaCl₂h·2₂O (EM科学)200.0毫升5 x毫米,稀释到1.00 L使用超纯水(收益率1 x M9),紧随其后的是一个额外的5倍稀释(200毫升1 x M9 1.00 L)收益率0.2 x M9。最后对离子浓度在0.2 x M9 20μM Ca^{2 +}400μM毫克^{2 +},4.4毫米K⁺,10.7毫米Na⁺,3.7毫米NH₄⁺与5.4毫米Cl⁻,4.5毫米₂阿宝₄⁻,4.4毫米HPO₄²⁻,0.4毫米₄²⁻。

溶原性肉汤媒体(磅)准备使用10.0 g胰蛋白胨(VWR), 5.0克酵母提取物(Amresco), 5.0克氯化钠(费舍尔科学)和1毫升1 M氢氧化钠(Sigma-Aldrich)每升的超纯水。琼脂板准备使用1.0 L磅15 g琼脂(Amresco)。

查看15毫升螺帽进行试管(高硅、硼硅玻璃;13×100毫米),用自来水洗净,用蒸馏水冲洗,热压处理过的实验。所有螺钉帽试管受限紧密和包装封口膜在种植,以防止损失的乙醇,作为唯一碳源提供。查看进行轻微的搅拌(200 rpm)使用新布伦瑞克科学英诺华4200孵化器。细胞密度监测期间培养遵循琼脂板计数和光学密度变化(OD) 600海里(液体20 Genesys)。所有的媒体都在121°C和15 psi热压处理过的45分钟。

2.2。查看Kleenol 30

甘油的股票答:radioresistens50 v1和答:johnsonii2 p08aa分别飞跑到磅琼脂板和孵化的32°C ~ 24小时。孤立的菌落接种到2.0毫升0.2 x包含25μM Fe M9^{2 +}和0 - 2.0%v / vKleenol 30(或0 - 40.0μL)。Pre-cultures发起添加20.0μL 90%v / v乙醇产量最终浓度的150毫米或1.0%v / v乙醇。Pre-cultures种植后期日志阶段(OD ~ 0.6 ~ 12 h)。目标文化准备使用新媒体(2.00毫升)注射20.0μL(1:10 0稀释)各自pre-cultures,由增加1.0%v / v乙醇。

时间变化OD 0-15 h的随访。生长动力学特征是回归分析(Microsoft Excel)使用修改后的版本的龚珀兹方程(生et al ., 1996),它描述了一个非线性的细菌生长模型,和产量增长速度的参数(k),延迟时间(l)和估计的最大相对生物量的变化($\mathrm{日志}\left(N/N_0\right)$)。由最小二乘回归都是最小化的分析。控制文化包含没有接种显示没有增长(OD≤0.002),文化也包含接种但没有乙醇(OD≤0.002),这表明微不足道的生物污染和积累培养期间的非生物粒子。

掩藏late-log阶段的文化(OD ~ 0.4)评估镀上磅琼脂板上。在控制实验中,使用0.2 x M9琼脂板计数板补充与乙醇(使用之前)成果不能复制的,当磅琼脂板相比,可能由于乙醇的吸附差异(在我们的情况下)。平皿计数测定,因此,整除(100μL)的文化(0.2 x M9 / Fe)被转移到2.5毫升微型离心机管,用十进制稀释10⁶0.2倍使用x M9,传播(20μL)磅琼脂板上使用无菌塑料细胞分离器。所有的盘子都用保鲜膜和孵化24小时32°C。盘子≤300殖民地枚举,表示为每毫升的集落形成使用父文化(cfu毫升⁻¹)。

2.3。代谢组学的不动杆菌查看Kleenol 30

文化的答:radioresistens50 v1和答:johnsonii2 p08aa准备描述和收获在早期固定相(OD -0.7 ~ 0.6, 7 - 8 h)离心(3500 rpm)在4°C 15分钟(贝克曼库尔特爱兰歌娜21 r)。离心后,细胞颗粒和上层的分数分离,分别对待。上层清液被保存为500μL整除,使用DNA 110专家DNA SpeedVac干,并存储在−80°C。颗粒状细胞被洗两次0.2 x M9和存储在−80°C。

样本的特征是西海岸代谢组学中心使用气相色谱法和飞行时间质谱(GC-TOF / MS)。总之,干细胞和文化肉汤分别resuspended 2毫升pre-chilled (−20°C)和脱气提取溶剂(乙腈:异丙醇:水,3:3:2),涡流30年代,动摇了5分钟在4°C,由离心澄清(~ 12000克),以及由此产生的浮在表面的蒸发干燥。样本的再悬浮在10μL derivatized 40毫克/毫升盐酸methoxyamine吡啶(30°C, 1.5小时)其次是增加41μL N-methyl-N -(三甲基硅烷基)trifluoroacetamide (80°C, 30分钟);脂肪酸甲酯(例如,C8-C30)另外添加到作为保留指数标记(Barupal et al ., 2019)。

样品被转移到卷曲瓶和分离的安捷伦6890气相色谱仪配有陈健民自动班轮交换系统(ALEX),多功能样品(MPS2)双重铁路、陈健民CIS冷喷射系统(陈健民,Muehlheim,德国),和内置气体净化器(Airgas,二PA)。色谱分离提供使用30 m(0.25毫米身份证。)Rtx-5Sil女士列(0.25μm 95%二甲基二苯聚硅氧烷膜5%)与额外的10 m集成警卫队列(Restek, Bellefonte PA)。载气是99.9999%纯氦的恒流1毫升/分钟。

样卷0.5μL注射10μL年代⁻¹注入速度spitless注射器清洗时间25秒。温度曲线包括1分钟50°C的烤箱温度、增加20°C min⁻¹在14分钟330°C,最终坚持5分钟330°C。温度为280°C是用于传输线之间的气相色谱仪和Leco飞马IV飞行时间质谱仪(单质量分析器)。测量质量范围是85 - 500 Da,扫描速率是17岁光谱⁻¹,电子的能量是70 eV,离子源温度为250°C,检测器电压是1850 V。光谱是用Leco ChromaTOF软件与2.32(圣约瑟夫、MI)和加工使用BinBase数据库系统(Fiehn et al ., 2005,2010年;组织et al ., 2019),量化(5:1)的信噪比和匹配质量高峰Fiehn质量光谱库使用保留指数(RI)和参考质量光谱信息(内部编制的西海岸代谢组学中心)。代谢组学数据(研究ID ST002380 DatatrackID: 3552)储存在美国国立卫生研究院共同基金国家代谢组学数据存储库(Sud et al ., 2016)。

2.4。统计分析

使用未配对比较培养的动力学参数进行了学生的t和一个双向方差分析分析(Microsoft Excel),统计相关性被接受p <0.05,正态分布的数据支持了Shapiro-Wilk测试(过去的4.10;锤et al ., 2001),和差异被认为是相等的。代谢组学数据比较使用单变量、多变量和可视化方法。

离散代谢物的改变(例如,单个代谢物)趋势被确定使用未配对的学生的t测试(Microsoft Excel)修正为多个测试使用错误发现率(罗斯福)罗斯福≤0.20 (Benjamini和业务,1995年)。700年的总代谢产物研究(完整的细胞和胞外代谢物2菌株处理,没有Kleenol 30),正态分布(Shapiro-Wilk测试)~ 92%(646)的表示代谢物。考虑到潜在的常态考虑到样本大小(低估n= 3),正常的代谢产物表现出阈值p> 0.03 (Shapiro-Wilk测试)和的意义p <0.05(学生的t测试)结转的单变量和视觉评估数据。

广泛的结构和代谢的趋势是通过可视化代谢物的变化(p <0.05)使用MetaMapp¹和Cytoscape 3.9.1²(Barupal et al ., 2012),它构成统计组织方法产生的视觉地图安排的代谢物结构模式和代谢途径。确认使用ChemRich取得了广泛的代谢物的变化³(Barupal Fiehn, 2017),统计浓缩工具相比,基于结构和生化类代谢物组。在这项研究中,标准和用户定义的分类在ChemRich包括氨基酸、单糖、糖酸、有机酸、脂肪酸、lipid-related代谢物,nucleotide-related代谢物和兼容的溶质。进行了多元测试使用典型对应分析(过去的4.10;锤et al ., 2001)相关代谢组学发展趋势不同的栽培生长参数和条件。

3所示。结果

3.1。培养和生存的Kleenol 30

在图1一个我们表明,cleanroom-associated不动杆菌在这项研究中,测试答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens50 v1,容易生长在≤1% v / v Kleenol 30 (K30) low-osmolarity水条件下用乙醇作为唯一碳源提供。查看2% v / v K30不产生可衡量的细胞密度。

在0.1% v / v K30, floor-associated的文化答:johnsonii2 p08aa显示没有明显损失生存,随着板数量(~后期日志阶段)有效地显示没有区别(p> 0.05)在(2.1±0.5×10⁷cfu毫升⁻¹)和(2.6±0.1×10⁷cfu毫升⁻¹)的洗涤剂。这些趋势表明定量的生存2 p08aa应变0.1% v / v K30的存在。

对航天器surface-associated答:radioresistens50 v1,相比之下,生存在v / v K30容易降低0.1% (p= 0.006)(传播误差)- 46±6%计算相比之下存在的文化培养(4.0±0.4×10⁷cfu毫升⁻¹)和(8.8±0.7×10⁷cfu毫升⁻¹v / v K30)的0.1%。这些趋势表明~ 50%存活率0.1% v / v K30的存在。

在1.0% v / v K30,生存能力2 p08aa应变(±12%)26日和50 v1应变(±8%)22日减少类似的价值观——显示相比之下存在的文化培养(2 p08aa, 0.7±0.3×10⁷cfu毫升⁻¹;50 v1, 1.9±1.1×10⁷cfu毫升⁻¹)和缺乏(2 p08aa, 2.6±0.1×10⁷cfu毫升⁻¹;50 v1, 8.8±0.7×10⁷cfu毫升⁻¹v / v K30)的1.0%。这些趋势表明1.0% ~ 70 - 80%抑制的v / v K30跨两个菌株。

3.2。在培养动力学的影响Kleenol 30

显示在图1 b- - - - - -D和图2是培养动力学参数和相关的增长曲线答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens50 v1。光学测量(图2空蓝色的圆圈),文化转换比率相对生物量的变化($N/N_0$)假设光学透过率和细胞密度之间的直接关系最初的文化媒体($N_0$)和测量的时候($N$),如中概述生了et al。(1996)。相对生物量的变化(图2,红圈,安装线)被表示为一个对数函数($\mathrm{日志}\left(N/N_0\right)$),绘制了随着时间的推移,和适合的修改版本龚珀兹方程(Eq。1),详细生了et al。(1996)和大亨et al。(2018)。最小化回归了增长速度的参数(k;细胞分裂h⁻¹),估计时间滞后阶段(l;h)和日志的最大相对生物量增加($\mathrm{日志}{\left(N/N_0\right)}_{\mathrm{马克斯}}$;没有单位的尺寸)。

占光散射,最大相对生物量的增加($\mathrm{日志}{\left(N/N_0\right)}_{\mathrm{马克斯}}$)被广泛解读为最大增加完整的细胞,细胞聚合和/或内部和胞外聚合物物质在固定相。在本研究报告从最小化平均价值回归连同标准错误(n= 3 - 5生物复制)。

增长率的比较(k)~ 18%减少的查看2 p08aa应变0.1% v / v K30 (p =0.029)计算相比增长速度的差异(图1 b)没有(0.50±0.01 h⁻¹)和(0.41±0.02 h⁻¹v / v K30)的0.1%。50 v1应变,相比之下,丝毫没有改变增长率(p =0.05)在v / v K30 0.1%——相比之下的利率计算(图1 b)没有(0.39±0.01 h⁻¹)和(0.40±0.02 h⁻¹v / v K30)的0.1%。种植在v / v K30 1.0%,增长率为2 p08aa应变(0.22±0.03 h⁻¹)和50 v1应变(0.35±0.01 h⁻¹)减少~ 56% (p =0.001)~ 13% (p =0.043),分别计算相比之下率(图1 b)没有(2 p08aa, 0.50±0.01 h⁻¹;和50 v1, 0.39±0.01 h⁻¹)的洗涤剂。

由一个因素方差分析比较分析证实,查看在0.1 - -1.0% v / v K30的各自的增长率显著影响2 p08aa (p =0.038,f= 4.256)和50 v1 (p =0.0002,f= 4.459)压力。此外,两因素方差分析分析确认查看K30的存在不同影响增长率的2 p08aa 50 v1菌株(p =0.015,f= 5.318)。这些组合的趋势指数期的行为表明更高的公差对K30的50 v1应变K30为0.1和1.0%。这些趋势是相反的那些从板计数late-log阶段,这表明更高的公差2 p08aa应变。

比较滞后的时间(l)在1.0%和0.1 v / v K30显示减少的菌株在培养(图1 c),这是意想不到的自添加洗涤剂推测抑制增长和增加的时间滞后阶段。2 p08aa应变,本地滞后时间为0.77±0.23 h⁻¹(没有K30)减少可以忽略不计的价值观(~ 0 h) v / v K30在0.1和1.0%。50 v1应变,本地滞后时间为2.61±0.24 h⁻¹是三倍的时间比~两个p08aa应变,减少0.1% ~ 70%,v / v K30 (0.76±0.15 h⁻¹)和v / v K30微不足道的值1.0%。

比较,一个因素方差分析分析确认查看的0.1 - -1.0% v / v K30显著影响各自的滞后时间2 p08aa (p =0.00008,f= 4.256)和50 v1 (p =0.015,f= 4.459)压力。此外,两因素方差分析分析确认查看K30的存在不同影响滞后时间2 p08aa和50 v1菌株(p =0.006,f= 5.318)。这些组合的趋势表明,K30诱发加速进入对数生长期以浓度依赖的方式的迟滞期2 p08aa应变是有效地消除K30 ~ 10倍低丰度相比,50 v1应变——在这种情况下。

比较的最大相对生物量的变化($\mathrm{日志}{\left(N/N_0\right)}_{\mathrm{马克斯}}$在0.1% v / v)查看K30对菌株表现出意想不到的增加(图1 d)。2 p08aa应变,查看v / v K30收益率在0.1% ~ 40%的增加(p =0.026)明显最大生物量比较值时获得的(2.30±0.02)和(2.44±0.04)的0.1%,v / v K30日志转换和会计。同样,对于50 v1应变,查看v / v K30收益率在0.1% ~ 55%的增加(p =0.048)明显最大生物量比较值时获得的(2.28±0.01)和(2.47±0.04)的0.1%,v / v K30日志转换和会计。v / v K30种植在1.0%,2 p08aa应变(1.53±0.18)和50 v1应变(2.07±0.03)表现出减少的~ 80% ~ 40%,明显最大生物量,分别,这是符合增长率下降在这些条件下(分别~ 56和~ 13%)。

比较,一个因素方差分析分析确认查看的0.1 - -1.0% v / v K30显著影响各自的最大相对生物量的变化2 p08aa (p =0.000003,fv1 = 4.256)和50株(p =0.000004,f= 4.459)。此外,两因素方差分析分析确认查看K30的存在不同影响的最大相对生物量的变化2 p08aa 50 v1菌株(p =0.007,f= 5.318)。相结合,这些趋势表明,0.1% v / v K30诱发明显的生物量在固定相的变化。

3.3。在胞内代谢物的影响Kleenol 30

3.3.1。代谢组学方面的考虑

从整个细胞的代谢物答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens50 v1比较栽培后0.1%的缺失和存在v / v Kleenol 30(早期的固定相)。每个应变,整个细胞提取了119细胞内代谢物和自由代谢物的膜(如游离脂肪酸和monoacylglycerols)。两菌株代谢产物显示重要的变化(p <0.05)由于K30栽培中列出表1,在各自的丰度变化(fold-changes);变化保留意义(p <0.05,罗斯福≤0.20)校正后的多个测试用下划线标出。

显示在图3代谢组学的地图2 p08aa和50 v1菌株,这容易显示K30的培养带来的变化。代谢组学的地图(MetaMapp图表)图3被组织通过网络KEGG反应物双(黑色边缘或箭头)和Tanimoto化学相似性得分(灰色边缘或箭头)。提出了检测代谢物作为节点(圈)。重要更改为红色突出显示节点(相对丰度增加),蓝色节点(相对丰度降低),或黄色节点(没有变化)。节点的大小表示的相对程度的改变(或叠化)。

2 p08aa应变(图3一),查看在0.1% v / v K30收益率没有明显的统计学影响整个细胞代谢物。没有观察到变化后占多个测试(罗斯福≤0.20,n= 119)。没有变化是观察当使用ChemRich解析数据。而潜在的增加(p葡萄糖酸< 0.05)中观察,分析ChemRich提供不支持广泛的糖酸含量的变化。尽管潜力(p< 0.05)减少树胶醛醣和增加在山梨糖醇,分析在ChemRich显示不支持广泛的单糖组成的变化。同样,ChemRich分析提供不支持广泛lipid-related代谢物的变化尽管潜力(p< 0.05)减少phosphoethanolamine和增加乙醇胺和二十二烷酸(22:0;长链饱和脂肪酸)。

相比之下,50 v1应变显示多个胞内代谢物的变化由于0.1% v / v K30(种植表1)。修正后为多个测试(n = 119),显著降低观察赖氨酸,高丝氨酸、鸟氨酸,甘露醇,腺苷′一磷酸(5 ' amp), 5′-methylthioadenosine (5′mta),和2,5-dihydroxypyrazine。整个细胞代谢组学为50 v1应变地图图3 b解析使用MetaMapp和ChemRich和扩大在单变量分析来揭示微分氨基酸的变化,兼容的溶质,nucleotide-related代谢物,二元羧酸酸、糖酸和饱和脂肪酸。

影响氨基酸(p =9.1×10⁻⁶;问= 6.7×10⁻⁵;ChemRich)支持减少的相对丰度标准氨基酸(甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和缬氨酸),非标准氨基酸(β-alanine,高丝氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸),和一个肽(alanine-alanine)。二聚甘氨酸的分析条件下检测2,表明了5-dihydroxypyrazine (Haffenden Yaylayan, 2005)与观察到的减少2,5-dihydroxypyrazine普遍一致的文化,K30减少甘氨酸。

影响到兼容的溶质(p =9.6×10⁻⁶;问= 6.7×10⁻⁵;ChemRich)支持减少甘露醇(Empadinhas da Costa, 2008;Tam et al ., 2022),以及甘油酸酯和磷酸甘油酸参与兼容的溶质的生物合成(Franceus et al ., 2017)。影响nucleotide-related代谢物(p =5.2×10⁻⁴;问= 2.4×10⁻³;ChemRich)支持减少5 '焦磷酸amp, MTA、胸苷、尿嘧啶,连同增加cytidine-5′一磷酸(5 ' cmp)。影响双羧酸的酸(p =4.8×10⁻³;问= 1.7×10⁻²;ChemRich)支持增加延胡索酸酯,苹果酸和酒石酸。影响不饱和脂肪酸是观察(p =0.11;问= 0.31;ChemRich)尽管isopentadecanoic减少酸(支链饱和脂肪酸;13-methyl-14:0或15:0 iso)和增加硬脂酸(饱和脂肪;18:0)。

3.3.2。代谢因素

代谢组学的交叉引用KEGG数据库收益率的变化可能影响为50几个细胞内途径v1应变。括号中提供相关KEGG通路或反应标识符。

抑制或减少甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(map00260)支持减少细胞内甘油酸酯、3 -磷酸甘油酸,丝氨酸、甘氨酸、高丝氨酸。抑制或减少赖氨酸生物合成(map00300)和缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸和生物合成(map00290)支持减少赖氨酸和缬氨酸;然而,其他任何更改在各自的途径。

抑制或减少脯氨酸和精氨酸生物合成精氨酸和脯氨酸代谢(map00330)和精氨酸生物合成(map00220)支持减少鸟氨酸,瓜氨酸和脯氨酸。缺乏对尿素的丰度的变化表示没有可衡量的影响通量的尿素循环——尽管减少鸟氨酸和瓜氨酸。缺乏观察精氨酸是暗示精氨酸转换成鸟氨酸在分析条件下(Halket et al ., 2005)或有限的自由细胞中精氨酸的存在。

抑制或减少肽聚糖生物合成(map00550)和/或肽(蛋白质)的合成是alanine-alanine提出的减少。抑制或减少β-alanine新陈代谢β-alanine (map00410)支持的减少,进而是减少精氨酸和尿嘧啶退化的暗示。微分脂肪酸代谢的变化(map01212)建议的减少在自由isopentadecanoic酸(反应R02663)和增加免费硬脂酸。

抑制或改变磁通通过糖酵解(map00010)建议减少3 -磷酸甘油酸。激活或改变通量组件的柠檬酸循环提出增加延胡索酸酯和苹果酸。抑制或减少选择的单糖通过果糖和甘露糖代谢通量(map00051)和戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象(map00040),分别提出了减少甘露醇和阿拉伯糖。

微分核苷酸代谢的变化(map01232)建议增加5的cmp和5′mta,以及减少5 ' amp,焦磷酸,胸苷、尿嘧啶。此外,抑制或减少嘧啶代谢(map00240)建议减少尿嘧啶和胸苷。

3.4。在胞外代谢物的影响Kleenol 30

显示在图3生化地图,比较胞外代谢物来自哪里答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens50 v1(固定相)。/应变,干肉汤培养细胞(免费的)总共56个代谢物,处理和可视化如上所述。中列出的表2是细胞外代谢组变化2 p08aa和50 v1菌株培养后没有,v / v K30存在0.1%。通路分析没有进行胞外代谢物。

当分组通过生化类、查看K30 2 p08aa应变的收益率差影响胞外糖酸,单糖,有机酸(di -和一元羧酸)。然而,单变量修正多个测试后测试显示没有变化。影响糖酸(p =1.4×10⁻⁵;问= 6.9×10⁻⁵;ChemRich)支持大幅增加细胞外葡萄糖酸内酯(22倍)和甘油酸酯(34倍)。影响di -和一元羧酸,分组为有机酸(p =3.0×10⁻⁴;问= 7.6×10⁻⁴;ChemRich),支持增加草酸和减少在己二酸(己二酸)和3,4-dihydroxybenzoate (protocatechuate)。影响细胞外单糖(p =7.6×10⁻³;问= 1.3×10⁻²;ChemRich)支持大幅增加细胞外果糖(4.5倍),半乳糖(22倍)和甘露糖(57-fold)和减少(2.5倍)在细胞外核糖(戊糖)。

相比之下,查看K30 - 50 v1应变的多个测试(校正后n= 56)-细胞外galactonate产生重大变化,葡萄糖酸,葡萄糖酸内酯、甘油酸酯、甘露糖、核糖、酒石酸,4-hydroxybutyrate,α-ketoglutarate。同样,分组通过生化类显示重要的胞外代谢物的变化。

影响糖酸(p =1.9×10⁻⁸;问= 9.6×10⁻⁸;ChemRich)支持大幅增加细胞外galactonate (36-fold),葡萄糖酸(46-fold),葡萄糖酸内酯(8.8倍),甘油酸酯(9.3倍),和2-methylglycerate(1.9倍)。影响细胞外有机酸(p =7.8×10⁻²;问= 0.16;ChemRich)建议的酒石酸和显著降低α-ketoglutatate明显增加,随着潜在的减少citramalate和4-hydroxybutyrate。影响细胞外单糖(p =9.6×10⁻²;问= 0.16;ChemRich)提出的显著增加细胞外甘露糖(20倍)和显著降低核糖(2.5倍)。

3.5。Kleenol 30对培养和细胞内代谢物的影响

3.5.1。典型相关分析

在图4,我们用典型相关分析(CCA),分别比较代谢物答:johnsonii2 p08aa (n= 3),答:radioresistens50 v1 (n= 3)不同定量描述符描述培养媒体和生长动力学的变化没有,v / v K30的0.1%。细胞内的相关性(或完整的细胞)来自指数期晚期文化的代谢物进行评估与增长率在指数期,板计数在late-log阶段,最大相对生物量在固定相,和总洗涤剂浓度在媒体上,这被认为是0.025% w / w在文化包含0.1% v / v K30。

CCA情节包括总阵列检测代谢物(文本),列出定量描述符(矢量线)和转换数据降维后(符号)。2 p08aa v1和50株,更强的相关性沿着CCA轴1(61.70 69.46%)观察相比,CCA轴2(24.72 23.70%),分别为。降维的代谢物2 p08aa v1和50株(数字4,B)分别显示之间的清晰分离样品准备没有,v / v K30的0.1%。这些趋势表明,菌株的胞内代谢组学作品中影响K30种植。以下小节中描述的定量描述符进行比较。为选定的代谢物,额外澄清和/或脂肪酸缩写提供了括号。

3.5.2。生存的比较

当考虑生存的变化(图4一),2 p08aa应变向量描述板计数(日志后期阶段)与降低条件与0% v / v K30(满红色的方块)。这种相关性表明生存趋势2 p08aa应变(在0至0.1% v / v K30)与有限的胞内代谢物的变化相关联。这个评估符合相关的单变量测试表明没有板计数的变化(p> 0.05)或代谢物的丰度2 p08aa应变0.1% v / v K30(罗斯福> 0.20)。

2 p08aa应变(CCA情节的图4一),代谢物趋势与板计数包括海藻糖、trehalose-6-phosphate fructose-6-phosphate,潜在glucose-6-phosphate。单变量实验推断没有这些代谢物的丰度的变化(p> 0.05或罗斯福> 0.20)。这些趋势表明,定量生存2 p08aa应变(部分)与缺乏中央新陈代谢的变化和溶质形成兼容。

50 v1应变(图4 b),矢量描述板计数与降低条件与0% v / v K30(粉色圆圈)。这种相关性表明生存趋势50 v1应变(在0至0.1% v / v K30)与有限的胞内代谢物的变化相关联。这个评估是与相关的单变量的测试支持~ 50%减少生存(p< 0.05)和大量的代谢物的变化(p< 0.05,富兰克林·德兰诺·罗斯福≤0.20)。

为50 v1应变(CCA的情节图4 b),代谢物趋势与板计数包括4-hydroxybenzoate,几个氨基酸(类似表1)、ribose-5-phosphate N-acetylglucosamine、烟碱酸、苯乙酸,bisphosphoglyercol,可能5 ' amp和5′mta。这些趋势表明,生存的50 v1应变与中央新陈代谢的变化,氨基酸代谢、核酸代谢,和细胞壁代谢(如glycosoaminoglycans和肽聚糖代谢,基于N-acetylglucosamine)。

趋势CCA情节的50 v1应变(图4 b)另外暗示本机苯代谢的变化(例如,苯乙酸和4-hydroxybenzoate)。然而,单变量分析收益率不支持(p >0.05)明显的减少苯乙酸(~ 0.1倍下降)和4-hydroxybenzoate(~ 0.9倍下降)。另外,进一步描述部分3.5.3,苯乙酸和4-hydroxybenzoate K30的潜在生物降解产品。因此,50 v1的应变趋势暗示K30的潜在的生物降解苯的新陈代谢。

3.5.3。比较相对生物量最大

当考虑生物量、向量描述的最大相对生物量在固定相2 p08aa应变(图4一)与降低条件与0.1% v / v K30(黑色的三角形)。这种相关性表明趋势的最大相对生物量2 p08aa应变(在0至0.1% v / v K30)与胞内代谢物的变化相关联。这个评估是为培养符合相关的单变量测试数据,支持增加的最大相对生物量(p< 0.05),但与相关代谢组学数据的单变量测试表明没有相对的代谢物含量的变化后多个测试校正(罗斯福> 0.20)。

2 p08aa应变(CCA情节的图4一),代谢物趋势和最大相对生物量包括蛋氨酸、二十四烷酸(脂肪酸;23:0),oxoproline, glucose-1-phosphate。单变量测试显示没有改变这些代谢物的相对丰度(罗斯福> 0.20)。这些组合的趋势表明,增加最大相对生物量与很少或没有葡萄糖代谢的变化,氨基酸代谢,不饱和脂肪酸含量。

50 v1应变(图4 b),矢量描述的最大相对生物量与降低条件与0.1% v / v K30(黑色的三角形)。这种相关性表明趋势的最大相对生物量50 v1应变(在0至0.1% v / v K30)与胞内代谢物的变化相关联。这个评估是对培养符合相关的单变量测试数据(p< 0.05)和代谢组学数据(p< 0.05,罗斯福≤0.20),产量增加支持的最大相对生物量和微分代谢物含量的变化。2 p08aa应变相比,这些趋势50 v1应变表明,增加的最大相对生物量与一些细胞内代谢组变化相关联。

为50 v1应变(CCA的情节图4 b),代谢物的趋势在增加最大相对生物量包括二十四烷酸(脂肪酸;23:0)、色氨酸、黄嘌呤、硬脂酸(脂肪酸;18:0),α-ketoglutarate、磷酸盐、4-hydroxybutanoate (4-hydroxybutyric酸),4-aminobutanoate (4-aminobutyric酸),O-phosphoserine 1-monopalmitin (1-palmitoylglycerol;棕榈酰= 16:0)、二十二烷酸(脂肪酸;22:0)和2-monoolein (2-oleoylglycerol;油酰= 18:1^Δ9)。这些趋势表明,增加的最大相对生物量50 v1应变相关(至少)butanoate新陈代谢的变化(例如,4-hydroxybutanoate和4-aminobutanoate),氨基酸代谢(例如,色氨酸,α-ketoglutarate和O-phosphoserine)和磷酸盐代谢(磷酸和O-phosphoserine)。

50 v1应变(的趋势图4 b)也表明与游离脂肪酸和monoacylglycerols的变化;在相关代谢物的CCA情节(括号)和各自的单变量分析包括二十四烷酸(~ 1.2倍增加;p >0.05),硬脂酸(~ 1.5倍增加;p >0.05),1-monopalmitin(~ 2.2倍增加;p >0.05)、二十二烷酸(~ 10倍增加;p >0.05)和2-monoolein(~ 32倍增加;p >0.05)。然而,相比之下,ChemRich分析收益率不支持细胞内脂肪酸的变化。

此外,趋势CCA情节的50 v1应变(图4 b)支持的最大相对生物量和代谢之间的相关性polyhydroxyalkanoates (pha)的胞内聚合物(例如,poly-4-hydroxybutanoate和/或其他段共聚物)用于碳和能源储存(肯纳先生和斯利瓦斯塔瓦,2005年)。代谢物的趋势和最大相对生物量α-ketoglutarate,谷氨酸,4-aminobutanoate, 4-hydroxybutanoate。这些组合的代谢物代表逐步向pha的合成途径(KEGG地图00250和map00650),氧化碳在哪里获得通过三羧酸循环顺序(α-ketoglutarate)和穿梭通过氨基酸代谢(谷氨酸)和butanoate新陈代谢(4-aminobutanoate)产生一个单体的单位(4-hydroxybutanoate)在pha随处可见。

在一起,这些观察相关自pha的积累会导致增加的相对光密度(Slaninova et al ., 2018),这是符合我们生长曲线和随后的回归分析,产量增加的最大相对生物量0.1% v / v K30的存在。因此,50 v1应变,最大相对生物量的增加可能与增加合成pha K30所强加的压力之下。

3.5.4。比较,增长率

当考虑增长率(对数生长期),2 p08aa应变向量(图4一)与降低条件与0% v / v K30(红色方块)。这种相关性表明,增长率趋势2 p08aa应变(在0至0.1% v / v K30)与有限的胞内代谢物的变化相关联。这个评估符合相关的单变量测试支持适度减少~ 18%的增长率(p< 0.05)和相关的单变量测试意味着没有变化的代谢物的相对含量,(罗斯福> 0.20)。

从CCA的情节2 p08aa应变,代谢物趋势与增长率包括9 -十六碳烯酸(脂肪酸;16:1^Δ9),5′mta,核糖,几个氨基酸,油酸,N-acetylglucosamine 5安培。这些趋势表明,增长率的降低与氨基酸代谢的变化,细胞壁代谢、核酸代谢。趋势还建议免费的不饱和脂肪酸含量变化的关系通过对9 -十六碳烯酸(~ 0.7倍下降;p >0.05)和油酸(~ 0.3倍下降;p >0.05)。然而,ChemRich分析收益率不支持不饱和脂肪酸代谢的变化。

50 v1应变(图4 b),相比之下,向量描述增长率重叠更紧密地与相关的降低条件0.1% v / v K30(黑色的三角形)。这种相关性表明,增长率趋势为50 v1应变(v / v K30在0到0.1%)与胞内代谢物的变化相关联。相比之下,单变量测试培养增长率数据显示没有变化(p> 0.05),而对代谢组学的数据单变量测试支持多种代谢物(丰度的变化p< 0.05,富兰克林·德兰诺·罗斯福≤0.20)。这些组合的趋势暗示大量post-exponential代谢物的变化阶段,作为50 v1应变增长率在指数期是不变的——并可能与多个代谢组变化观察late-log阶段。

3.5.5。洗涤剂浓度的比较

当你考虑K30配方(数字4,B),向量描述洗涤剂浓度(w / w ~ 0 - 0.025%)重叠与降低条件与v / v K30为2 0.1% p08aa v1和50株(黑色的三角形)。这些相关性表明了两株代谢物调整以应对v / v K30洗涤剂在0.1%。我们注意到洗涤剂浓度可能重叠的趋势的最大相对生物量,在相同的情节各个象限。

2 p08aa应变,代谢物趋势与洗涤剂浓度包括肉豆蔻酸(脂肪酸;14:0)、壬酸(脂肪酸;9:0)、4-hydroxybenzoate苯乙酸、二十二烷酸(脂肪酸;22:0)。4-hydroxybenzoate趋势和苯乙酸支持向潜在的生物降解的十二烷基苯磺酸盐和聚乙二醇mono-nonylphenyl醚,K30的洗涤剂配方。中描述的哈希姆et al。(1992),苯乙酸是一个潜在的微生物降解的产物的十二烷基苯磺酸盐的氧化(或代谢)十二烷基组(屈服4-sulfonylphenylacetic酸),其次是desulphonization(产生苯乙酸)。同样,我们认为生物降解的聚乙二醇mono-nonylphenyl醚能产生4-hydroxybenzoate通过聚乙二醇的分离单元(收益率4-nonylphenol),如第1部分所述后跟氧化或代谢的壬基侧基(屈服4-hydroxybenzoate)。相比之下,但是,单变量测试产量不支持丰度的变化对苯乙酸(~ 2.4倍增加;p= 0.39)和4-hydroxybenzoate(~ 1.5倍增加;p= 0.11)。

2的趋势p08aa应变之间的相关性也暗示洗涤剂浓度和游离脂肪酸含量的变化。相关代谢物CCA情节(括号)和相关的单变量分析包括二十二烷酸(~ 15倍增加;p< 0.05),肉豆蔻酸(~ 1.2倍增加;p> 0.05)和壬酸(~ 1.4倍增加;p> 0.05)。我们注意到二十二烷酸水平河流生物膜增加暴露在干燥后(Serra-Compte et al ., 2018)。我们还推测长链饱和脂肪酸含量的增加可能促进细胞内的聚合与洗涤剂和/或膜空间,它有可能作为生存机制在生物降解和/或收购战略。然而,分析由ChemRich收益率不支持脂肪酸或lipid-related代谢物的变化。

50 v1应变(图4 b),代谢产物,这一趋势与洗涤剂浓度包括酒石酸、1-monoolein (1-oleoylglycerol;油酰= 18:1^Δ9)和十八醇(脂肪醇)。这些趋势暗示的增加细胞内二羧酸(酒石酸)和自由lipid-related分子(1-monoolein和十八醇),这可能,分别与金属保留在细胞内或细胞和洗涤剂的聚合膜空间。

3.6。影响Kleenol 30的查看和胞外代谢物

3.6.1。典型相关分析

在图4,我们用典型相关分析(CCA),分别比较了胞外代谢物答:johnsonii2 p08aa (n= 3),答:radioresistens50 v1 (n= 3)指数期晚期文化的定量描述符在指数增长阶段,板计数在late-log阶段,最大相对生物量在固定相,和总浓度EDTA和偏硅酸钠的媒体,这是假定为0.02% w / w在文化包含0.1% v / v K30。

CCA情节的图4 c,D比较结果从0和0.1% v / v K30,包括总阵列检测代谢物(文本),列出定量描述符(行)和转换数据降维后(符号)。2 p08aa v1和50株,更强的相关性沿着CCA轴1(67.18 82.53%)观察相比,CCA轴2(32.81 11.10%),分别为。降维的代谢物2 p08aa v1和50株(图4 c,D)分别显示之间的清晰分离样品准备没有,v / v K30的0.1%。这些趋势表明,两菌株的细胞外代谢组学作品中影响K30种植。以下小节中描述的定量描述符进行比较。为选定的代谢物,额外提供了解释和/或脂肪酸缩写括号。

操作。生存和增长速度的比较

当考虑生存和查看,向量板计数和2 p08aa应变增长率(图4 c)重叠以减少计算与0% v / v K30(红色钻石)。这些相关性表明,生存和增长趋势2 p08aa应变(在0至0.1% v / v K30)与最小的胞外代谢物的变化。这些评估大致符合相关的单变量分析表明定量掩藏,~增长率减少18%,以及缺乏胞外代谢物的变化(校正后多个测试)。

CCA的情节,代谢物从2 p08aa应变这一趋势与板数量和增长率包括2-isopropylmalic酸、焦磷酸、磷酸盐、花生酸(脂肪酸;20:0)、月桂酸(脂肪酸;12:0),癸酸(脂肪酸;10:0),4-hydroxyphenyllactic酸、山梨糖醇、和isopentadecanoic酸(13-methyl-14:0)。这些趋势2 p08aa应变表明生存(这并不影响)和增长率(最低限度减少)与缺乏细胞外的丰度变化的饱和脂肪酸,磷酸盐、焦磷酸盐、α-hydroxy酸(2-isopropylmalic酸和4-hydroxyphenyllactic酸)。然而,潜在的增加在细胞外山梨糖醇(~ 5倍增加,p <0.05;表1溶质)暗示流出的兼容。

50 v1应变(图4 d),相比之下,向量描述板计数与降低条件与0% v / v K30(粉红色钻石),而向量描述适度增长与减少条款与0.1% v / v K30(黑色的三角形)。这些对立的相关性表明,生存的趋势(在0至0.1% v / v K30)与最小的胞外代谢物的变化相关联,而增长率趋势(在0至0.1% v / v K30)与更明显的胞外代谢物的变化。

代谢物的趋势与板数为50 v1应变包括2-isopropylmalic酸,2-hydroxyglutarate,琥珀酸,α-ketoglutarate。这些结果表明,50 v1的生存压力变化有关细胞外α-hydroxy酸(2-hydroxyglutarate 2-isopropylmalic酸,和α-ketoglutarate)和二羧酸(琥珀酸);在单变量测试支持细胞外α-ketoglutarate ~ 9倍减少。代谢物的增长趋势与50 v1应变包括塔格糖和N-acetylglucosamine,这表明改变细胞外单糖与维护稳定的增长率。

3.6.3。比较最大相对生物量和螯合剂浓度

当考虑最大相对生物量的变化(固定相)和螯合剂浓度(EDTA和硅酸钠K30配方),类似的趋势观察2 p08aa 50 v1菌株(图4 c,D)。向量描述螯合剂浓度对菌株重叠以减少计算与0.1% v / v K30(黑色的三角形)。这些相关性表明两菌株胞外代谢物调整以应对变化的螯合剂浓度在0到0.1% v / v K30(例如,金属隔离剂EDTA和硅酸钠)。

2 p08aa应变,CCA情节的代谢物的变化趋势和最大相对生物量和/或螯合剂浓度包括threonate,果糖,草酸,galactonate,葡萄糖酸,葡萄糖酸内酯、甘露糖、半乳糖和甘油酸酯。这些趋势表明,螯合剂浓度影响细胞外单糖的丰度和糖酸。虽然这些趋势是一致的单变量测试(p< 0.05),不支持的丰度变化相关的代谢物(表2)校正后得到多个测试(罗斯福≤0.20)。

50 v1应变,代谢物的变化趋势和最大相对生物量和/或螯合剂浓度包括N-acetylglucosamine,酒石酸,2-methylglycerate,葡萄糖酸内酯、甘油酸酯,甘露糖galactonate和葡萄糖酸。这些结果表明,螯合剂浓度影响细胞外单糖的丰度,修改后的单糖和糖酸。这些评估通常是一致的单变量分析。

4所示。讨论

4.1。Spacecraft-associated不动杆菌

分子见解spacecraft-associated的宽容不动杆菌向Kleenol 30日,NASA的洁净室地板清洁剂,是通过培养获得的,动力学和代谢组学的方法。比较了使用答:johnsonii2 p08aa和答:radioresistens分别50 v1,孤立在独特的位置在空间飞行器装配设备,受到不同的清扫制度。

压力答:johnsonii2 p08aa孤立从地板上的凤凰号火星探测器)组装设备,定期清洗Kleenol 30。压力答:radioresistens50 v1隔绝的表面飞行前的火星奥德赛号轨道飞行器,这可能与异丙醇清洗(丙胺,异丙醇,异丙醇)和从未接触过Kleenol 30。

因此,比较在这些不同的方面提供了最初的见解的影响反复清洗,航天器组装的条件下,对生化和种植选择。

4.2。spacecraft-associated生存不动杆菌针对Kleenol 30

查看包含0 - 2.0% v / v Kleenol 30 (K30)进行low-osmolarity最小媒体(0.2 x M9, 25μM Fe)包含150毫米乙醇,作为唯一碳源提供。培养媒体包含2.0% v / v K30杀菌测试不动杆菌,这表明biocide-type K30的活动。

相比之下,在1.0% v / v K30,明显的栽培公差观察2 p08aa和50 v1菌株。文化包含1.0% v / v K30展出(1)~ 20 - 30%的幸存者,(2)~ 66年增长率和12%的减少,和(3)消除迟滞期时间2 p08aa 50 v1菌株,分别。这些培养公差< 2% v / v K30是重要的因为当前的NASA行星保护实践利用-1.6% ~ 0.8 v / v K30地板清洗。因此,我们的研究结果表明spacecraft-associated不动杆菌港容忍当前地板清洗实践NASA无尘室。

在0.1% v / v K30,微分的影响观察整个培养参数。2 p08aa应变、文化表现出(1)没有可衡量的变化在细胞密度late-log阶段(板计数),(2)适度降低经济增长率(~ 18%),和(3)可以忽略时间的滞后阶段。这些结果表明,K30影响2 p08aa应变加速增长的滞后阶段,在指数阶段稍微抑制增长,产生任何更改培养后细胞密度late-log阶段。

50 v1的应变、文化表现出(1)~ 50%的幸存者,(2)没有增长率的变化,(3)~ 70%减少滞后阶段。这是表明K30影响50 v1应变温和加速增长的滞后阶段,收益率没有改变在在指数增长阶段,并抑制细胞密度~ 50%时培养late-log阶段。

微分种植趋势观察0.1% v / v K30表明应变和增长阶段应对K30的依赖。反过来,这些趋势表明,K30减少养分生物利用度文化(例如,碱土金属和过渡金属)和/或引出特定生化反应(例如,K30和/或代谢酶抑制K30)——在一起表现为加速度滞后阶段对两株,轻微的抑制细胞分裂的速度,在指数期2 p08aa应变,和温和的减少总细胞密度late-log 50 v1应变阶段。

4.3。代谢组学分析栽培公差对Kleenol 30

获得代谢见解的公差Kleenol 30 (K30),我们使用文化增长在0.1% v / v K30获得可靠的两株生物量中late-log阶段(参见对比w / w K30 0.1和1.0%图1 d)。为答:johnsonii2 p08aa,查看有0.1% v / v K30展出(1)没有明显的和谨慎的丰富的胞内代谢物的变化,(2)在考虑几个重要的细胞外的变化更广泛的分类如糖酸,单糖,有机酸(di -和一元羧酸),脂肪酸,和(3)的潜在支持生物降解和代谢K30的洗涤剂配方。

合并后的结果2 p08aa应变表明,本机和细胞内的代谢状态2 p08aa应变容易适应培养v / v K30的0.1%。2 p08aa应变的趋势也表明生存与调整有关生物降解的胞外代谢物和潜在Kleenol 30洗涤剂。

为答:radioresistens50 v1,查看在0.1% v / v K30展出(1)微分中胞内氨基酸的总量的变化,兼容的溶质,nucleotide-related代谢物,二元羧酸酸、和饱和脂肪酸,(2)实质性和微分的丰度变化胞外糖酸,单糖,有机酸,(3)没有清晰的统计支持生物降解和代谢K30的洗涤剂配方(不包括潜在的退化通过苯代谢)。

这些结果为50 v1应变表明,胞内和胞外代谢物50 v1应变显著调整,以适应培养v / v K30的0.1%。这些趋势也表明生存与细胞内的氨基酸和肽代谢变化,核苷酸代谢,中央代谢、脂肪酸代谢、和嘧啶代谢。

50 v1应变,氨基酸代谢的变化包括减少赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸、鸟氨酸,高丝氨酸、缬氨酸和其他上市表1。这是相关的,因为减少赖氨酸和缬氨酸期间观察到的生物膜的形成答:baumanni1656 - 2 (Yeom et al ., 2013),而减少在氨基酸代谢治疗后观察答:baumanniAB5075与混合抗生素(多粘菌素B和利福平)(赵et al ., 2021)。在大肠杆菌UTI189,减少细胞内与生物膜形成相关的赖氨酸和缬氨酸(陆et al ., 2019)。在Bifodobacterium bifudum,减少细胞内赖氨酸、精氨酸和脯氨酸与生物膜的形成(Sadiq et al ., 2020)。这些观察表明,不动杆菌经历压力如反应向K30抑制总细胞群(如生存),其中可能包括生物膜早期发育的变化。

趋势在核苷酸含量,并培养方面也同样暗示早期biofilm-type开发(Sarkar Chakraborty, 2008;Castillo-Juarez et al ., 2017)和/或群体感应相关的变化,如细胞内PHA合成(凯斯勒Witholt, 2001;徐et al ., 2011)。这些趋势包括增加的最大相对生物量条款2 p08aa v1和50株,减少5′mta和5 ' 50 v1应变,amp,大幅增加细胞外单糖(如甘露糖、半乳糖和果糖2 p08aa应变)。

相比之下,生物膜大肠杆菌UTI189显示减少5′mta和5 ' cmp,以及增加metal-binding含铁细胞,当铁^{3 +}浓度在文化减少从10到1μM (郭et al ., 2021)。降低了5′mta丰度与生物膜的相关联铜绿假单胞菌PAO1 (Tielen et al ., 2013)。在荧光假单胞菌PF08,体内还说5安培抑制生物膜的形成(王et al ., 2021)。在酿脓链球菌甘露糖诱发的进口溶菌酶抵抗通过群体感应途径(Chang et al ., 2015);而体内添加半乳糖抑制和激活不同的不同物种的生物膜的发展链球菌(Ryu et al ., 2016)。

4.4。生化策略对Kleenol 30

获得生物化学机制的见解宽容,代谢组学发展趋势解读在上下文的培养条件。在这项研究中,进行了查看low-osmolarity媒体(0.2 x M9)补充25μM菲^{2 +}(Fe (NH₄)₂(所以₄)₂),缓慢氧化菲^{3 +}下的有氧查看封顶玻璃管(每吸光度光谱)。然而,在控制实验中,文化补充(Fe (EDTA))¹⁻相比增长慢,Fe (NH)₄)₂(所以₄)₂在酸洗玻璃器皿,查看了没有增长。因此,在培养条件下,锌等微量元素和物种^{2 +}、有限公司^{2 +}、铜^{2 +}、锰^{2 +},波₃³⁻(硼酸;B源),牛叫声₄²⁻(钼酸;莫来源)可能获得微量污染物在媒体和/或玻璃器皿。

这些细节相关自K30包含EDTA和偏硅酸钠,螯合剂,隔离过渡和碱土金属。因此,在文化、EDTA螯合的可能限制过渡金属的生物利用度和抑制增长,控制研究中观察到。有限的生物利用度为Ca^{2 +}和毫克^{2 +}预计自偏硅酸钠(Na₂SiO₃)是一种水柔软剂,通过离子交换功能通过螯合钙的^{2 +}或毫克^{2 +}(和Na的释放⁺)。

根据这些考虑,因此,我们对胞外代谢物揭示一些生化药剂具有流变性质的变化。评估的文献表明,糖酸如galactonate、葡萄糖酸,葡萄糖酸内酯形成明显稳定的复合物与过渡金属如铁^{3 +}、锌^{2 +}、有限公司^{2 +}、铜^{2 +}、锰^{2 +}(索耶,1964;吹毛求疵的人et al ., 1989;Frutos et al ., 1998;Gyurcsik伊,2000年)。碱土金属的Ca^{2 +}和毫克^{2 +}与糖酸形成稳定的复合物,如葡萄糖酸内酯和甘油酸酯(Taga et al ., 1978;米et al ., 1979;Tajmir-Riahi 1990),单糖如甘露糖(Angyal 1973)、草酸和有机酸如(Chutipongtanate et al ., 2013;Izatulina et al ., 2018)和酒石酸(霍桑et al ., 1982)。此外,硼酸和Ca^{2 +}形成稳定复合物与葡萄糖酸、甘油酸酯和酒石酸(范Duin et al ., 1987);虽然钼酸和甘露糖和果糖(收益率稳定复合物斯宾塞和西藏野驴,1963;萨特et al ., 1996)。

生化反应,因此,这些观察结果表明,2 p08aa应变目标跟踪Ca^{2 +}和毫克^{2 +}潜在收购通过增加细胞外甘油酸酯、葡萄糖酸内酯、草酸,但不是通过葡萄糖酸和galactonate绑定过渡和碱土金属,但没有检测到。相比之下,50 v1应变潜在目标过渡和碱土金属的增加(p <0.05,罗斯福≤0.20)在细胞外葡萄糖酸,galactonate,甘油酸酯、葡萄糖酸内酯、酒石酸。事实上,增加甘油酸酯出口支持的50个v1应变增加细胞外甘油酸酯和减少细胞内甘油酸酯。控制细胞内钙^{2 +}保留也建议通过增加额外的酒石酸,细胞内。多元测试支持这些总趋势和表明,螯合剂浓度(从K30配方)影响细胞外的丰度metal-binding生化药剂。

因此,我们的结果表明,规章制度(本身在细胞外的微量元素是常见的生存特性spacecraft-associated收购策略不动杆菌。未来的研究使用集中和澄清培养媒体可能产生光谱对微量金属螯合的支持。其他常见的生存功能可能包括监管渗透性,所显示减少细胞内溶质的兼容50 v1应变(如甘油酸酯、3 -磷酸甘油酸和甘露醇),统计协会(CCA情节)在细胞内生存和变化之间兼容的溶质(如海藻糖)2 p08aa应变,并增加在一个细胞外兼容的溶质2 p08aa应变(例如,山梨糖醇)。

当考虑到细胞内发生变化时,不同反应0.1% v / v K30观察到的2 p08aa和50 v1菌株。而有限的细胞内的反应是观察2 p08aa应变,实质细胞内50 v1应变变化是观察。多元测试50 v1应变支持潜力的合成光散射pha在固定相响应v / v K30的0.1%。同理,单变量测试建议减少出口α-ketoglutarate和4-hydroxybutanoate(例如,减少细胞外丰度),而多元测试显示细胞内PHA合成之间的相关性(例如,α-ketoglutarate 4-aminobutanoate, 4-hydroxybutanoate)和增加明显的最大相对生物量。

2 p08aa应变、多元分析突出的部分代谢潜力洗涤剂(从Kleenol 30配方)——作为一个额外的生物的生存战略。虽然这些准确的趋势并没有观察到50 v1应变,多元测试确实支持生存和退化的变化之间的相关性芳香族化合物(苯代谢)。在支持,gc - ms研究大亨et al。(2018)聚乙二醇的分离提供了证据mono-nonylphenyl醚的50 v1应变。未来需要有针对性的培养的研究来证实生物降解的程度的洗涤剂这些菌株。

当考虑影响K30的滞后阶段,我们观察一个微分浓度依赖性,时间滞后的阶段是消除在0.1 v / v K30 2 p08aa应变,在50 v / v K30 1.0% v1应变。我们的新陈代谢在洗涤剂烷基侧链(通过ω-oxidationβ-oxidation终点碳和后续周期的)可以作为活化剂对加速度的滞后阶段,和退化的芳香洗涤剂核心(通过苯代谢)可能维持50 v1应变在指数期,增长率没有抑制在0.1% v / v K30的存在。如果是这样,碳和能源收购洗涤剂可以作为一个额外的生物的生存战略。或者,K30洗涤剂可能驱散任何低丰度细胞聚集体在滞后阶段,从而产生更高的OD值和生物量明显增加。在这种假设下,观察到浓度依赖的菌株将暗示两株细胞聚集体具有不同的稳定性。

5。结论

总之,我们的联合培养和代谢组学结果放贷支持向假设重复清洗Kleenol 30表现为选择性压力对航天器微生物组的成员——表型结果可能包括栽培公差和可衡量的生化反应。恰当地说,我们的结果表明,Kleenol 30描述floor-associated更容易容忍答:johnsonii2 p08aa,飞船surface-associated相比答:radioresistens50 v1。然而,两株显示合理的公差对v / v Kleenol 30 1%,这是高于当前配方(v / v ~ 0.8 -1.6%)用于NASA行星保护实践。这些结果表明,spacecraft-associated不动杆菌可能港公差对地板清洗条件。

这样的公差可能降低微生物污染水平的重要考虑行星任务,如飞行器任务欧罗巴(行星保护三级),生命探测火星任务(行星保护类别IVb)司长委任或欧罗巴(第四行星保护类别),和调查火星特殊地区(行星保护类别印度河流域文明)。在这种背景下,我们的研究结果表明,较高的地板清洁水平可能达到更高浓度的Kleenol 30(如2 - 3% v / v)或与不同浓度的旋转Kleenol 30(例如,1和3% v / v)。另外,旋转不同的地板清洁剂可以帮助实现低地板微生物污染水平(例如,Kleenol 30和季铵化合物),但需要说明的是,洗涤剂和/或杀虫剂保持兼容空间飞行器装配程序和飞船的材料。

数据可用性声明

代谢组学数据(研究ID ST002380 DatatrackID: 3552)可通过代谢组学工作台(https://www.metabolomicsworkbench.org/)在美国国立卫生研究院共同基金的国家代谢组学数据存储库(NMDR),可以通过项目DOI:直接访问http://dx.doi.org/10.21228/M8XH73。

作者的贡献

RM, DM、SL和BR导致数据的分析,协助起草的报告,批准提交的手稿。RM分析了代谢组学数据,进行统计分析,准备手稿,是通讯作者。DM和BR进行生存分析,培养动力学。SL准备文化进行代谢组学分析。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是支持格兰特(NNH18ZDA001N)的行星保护研究组件国家航空和宇宙航行局(NASA)在太空与地球科学计划研究机会。

确认

我们承认后勤支持大学的科学,化学和生物化学部门,并在加州理工大学生物科学系的波莫纳。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

脚注

引用