描述和噬菌体的基因组分析vB_KpnS_SXFY507反对gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba和有效性评估gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫gydF4y2Ba
冯娇gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
范李gydF4y2Ba
2、3gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
李的太阳gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
莉娜董gydF4y2Ba
4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba丽婷高gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba汉旺gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba投入严gydF4y2Ba6gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
昌鑫吴gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
*gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba生物医学科学研究所的重点实验室,化学生物学与分子工程教育部中国医学分子细胞生物学重点实验室的山西,山西大学、太原,中国gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba临床中心实验室,青岛大学附属泰安市中心医院,中国泰安gydF4y2Ba
- 3gydF4y2Ba生命科学与技术学院,北京化工大学,北京,中国gydF4y2Ba
- 4gydF4y2Ba核心实验室,山西省人民医院(第五医院)山西医科大学、太原,中国gydF4y2Ba
- 5gydF4y2Ba医学影像中心、青岛大学附属泰安市中心医院,中国泰安gydF4y2Ba
- 6gydF4y2Ba医院办公室,青岛大学附属泰安市中心医院,中国泰安gydF4y2Ba
特拉gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba的主要致病菌之一,对全球公共卫生构成重大威胁,因为缺乏可用的治疗选项。噬菌体疗法显示承诺作为潜在的替代当前抗菌化疗。在这项研究中,我们孤立的一个新的gydF4y2BaSiphoviridaegydF4y2Ba噬菌体对KPC-producing vB_KpnS_SXFY507gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba从医院污水。它有一个短潜伏期20分钟和一个大爆炸246噬菌体/细胞的大小。噬菌体的宿主范围vB_KpnS_SXFY507相对广泛。它有一个广泛的pH值宽容和高的热稳定性。噬菌体的基因组vB_KpnS_SXFY507长度是53122个基点,G + C含量的49.1%。总共有81个开放阅读框(orf),没有毒性或抗生素耐药性相关基因参与了噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组。噬菌体vB_KpnS_SXFY507显示显著的抗菌活性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。的存活率gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫接种gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507是20%。的存活率gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba来华的gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫从20增加到60%在72 h噬菌体vB_KpnS_SXFY507治疗。总之,这些发现表明,噬菌体vB_KpnS_SXFY507有潜力成为作为抗菌剂的控制gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba是革兰氏阴性细菌属于gydF4y2Ba肠杆菌科gydF4y2Ba家庭。这是一个健康的微生物组的一部分个人和殖民在胃肠道,呼吸道、泌尿生殖系统、皮肤、鼻咽(gydF4y2Ba萨姆Bengoechea和Sa, 2019年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雷耶斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。然而,这种微生物攻击免疫功能不全的个人和引起的疾病,如肺炎、肝脓肿、尿道感染、伤口感染、脓毒症(gydF4y2BaPaczosa Mecsas, 2016gydF4y2Ba)。碳青霉烯被广泛用于治疗感染所致gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba,但随着抗生素的广泛使用,特拉gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba(CRKP)) (gydF4y2BaYigit et al ., 2001gydF4y2Ba)。目前,CRKP)全球传播,成为主要的致病菌,对全球公共卫生构成重大威胁,因为缺乏足够的治疗选项(gydF4y2Ba麦肯纳,2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
噬菌体是一种专门感染细菌的病毒与宿主特异性高,他们被发现在所有环境中细菌通常会茁壮成长。噬菌体疗法是一个世纪的方法被用于治疗细菌感染。MDR的发展和传播gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba噬菌体治疗显示,承诺作为潜在的替代当前抗菌化疗(gydF4y2BaHerridge et al ., 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba噬菌体可以孤立的从各种各样的来源,包括医疗污水、废水和人类肠道样本(gydF4y2BaHerridge et al ., 2020gydF4y2Ba)。然而,当前的噬菌体数据库仍然有限gydF4y2BaParmar et al ., 2017gydF4y2Ba)。隔离和调查新的噬菌体可以丰富噬菌体数据库并提供生物选择耐多药细菌引起的感染的治疗。gydF4y2Ba
的gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫模型已被广泛用于评估噬菌体治疗的疗效gydF4y2Ba蔡et al ., 2016gydF4y2Ba)。用噬菌体治疗KP1801显著降低的水平gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba在幼虫和改进的生存gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba(gydF4y2BaWintachai et al ., 2020gydF4y2Ba)。噬菌体BUCT541显著增加的存活率gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba来华的gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫(gydF4y2Ba聚氨酯et al ., 2022 bgydF4y2Ba)。类似的结果是获得的疗效评估的噬菌体BUCT610反对gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaK1119在gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫模型(gydF4y2Ba聚氨酯et al ., 2022 agydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们分离噬菌体vB_KpnS_SXFY507反对gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba从医院污水。噬菌体vB_KpnS_SXFY507的生理特点进行调查,进行基因组分析。噬菌体的功效vB_KpnS_SXFY507对应变SXFY507评估gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫模型。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
菌株和识别gydF4y2Ba
特拉gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507隔离病人在公立医院在太原城,中国。应变在Luria-Bertani孵化(磅)汤在37°C用颤抖的在200 rpm和存储在30%甘油−80°C (v / v)。gydF4y2Ba
菌种鉴定是由16 s rRNA基因测序(gydF4y2Ba弗兰克et al ., 2008gydF4y2Ba),通过PCR检测gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba特殊技能gydF4y2BakhegydF4y2Ba基因(gydF4y2BaYin-Ching et al ., 2002gydF4y2Ba)。修改后的CarbaNP测试用于确定“漫步者”类的活动/ B / D "在细菌细胞提取物(gydF4y2Ba冯et al ., 2017gydF4y2Ba)。主要plasmid-borne extended-spectrum beta-lactamase和"基因筛选通过PCR和Sanger测序。PCR引物用于PCR扩增子被描述在以前的报告(gydF4y2Ba陈et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
噬菌体分离和净化gydF4y2Ba
未经处理的污水样本收集从公立医院在太原,中国。噬菌体分离和净化进行了如前所述(gydF4y2Ba冯et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李f . et al ., 2022gydF4y2Ba)。污水样本离心机短暂,然后是浮在表面的无菌过滤0.22μm过滤器(微孔、PES膜)。接下来,过滤溶解产物是培养gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507 BHI肉汤和孵化37°C用颤抖的在160 rpm 5 h。离心后,上清液由无菌过滤0.22μm过滤器。十倍稀释系列(10gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba在SM)的过滤溶解产物制备缓冲,然后混合gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507其次是酝酿在室温下为5分钟。顶级琼脂的混合物加入5毫升与0.75%琼脂(BHI),然后倒上一盘(1.5%琼脂)和孵化隔夜37°C噬菌体形成斑块。对噬菌体净化,单个斑块是在SM然后resuspended缓冲区。双层琼脂法进行成形,筛选噬菌体斑块。噬菌体净化的实验重复三次获得纯化噬菌体。纯化噬菌体制剂被储存在4°C进行进一步的研究。gydF4y2Ba
透射电子显微镜法gydF4y2Ba
纯化噬菌体(4.3×10gydF4y2Ba16gydF4y2Ba空斑形成单位/毫升)被发现在碳涂层铜网格,然后用2%的磷钨酸负染色为5分钟。噬菌体的形态学vB_KpnS_SXFY507由透射电子显微镜检查(JEOL jem - 1200 ex,日本)的加速电压80 kV。gydF4y2Ba
最佳感染复数的决心gydF4y2Ba
感染复数(MOI)测定进行了如前所述(gydF4y2Ba李f . et al ., 2022gydF4y2Ba)。噬菌体vB_KpnS_SXFY507孵化的指数期文化gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507在不同比例(10、1、0.1、0.01和0.001)其次是孵化在37°C 160 rpm 5 h。混合物是离心去除细菌细胞,上层由0.22μm过滤器过滤。噬菌体的效价是由双层琼脂法。生成的噬菌体效价最高的比例被认为是最佳的莫伊。gydF4y2Ba
一步生长曲线gydF4y2Ba
一步生长曲线确定测量潜伏期和噬菌体的释放量(gydF4y2Ba李f . et al ., 2022gydF4y2Ba)。噬菌体vB_KpnS_SXFY507孵化了gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507莫伊的0.001。5分钟后吸附在室温下,混合物在5000×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为10分钟去除上层清液中未被吸收的噬菌体。离心机降水resuspended在BHI肉汤孵化在37°C 160 rpm紧随其后。采集标本120分钟内每隔10分钟,然后离心样品得到上层清液。上层清液0.22μm过滤器过滤,然后由双层琼脂法滴定。实验重复三次。gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507的稳定性评估gydF4y2Ba
调查不同的保暖内衣裤和pH值的影响活动的噬菌体vB_KpnS_SXFY507,噬菌体是处理不同的温度和pH值。短暂,噬菌体vB_KpnS_SXFY507孵化在不同的温度下(40、50、60、70和80°C)和pH值为60分钟(2.0 - -12.0),分别。然后对噬菌体的滴度测定gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba双层琼脂法。gydF4y2Ba
宿主范围分析gydF4y2Ba
噬菌体的宿主范围vB_KpnS_SXFY507被当场测试确定使用27gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba临床株菌株(25,写明ATCC baa - 2146,写明ATCC baa - 1705;gydF4y2Ba李f . et al ., 2022gydF4y2Ba)。简而言之,100年每个应变μl指数期的文化混合5毫升的琼脂与0.75%琼脂(BHI),然后倒到盘子里含有固体培养基形成双层板。板是在室温下孵化几分钟。随后,10μl噬菌体vB_KpnS_SXFY507 (10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba空斑形成单位/”)被发现在双层板,然后静止板在室温下直到噬菌体悬挂吸收。一夜之间,盘子被孵化的37°C允许斑块的形成。gydF4y2Ba
噬菌体基因组DNA提取、测序和基因分析gydF4y2Ba
噬菌体的基因组DNA提取vB_KpnS_SXFY507使用蛋白酶K / SDS方法如前所述(gydF4y2Ba李f . et al ., 2022gydF4y2Ba)。NEBNext超II FS DNA库准备工具包(内)Illumina公司用于图书馆准备。噬菌体的基因组测序vB_KpnS_SXFY507执行使用Illumina公司Novaseq编曲。Trimmomatic V0.36程序被用于移除适配器地区和低质量的读取,在使用黑桃v3.13.0噬菌体vB_KpnS_SXFY507组装完整的基因组序列。gydF4y2Ba
个开放阅读框(orf)预测使用拉斯特(快速注释使用子系统技术)2.0 (gydF4y2BaOverbeek et al ., 2014gydF4y2Ba)结合BLASTP / BLASTN搜索对UniProtKB / Swiss-Prot(2022年7月8日访问;gydF4y2Ba财团,2021gydF4y2Ba)和RefSeq (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/gydF4y2Ba,2022年7月8日)访问数据库。假定的转移核糖核酸编码基因搜索使用tRNA scan-SE (gydF4y2Ba劳和陈,2016gydF4y2Ba)。预测的毒性基因对毒力因子数据库搜索(VFDB;gydF4y2Ba刘et al ., 2022gydF4y2Ba),并分析了抗生素耐药性抗生素耐药性的综合数据库(只螃蟹;gydF4y2Ba阿尔科克et al ., 2020gydF4y2Ba)和ResFinder数据库(gydF4y2BaZankari et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaBortolaia et al ., 2020gydF4y2Ba)。多个使用肌肉3.8.31和成对序列进行比较(gydF4y2Ba埃德加,2004gydF4y2Ba分别)和BLASTN。1.1基因组织图被画之。gydF4y2Ba
系统发育分析gydF4y2Ba
terminase大亚基的氨基酸序列(TerL)的指示性噬菌体对齐使用肌肉3.8.31 (gydF4y2Ba埃德加,2004gydF4y2Ba)。拔起neighbor-joining树木产生的一致使用MEGA7 TerL序列(gydF4y2BaKumar et al ., 2016gydF4y2Ba使用neighbor-joining),进化距离估计方法开机迭代1000。gydF4y2Ba
评估vB_KpnS_SXFY507的功效gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2BaSXFY507gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507混合指数期(ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba= 0.6)gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507莫伊的1和0.001,分别。混合物在37°C 160 rpm孵化5 h。的ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba和细菌菌落的混合物被检测到每1 h在5 h。实验重复三次。gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507的治疗效果gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫gydF4y2Ba
广场mellonellagydF4y2Ba幼虫模型是用来评估的潜力gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba噬菌体的效果对gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba(gydF4y2Ba三十et al ., 2019gydF4y2Ba)。共有210个幼虫权重选择250 - 350毫克和10分为七组幼虫技术一式三份。10μlgydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507 (1×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU /毫升)注入的最后对腹足幼虫微量试样注射器,感染后的一个小时,10μl噬菌体vB_KpnS_SXFY507注入是最后一个离开的幼虫腹足治疗莫伊100年10,1,0.001。其他三组注射PBS(10μl /每个),噬菌体vB_KpnS_SXFY507(10μl /每个,1×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba空斑形成单位/毫升),gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507(10μl /每1×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba右边的CFU /毫升)幼虫的最后腹足,分别。幸存的数量gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫被观察和记录每8 h 72 h。使用kaplan meier生存曲线的绘制方法,和存活率差异组使用生存率较计算。用SPSS统计软件进行统计分析(版本27.0)。gydF4y2Ba
加入核苷酸序列号码gydF4y2Ba
的完整序列gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba噬菌体基因组vB_KpnS_SXFY507提交下基因库加入ON045001数量。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
分子的特点gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2BaSXFY507gydF4y2Ba
应变SXFY507存在gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba特殊技能gydF4y2BakhegydF4y2Ba基因和演示类"的活动。"的PCR筛选试验和extended-spectrum beta-lactamases基因检测gydF4y2BablagydF4y2BaKPCgydF4y2Ba,gydF4y2BablagydF4y2BaCTX-M-9GgydF4y2Ba,gydF4y2BablagydF4y2BaSHVgydF4y2Ba(但没有其他的gydF4y2BablagydF4y2Ba基因测试)gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507。gydF4y2Ba
噬菌体分离和形态gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507成功使用临床孤立隔绝医院污水gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507指标细菌。噬菌体vB_KpnS_SXFY507大,形成明显的斑块在双层板(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。透射电子显微镜显示,噬菌体vB_KpnS_SXFY507表现出对称的头和一个长,non-contractile尾巴(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。头vB_KpnS_SXFY507直径大约是55.6 nm,和尾巴长度约174.7海里。基于分类的建议国际病毒分类委员会(ICTV),噬菌体vB_KpnS_SXFY507被认为属于gydF4y2BaSiphoviridaegydF4y2Ba家庭。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。噬菌体vB_KpnS_SXFY507斑块形态。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba噬菌体斑块形成的噬菌体vB_KpnS_SXFY507在草坪上gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2BaSXFY507。gydF4y2Ba(B, C)gydF4y2Ba透射电子显微镜的噬菌体vB_KpnS_SXFY507。gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507的生理特征gydF4y2Ba
噬菌体的效价vB_KpnS_SXFY507莫伊时达到最大值0.001,表明0.001是最优增长vB_KpnS_SXFY507莫伊(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。噬菌体的生长参数vB_KpnS_SXFY507由一步生长曲线实验决定。噬菌体vB_KpnS_SXFY507的潜伏期大约20分钟,和上升阶段约为80分钟。噬菌体的平均破裂规模约为246噬菌体/细胞(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。热稳定性测试表明,效价的噬菌体vB_KpnS_SXFY507慢慢拒绝从40到70°C,而几乎没有噬菌体幸存下来当温度达到80°C (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。噬菌体vB_KpnS_SXFY507从pH4.0 pH11.0有很好的溶解性活动。当pH值< 4.0或pH > 11.0,噬菌体的效价显著减少,和噬菌体完全灭活当pH = 2.0或pH = 12.0 (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。总共27株gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba收集的噬菌体vB_KpnS_SXFY507宿主范围分析。噬菌体可以溶解23 27株,表明噬菌体的细胞溶解范围比较宽(gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
表1gydF4y2Ba。最优莫伊噬菌体vB_KpnS_SXFY507化验。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。噬菌体vB_KpnS_SXFY507的生理特征。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba噬菌体vB_KpnS_SXFY507一步生长曲线;gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba噬菌体vB_KpnS_SXFY507的热稳定性;和gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba噬菌体vB_KpnS_SXFY507的pH值稳定。所有分析都是一式三份。gydF4y2Ba
一般的噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组的基因特征gydF4y2Ba
基因组测序显示噬菌体的基因组vB_KpnS_SXFY507 53, 122 - bp圆形双链DNA分子平均G + C含量的49.1%。根据拉斯特和BLASTp分析结果,共有81个orf预测在噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组。基于开放的功能,这些羊痘疮噬菌体的基因组vB_KpnS_SXFY507被分为五组:噬菌体复制和监管(9个ORF),形态发生(16个ORF),溶解(两个ORF), dna折叠蛋白质(两个ORF),而且,假设蛋白(52个ORF;gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba)。此外,没有tRNA、毒性或抗菌素耐药性基因被发现在噬菌体的基因组vB_KpnS_SXFY507。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。原理图的地图噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组。基因是用箭头和彩色根据功能分类(蓝色:形态发生;绿色:复制和监管;橙色:DNA包装蛋白质;红色:溶解;和黑色:假想的蛋白质)。最里面的圆礼物GC-skew [(G−C) / (G + C)], 500个基点的窗口大小和步长20个基点。next-to-innermost圆了GC的内容。gydF4y2Ba
比较基因组分析gydF4y2Ba
BLASTN噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组的分析与NCBI数据库显示,vB_KpnS_SXFY507共享同源性最高的(覆盖率:93%,身份:96.9%)gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba加入噬菌体KL3(基因库OK019720数量),紧随其后的是gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba噬菌体KMI8(加入基因库MN101222)共享93%的覆盖率和86.2%的身份。平均核苷酸之间身份(ANI)值噬菌体vB_KpnS_SXFY507噬菌体KL3,噬菌体KMI8分别是86.33%和96。结果表明,噬菌体vB_KpnS_SXFY507和噬菌体KL3但不是KMI8属于同一个组(gydF4y2Ba戈里et al ., 2007gydF4y2Ba)。进一步的比较基因组分析表明,这三种噬菌体显示两个主要模块差异:(i) ORF编码噬菌体尾巴纤维蛋白不同;(2)一些假想的蛋白质是独特的在这些噬菌体(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。噬菌体的基因组的线性比较vB_KpnS_SXFY507, KL3(加入基因库OK019720),和KMI8(加入基因库MN101222数量)。基因是用箭头。基于功能基因的分类(蓝色:形态发生;绿色:复制和监管;橙色:DNA包装蛋白质;红色:溶解;和黑色:假想的蛋白质)。阴影表示区域的同源性(红色:> 90%核苷酸身份;蓝色:> 85%核苷酸的身份)。gydF4y2Ba
系统发育树构建基于TerL噬菌体vB_KpnS_SXFY507和26 TerL序列的氨基酸序列与其他噬菌体。结果表明,噬菌体的TerL vB_KpnS_SXFY507 TerL密切相关的gydF4y2Ba克雷伯氏菌gydF4y2Ba噬菌体KL3 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。系统发育树构建基于噬菌体vB_KpnS_SXFY507 terminase大亚基。的氨基酸序列相关的噬菌体从NCBI下载。gydF4y2Ba
评估疗效的噬菌体对SXFY507 vB_KpnS_SXFY507gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507 SXFY507能有效地抑制增长的压力gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。从0到2 h, ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba和细菌菌落的混合物被大幅降低并保持在一个非常低的水平在2 - 5 h比积极的控制(gydF4y2Ba数字6gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫模型被用来评估噬菌体对SXFY507 vB_KpnS_SXFY507的功效gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。我们首先确定最优培养液浓度对菌株SXFY507感染10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba10 CFU /μl,这可能导致72年的死亡率为80%。在对照组,20%的幼虫接种菌株SXFY507幸存了下来。幼虫的存活率是60岁,50岁,40岁,30%用噬菌体治疗时我100年10日1和0.001,分别。生存率较表明保护gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫通过噬菌体莫伊100年重大(价值gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。群幼虫接种噬菌体和PBS对照组都幸存了下来(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba。评估疗效的噬菌体对SXFY507 vB_KpnS_SXFY507gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaOD600的变化在不同浓度的噬菌体vB_KpnS_SXFY507 SXFY507培养。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化的细菌菌落时,不同浓度的噬菌体vB_KpnS_SXFY507被SXFY507培养。gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba。kaplan meier的生存曲线gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫与噬菌体治疗后vB_KpnS_SXFY507在不同月或PBS。生存率较被用来确定意义,gydF4y2Ba* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001,gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba。形态学的gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba用噬菌体vB_KpnS_SXFY507治疗后。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
特拉gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba是一种重要的耐多药细菌病原体构成严重威胁全球公共卫生(gydF4y2Ba李et al ., 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2BaSXFY507类"活动,存在gydF4y2BablagydF4y2BaKPCgydF4y2Ba,gydF4y2BablagydF4y2BaCTX-M-9GgydF4y2Ba,gydF4y2BablagydF4y2BaSHVgydF4y2Ba。在中国,gydF4y2BablagydF4y2BaKPCgydF4y2Ba是最常见的" carbapenemase-producing耐药基因gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba隔离(gydF4y2Ba李c . et al ., 2022gydF4y2Ba)。有必要找到替代策略治疗KPC-producing引起的感染gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba。因此,它是有意义的gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507作为东道主细菌分离噬菌体的功效,从而评估对SXFY507孤立的噬菌体gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
噬菌体是高度寄主专一性的,安全的,无处不在的环境(gydF4y2Ba敏锐的,2015gydF4y2Ba),所以它被认为是一个潜在的治疗方法对高度耐药病原体,包括特拉gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba压力(gydF4y2BaCorbellino et al ., 2020gydF4y2Ba)。在这里,我们已经分离出一种溶解性噬菌体vB_KpnS_SXFY507从医院污水细菌使用应变SXFY507作为指标。结果表明,医疗污水可能是一个更好的资源隔离噬菌体对临床特拉gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba菌株。一个噬菌体用于噬菌体疗法,最好应该有一个相对广泛的宿主范围(gydF4y2Ba海曼,2019gydF4y2Ba)。噬菌体vB_KpnS_SXFY507可以溶解23 27gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba菌株,表明vB_KpnS_SXFY507的细胞溶解范围相对广泛。gydF4y2Ba
噬菌体的生理特征是必要的工作。噬菌体vB_KpnS_SXFY507 20分钟的短潜伏期和一个大爆炸246微升/细胞的大小。莫伊是0.001时,效价的噬菌体vB_KpnS_SXFY507达到最大值。不同的pH值或温度条件可能影响噬菌体的活动,这是为了是生物防治剂(gydF4y2BaJończyk-Matysiak et al ., 2019gydF4y2Ba)。噬菌体vB_KpnS_SXFY507 pH值有一个广泛的宽容和良好的热稳定性。这些特征使噬菌体vB_KpnS_SXFY507有潜力用作抗微生物剂(gydF4y2BaJończyk-Matysiak et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
噬菌体基因组vB_KpnS_SXFY507长度是53122个基点,与G + C含量为49.1%。共有81个orf参与了噬菌体vB_KpnS_SXFY507基因组。其中,29个orf编码的蛋白质与噬菌体复制和监管,形态发生、细胞溶解,DNA包装。有九个orf编码的蛋白质与噬菌体复制和监管。ORF26、ORF28 ORF29, ORF31预测单链DNA结合蛋白质(单边带)、核酸外切酶、DNA引物酶,分别和DNA解旋酶。SSBs高亲和力结合单链DNA和DNA核酸外切酶是一种多功能的水解酶,在DNA复制过程中发挥作用,DNA错配修复,DNA双链断裂修复(gydF4y2BaKeijzers et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba萨拉斯et al ., 2016gydF4y2Ba)。DNA代表催化的合成短RNA分子用作DNA聚合酶,引物和与复制DNA解旋酶(gydF4y2Ba弗里克和理查德森,2001年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
噬菌体vB_KpnS_SXFY507有16个orf编码蛋白质,可能从事噬菌体形态发生。ORF3门户编码蛋白质,作为DNA传感器,便于包装和发布的基因组(gydF4y2Ba身为et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaLokareddy et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaDedeo et al ., 2019gydF4y2Ba)。同时,蛋白质由ORF4编码、ORF5 ORF13, ORF16,和ORF25头部形态发生蛋白,主要衣壳蛋白,尾管蛋白质,尾长皮尺蛋白质,分别和尾巴纤维蛋白。gydF4y2Ba
ORF42 ORF43编码holin和细胞溶解酶参与细胞溶解的模块。dna折叠蛋白的噬菌体vB_KpnS_SXFY507被ORF1 terminase小亚基(发疯)编码和terminase大亚基(TerL)由ORF2编码。当参数识别concatemeric病毒DNA,一步包装DNA噬菌体成原壳体是发起。然后,TerL组装到发疯:DNA复杂。TerL具有atp酶和核酸酶的活动,因此TerL可以减少DNA和包在一个ATP-dependent过程(gydF4y2Ba阿拉姆和饶,2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaRao Feiss, 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
剩下的52个orf编码假设蛋白,进一步的研究是必须的。此外,任何抗生素耐药性和毒力相关基因被发现在噬菌体的基因组vB_KpnS_SXFY507,表明噬菌体vB_KpnS_SXFY507理论上可能安全的控制gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba。比较基因组分析和系统发育树显示,噬菌体vB_KpnS_SXFY507 KL3进化关系密切,和两个噬菌体属于一个新组。gydF4y2Ba
在体外gydF4y2Ba噬菌体vB_KpnS_SXFY507显示显著的抗菌活性的莫伊1和0.001,这表明它可以作为生物防除代理控制的传播gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba是一个灵活和快速的工具来评估噬菌体效果(gydF4y2Ba三十et al ., 2019gydF4y2Ba)。因此,我们使用gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫模型对SXFY507评估噬菌体vB_KpnS_SXFY507的功效gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。在gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba模型的幼虫,幼虫的存活率接种gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507是20%。基于gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验中,噬菌体在莫伊1和0.001的选择对SXFY507评估噬菌体vB_KpnS_SXFY507的功效gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。幼虫的存活率是40 - 30%用噬菌体治疗时通过1和0.001,分别。接下来,高剂量(MOI = 10和100年)的噬菌体vB_KpnS_SXFY507被用于治疗实验。的存活率增加到50 - 60%用噬菌体治疗vB_KpnS_SXFY507莫伊的10 - 100。与之前的研究结果是一致的,高剂量的噬菌体导致更高的存活率gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫(gydF4y2BaWintachai et al ., 2020gydF4y2Ba),但不同于vB_KpnS_SXFY507的功效gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。我们推测,可能是由于免疫系统的幼虫。噬菌体的存活率和PBS对照组100%,噬菌体在这个模型的安全性。这些数据表明,噬菌体vB_KpnS_SXFY507可以有效地治疗gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2BaSXFY507感染。gydF4y2Ba
总之,溶解性噬菌体,名叫vB_KpnS_SXFY507,反对gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba是孤立和特征。生理特征、生物信息学分析结果gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba实验结果表明,幼虫噬菌体vB_KpnS_SXFY507可用于噬菌体治疗和控制是一个有前途的工具gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以发现:gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba,ON045001。gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
书面知情同意了个人(s)的出版的任何潜在的可识别的图像或数据包含在本文中。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
摩根富林明、LY和连续波研究构想。摩根富林明,FL、LS、LD、LG、和HW和计算进行了实验分析。摩根富林明,FL、LY和连续波写了这篇文章。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作得到了国家自然科学基金(82002207)和项目的研究生创新研究山西省价差(2021)。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1081715/full补充材料gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba噬菌体vB_KpnS_SXFY507,gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba基因组分析,特拉gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba董冯J,李F,太阳L, L, L,王H,燕吴L和C(2023)表征和噬菌体的基因组分析vB_KpnS_SXFY507反对gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba和有效性评估gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba幼虫。gydF4y2Ba前面。MicrobiolgydF4y2Ba。14:1081715。doi: 10.3389 / fmicb.2023.1081715gydF4y2Ba
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拉梅什k·高尔gydF4y2Ba美国犹他大学的gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2023峰、李、太阳、东高,Wang Yan,吴。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba冯娇,✉gydF4y2Bafengjiao - 1219 @163.comgydF4y2Ba;昌鑫吴✉gydF4y2Bacxw20@sxu.edu.cngydF4y2Ba;投入,✉gydF4y2Ba18653819997 @163.comgydF4y2Ba
__gydF4y2Ba这些作者贡献了同样的工作gydF4y2Ba