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前面。Microbiol。,01 February 2023
秒。Microbiotechnology
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1043967

便携式纳米孔测序技术:开发和应用的趋势

销陈 ¹ ^__,

Zepeng太阳 ² ^__,

加威王 ³ ^__,

鑫隆刘 ²,

Yun呗¹,

江城 ¹,

安娜刘¹,

冯巧 ²,

杨陈¹,

Chenyan元 ⁴,

Jingjie沙 ⁵,

张历程 ³,

李群徐² ^*和

剑李 ¹ ^*

¹重点实验室DGHD、MOE、生命科学与技术学院的,东南大学,南京,中国
²中国移动(成都)工业研究所、中国成都
³计算机科学与技术学院的,东南大学,南京,中国
⁴临床实验室,东南大学中大医院,南京,中国
⁵机械工程学院,东南大学,南京,中国

测序技术是最常用的分子生物学技术研究和发展的重要支柱和分子生物学的应用程序。自1977年第一代测序技术解释遗传密码打开门,测序技术已经发展了三代。应用在生活的各个方面,科学研究、疾病诊断等药物目标发现、病理研究、物种保护、和SARS-CoV-2检测。然而,第一和第二代测序技术依赖于荧光检测系统和DNA聚合酶系统,增加了测序技术的成本和其应用范围有限。第三代测序技术执行PCR-free和单分子测序,但它仍然依赖于荧光检测装置。突破这些限制,研究者们做出了艰苦努力开发一个新的先进的便携式测序技术由纳米孔测序。纳米孔技术具有体积小和方便的可移植性,独立的生化试剂,使用物理方法和直接阅读。综述纳米孔测序技术的研究和开发过程(望远镜)从实验室到商业上可行的工具;探讨了纳米孔测序技术的主要类型及其各种应用程序在解决各种实际问题的能力。此外,本文整理必要的分析工具来执行不同的纳米孔测序的处理任务。 Finally, we highlight the challenges of NST and its future research and application directions.

1。介绍

在(1953年),沃森和克里克创造性地提出了DNA的双螺旋结构,讨论了沃森和克里克(1953),导致DNA复制的概念框架和核酸编码蛋白质。这个开创性工作迎来了从描述性生物学计算分子生物学的时代(希瑟和链,2016),测序技术是最常用的分子生物学技术研究和分子生物学发展的一个重要支柱。

在科学研究中,测序技术发挥了重要作用,基因组学、宏基因组,DNA蛋白质相互作用,DNA甲基化研究(Pareek et al ., 2011)。测序技术还广泛应用在人类生活的各个方面。它在疾病预测中扮演不可替代的重要作用,病理研究,药物研发,器官移植匹配,产前测试,肿瘤分子诊断、靶向治疗,COVID-19检测等等。因为测序技术的出现,核苷酸检测技术有了长足的进步。1977年,第一代测序技术由Maxam-Gilbert方法(刘et al ., 2013)和链终止法(Garaj et al ., 2010)应运而生,它为科学家解释生命的遗传密码。读了这一技术在长度700 - 900个基点,准确率可以达到99.999% (Menestrina et al ., 2014)。第一代测序技术,运行时间短,精度高,适用于小型科研吞吐量需求较低,但每个反应只能获得一个读取长度,不适合大规模高通量测序。2005年,第二代测序方法由综合排序(SBS) (之一,吉尔伯特,1977通过结扎)和测序(SBL) (桑格et al ., 1977)开始进入测序市场。典型的读取长度大约是50 - 500个基点,吞吐量是数千倍的第一代。结果,一个测序的成本削减,为大规模测序(打开门苏亚雷斯,2017)。2008年,第三代测序技术,具有单分子测序读长,出现和科学界引起了强烈的关注。第三代测序技术sequencing-by-synthesis方法适用于一系列单个DNA分子,避免一系列的错误造成的PCR扩增。第三代测序读长可以达到2 Mb,高数据吞吐量和低成本的使用(凡戴克et al ., 2018),这使研究人员调查与复杂的结构基因组区域,重复序列与高或低GC含量,以及经过小基因组等病毒基因组没有组装。

此外,由于信号的变化引起的核苷酸甲基化和其他修改后是不同的,第三代测序可以检测基因的甲基化修饰通过检测电信号的变化(彼得森et al ., 2019),它扩展了测序技术的应用范围。然而,因为它不参与自由荧光背景干扰的因素在实际化学反应,第三代测序的准确性显著低于第一和第二代(斯凯特et al ., 2010)。所有的一代又一代的测序技术讨论了在使用荧光color-developing物质检测DNA序列。DNA聚合酶组装过程中不同的核苷酸的DNA链,不同的检测到光信号从而产生间接确定DNA链的碱基组成。这些方法所需的荧光检测系统和DNA合成所需的酶增加DNA测序的成本(Ambardar et al ., 2016)。因此,新一代测序技术的发展有望物理尺寸小,不依靠生化试剂,通过物理方法直接可读。望远镜是其中杰出的代表。图1总结了关键时间点跨代测序技术的发展。根据MarketsandMarkets战略见解(下一代测序市场,2021年),下一代测序市场快速增长;2021年,市场规模是103亿美元,到2026年,下一代测序市场有望达到242亿美元,以18.7%的复合年增长率(CAGR)多年来(下一代测序市场,2021年)。

图1

图1。测序技术发展的时间轴。

2。生物纳米孔测序的历史

在专利由教堂和迪默等人,1998年,他们提议使用纳米孔传感器序列DNA (教堂et al ., 1998 a)。以前,在1994年,沃克等人发现α-hemolysin是一个很好的金属离子传感器材料(沃克et al ., 1994)。因此,α-hemolysin是包括作为纳米孔测序的候选材料。Bezrukov和Kaasianowicz等人在应用α-hemolysin积累了丰富的经验。他们已经掌握了纳米孔测序所需条件,以避免自发控制(孔隙闭合)α-hemolysin通道(Bezrukov Kasianowicz, 1993)。足够的技术和理论准备之后,他们开始进行初始纳米孔测序实验,结果表明,单一的RNA分子可以通过α-hemolysin通道(埃克森et al ., 1999)。1994年,x射线衍射晶体结构实验α-hemolysin进一步揭示了结构,和α-hemolysin毛孔的直径约2海里。因此,科学家们推断,DNA,可以通过一个孔径大小(ssDNA)而不是单链DNA双链DNA (dsDNA) (歌et al ., 1996)。然后,哈佛大学的研究人员测试的混合dsDNA ssDNA和量化反应通过孔定量PCR技术,这的确是ssDNA而不是dsDNA (王et al ., 2021)。

而且,研究发现一个令人兴奋的结果,离子电流阻塞与转移ssDNA分子的数量是一致的,这表明使用α-hemolysin纳米孔测序是很有可能的。1996年,研究人员发表第一个纳米孔测序研究的结果(Kasianowicz et al ., 1996),提供一个最初的原始想法的验证。与此同时,其他报纸也调查如果纳米孔技术能够检测低分子量化合物,如DNA (康奈尔et al ., 1997)。

下一个不可避免的问题,α-hemolysin纳米孔测序是识别嘌呤嘧啶基地基地。1997年,实验表明,α-hemolysin纳米孔可以提供低聚物的结构或成分的信息(埃克森et al ., 1999)。进一步的实验表明,纳米孔的信号反应可能区分几个ssDNA分布长度相同的不同仅在于寡聚化序列和有相当大的敏感性(情节剧电影et al ., 2000)。后来实验还证实,孔隙信号可以区分如果多核苷酸链穿过纳米孔从5′,3′或3′,5′(王et al ., 2004;装置建立et al ., 2005)。最后,在2005年,Ashkenasy等人发现,单链DNA内可以形成一种α-hemolysin pseudorotaxaneα-hemolysin蛋白质和DNA,在这个过程中,认识到腺嘌呤通过改变α-hemolysin离子电流核苷酸(Ashkenasy et al ., 2005)。这个实验进一步表明,α-hemolysin足够有识别力的所有四个DNA核苷酸碱基,不管他们是否位于homopolymeric DNA链(斯托达特et al ., 2009)。这些实验取得了积极的成果,但仍有其局限性。DNA单链在实验中都稳定固定在nanoporin附近,它仍然是可疑的自由单链DNA的检测是否有足够的灵敏度。

早期的实验结果表明,一个DNA链通过纳米孔的速度1 - 10每毫秒基地,这是太快速检测信号(埃克森et al ., 1999)。出于这个原因,科学家希望通过控制速度,提高阅读的准确性,ssDNA分子通过纳米孔,而在三个方面采取措施:

1。控制酶的催化效率。在1998年,它提出了优化纳米孔的DNA易位率通过控制酶的催化效率(教堂et al ., 1998 b)和尝试了各种聚合酶(Gyarfas et al ., 2009);最终,phi29 DNA聚合酶(DNAP)被选中由于其优秀的连续合成DNA基质(能力和高度的亲和力利伯曼et al ., 2010);

2。修改蛋白纳米孔测序的需要。原α-hemolysin不是最合适的蛋白质孔隙对象(Sugawara et al ., 2015),许多人一直在努力改善蛋白纳米孔的结构性质。α-hemolysin的纳米孔测序站点的长度是大约5纳米(纳米)。研究表明,聚合物与时间比纳米孔孔径可以维护统一的易位率,而聚合物的易位率与短于纳米孔孔径通过纳米孔长度增加而降低(情节剧电影et al ., 2001)。因此,一个短洞可能提供更好的基础歧视(Ayub et al ., 2015)。发现分枝杆菌smegmatis孔蛋白(MspA)也有类似的特征α-hemolysin机制,后来被证明有较小的孔隙宽度和更稳定的孔隙率,使它理想的纳米孔测序材料(斯塔尔et al ., 2001)。进一步的研究还发现,MspA能结合金属离子稳定蛋白质结构比α-hemolysin和是一个优秀的工程模板检测极其微小的分析物(王et al ., 2019)。此外,MspA纳米孔可以区分所有四个碱基和实现一个碱基之间的离子电流差异明显多于α-hemolysin (Laszlo et al ., 2016)。进一步研究开发了新的见解让各种MspA突变体能够迅速而廉价地生产MspA蛋白纳米孔,和性能的纳米孔由这种方法并不不同于纳米孔由其他方法(燕s . et al ., 2021);

3所示。改变测序的物理和化学性质的解决方案。离子电导的DNA通过α-hemolysin和多核苷酸链进入纳米孔通道速率的增加粘度降低测序解决方案(【et al ., 2009)。因此,DNA链的速度穿过α-hemolysin可以控制通过调整粘度的测序的解决方案。同时,研究还发现,降低测序溶液的温度还可以减少DNA链的速度通过毛孔易位,可以与各种方法结合使用,从而提高测序信号读取的准确性(烹调的菜肴et al ., 2012)。合理的监测方法实现精确的DNA链易位控制是不可或缺的。微阵列系统已经发展到同时监视多个离子通量α-hemolysin纳米孔在高通量测序(Osaki et al ., 2009)。

3所示。纳米孔测序技术从实验室到实际应用

贝利加入了他的母校牛津大学化学工程教授在2003年,他成立了一个公司后来被称为牛津纳米孔技术组织(永久)在2005年和一位经验丰富的开发团队将望远镜商业化。位于安大略省2008年核心纳米孔测序获得的专利和随后发布的第一个商业测序设备使用纳米孔技术。图2总结了发展中望远镜的关键时间点。

图2

图2。纳米孔测序技术的发展的里程碑(望远镜)。

4所示。固态纳米孔测序的历史

2001年,科学家发明了一种固态纳米孔制造控制方法称为“离子束雕刻”和使用“离子束雕刻”的方法来制造纳米孔硅做的₃N₄,从而记录单个DNA分子(李et al ., 2001)。这个方法打开使用固态纳米孔技术DNA测序的前奏。加工技术的发展,固态纳米孔技术吸引了越来越多的关注。固态纳米孔与生物的相比有一些优势:

1。固态纳米孔有更好的化学和热稳定性,耐用性高,很难被变性;他们能保持正常运行在极端环境中(文卡特斯et al ., 2009);

2。当前生物纳米孔的孔隙大小约1 ~ 2海里,而固态纳米孔的孔隙大小一般在3 ~ 1000纳米之间。相对较大的纳米孔的大小使固态纳米孔检测DNA和蛋白质组学研究和病原体检查在同一时间(Tsutsui et al ., 2019);

3所示。固态纳米孔在降低制造难度和成本有优势,它可以根据用户的需求进行修改(罗马et al ., 2018)。有研究投资努力降低成本,以确保性能的固态纳米孔,并取得了较好的效果。几种主要材料准备固态纳米孔如下:氮化硅(Si₃N₄)、二氧化硅(SiO₂)、铝(Al₂O₃),氮化硼纳米孔(BN),石墨烯聚合物电影,和混合材料(冯et al ., 2015)。近年来,固态纳米孔技术逐渐提高。例如,人们已经发现,如果₃N₄固态纳米孔可以提供最高的信噪比(信噪比)。与MspA相比,固态纳米孔可以提高信噪比,> 160倍(Fragasso et al ., 2020),这可能表明望远镜的未来发展方向。内在的生成背景荧光在固态纳米孔的制备,从而影响信号读出准确性。背景荧光是不可避免的,但如何减少其影响是一个研究热点。一些研究表明,氮化硅薄膜的背景荧光可以减少使用氦聚焦离子束,阅读可以提高信号的信噪比(Sawafta et al ., 2014);研究也一直在进行改进的性质纳米孔溶液中由于蛋白质通过纳米孔太快速准确地检测到。一些研究人员发现,他们可以减缓蛋白质纳米粒子和增加他们的将水凝胶纳米孔内的停留时间,从而提高信号的分辨率。介质中的停留时间增加了检测率(Acharya et al ., 2020)。目前,一方面,大部分的研究集中在改善性能的固态纳米孔。另一方面,越来越多的研究旨在扩大应用范围的固态望远镜等领域检测DNA单分子(Goto et al ., 2020),调查脂质体的机械性能(李et al ., 2018),分析大分子肽生物标记(洲et al ., 2020)和蛋白质构象和互动(崔et al ., 2018),探索四面体DNA纳米结构(TDN) (赵et al ., 2019)等。

5。类型的纳米孔测序

纳米孔测序技术可以分为生物纳米孔和固态纳米孔。

5.1。生物纳米孔

5.1.1。α-Hemolysin

α-Hemolysin(α-HL)是第一个bio-nanopore应用在实践中,也是望远镜的早期发展的绝对支柱。α-Hemolysin(α-HL),由金黄色葡萄球菌分泌33.2 kD水溶性单体,可以自组装形成232.4 kD聚体跨膜通道,并形成一个帽直径在3.6和2.6 nm直径跨膜b-barrel构成蛋白质纳米孔通道(歌et al ., 1996)。纳米孔的尺寸是10×10 nm,和最窄的部分是1.4海里。通道是非常接近的内径ssDNA分子的大小(直径1.3 nm)。因此,α-HL纳米孔可以容纳ssDNA、区分单个核苷酸通过改变离子电流在纳米孔(Cherf et al ., 2012)。因此,α-HL已成为一个非常有前途的材料在纳米孔测序。此外,α-HL纳米多孔结构可以在12的pH值功能稳定温度接近100°C (康et al ., 2005)。这些因素最终确定α-HL成为第一个材料纳米孔测序设备的商业应用。

5.1.2中。MspA

分枝杆菌smegmatis孔蛋白(MspA)是一种性能优良的蛋白质纳米孔和广阔的应用前景•布兰顿et al ., 2008)。也是当前牛津纳米孔技术的主要应用材料(永久)测序设备。α-HL MspA也有类似的机制,可以更好地结合金属离子稳定蛋白质的结构。此外,产生的离子电流ssDNA经过MspA纳米孔有一个更大的差异和一个清晰的信号。MspA是一个八聚物的最小内直径1海里,比α-HL窄通道更稳定,所以它可以提高信号的分辨率DNA测序和比α-HL在极端条件下具有较好的结构稳定性。因此,它非常适合应对紧急情况(总监Abiola所有et al ., 2003)。研究MspA结构充分体现了的潜力和可能性MspA纳米孔测序材料(Derrington et al ., 2010)。

5.1.3。噬菌体phi29

前面的望远镜被命名为基于使用的材料,尽管现在技术命名phi29 DNA聚合酶(phi29 DNAP)。Phi29 DNAP有良好的可持续发展的综合能力和高度的亲和力DNA基板(利伯曼et al ., 2010)。噬菌体phi29 DNA包装电机dodecamer门户蛋白质复合体使用六聚体包装RNA (pRNA)驱动蛋白质。pRNA具有较强的自组装特性,使整个复杂结构高度敏感的(王et al ., 2013)。中间的结构组成的12个蛋白质亚基、3.6 nm通道允许dsDNA穿过中间(Haque et al ., 2018),这与小孔隙大小的缺点在大多数生物纳米孔在过去学习。噬菌体phi29 DNA包装电机与一个更大的直径,纳米孔的狭隘的n端为3.6 nm和最宽的糖基6海里;大直径赋予MspA检测高分子生物标志物的可能性(霁et al ., 2016)。同时,研究发现,噬菌体phi29 DNA包装电机的长度约7海里,和中间的通道纳米孔的横截面积是10至28 nm²(湘et al ., 2006)。更好的理解的易位动态phi29系统可能导致开发出更为先进的DNA易位系统(Haque et al ., 2015),这可以让我们修改和改善蛋白纳米孔从蛋白质工程的角度给他们新的检测能力。

5.1.4。Aerolysin纳米孔

Aerolysin channel-forming毒素分泌气单胞菌属spp。aerolysin可以接受的单体浓度转变成为一个蘑菇形的heptameric insertion-competent的蛋白质(Rossjohn et al ., 1998)。Aerolysin纳米孔结构非常类似于α-HL纳米孔,和Aerolysin纳米孔的通道直径是1.0 - -1.7 nm,小于α-HL纳米孔的(Degiacomi et al ., 2013)。更小的纳米孔穿过dsDNA时产生更稳定的信号。这些条件使得纳米孔测序aerolysin优越的选择材料。根据文献报道,研究使用aerolysin纳米孔寡核苷酸识别正在进行(曹et al ., 2016)。此外,aerolysin纳米孔还显示了其潜在的多肽/蛋白质测序。研究表明,13的20个氨基酸的帮助下可以确定短聚阳离子载体中单分子陷阱可以限制aerolysin感应区(Ouldali et al ., 2020)。

5.2。固态纳米孔

5.2.1。自动瘦2 d纳米孔

最近,材料科学的进步为纳米孔的建设带来了新的可能性。特别是二维材料吸引了特别关注他们的超薄厚度。单层石墨烯,碳的同素异形体,被认为有可能实现单碱基解决由于其原子厚度和优秀的机电特性(Garaj et al ., 2010)。然而,仍然有一些缺陷在使用石墨烯作为纳米孔测序材料。在实验中,石墨烯纳米孔堵塞是由于特定的DNA和石墨烯之间的疏水作用。为了解决这个问题,一个新的自组装单层pyrenediol发明,它可以改变石墨烯的疏水性,防止纳米孔堵塞(施耐德et al ., 2013)。石墨烯纳米孔的另一个限制是信噪比。1 / f噪声较高比单层和双层石墨烯纳米氮化硅纳米孔。因此,将石墨烯层能降低噪音水平,增加膜厚度(Heerema et al ., 2015)。二硫化钼(金属氧化物半导体₂)是另一个自动事实上厚度薄的二维材料,在过去的研究显示一个更好的信噪比(刘et al ., 2014)。同时,一些研究发现,金属氧化物半导体₂纳米多孔膜是一个很好的纳米多孔材料,具有相同的性能优良的石墨烯纳米孔在许多方面,如空间分辨率和横向检测性能。

5.2.2。单壁碳纳米管

作为一种多功能纳米材料,SWCNT已经被彻底开发和广泛应用于各领域由于其优秀的机电特性,多个修改站点和高生物相容性(唠叨et al ., 2021)。这些优势也使SWCNT可能使纳米孔材料。据文献报道,第一SWCNT纳米孔被插入超短SWCNTs的脂质影响。当DNA易位行为SWCNT纳米孔的变化,可以检测离子电流的变化(刘et al ., 2015)。此外,研究表明,单一离子运输四种不同的氨基酸阳离子已经检查通过SWCNT直径为2.25 nm,它已经发现,电导率变化和流动测量使用SWCNT有可能识别特定的氨基酸(埃里森et al ., 2017)。

6。纳米孔测序的应用

6.1。应用纳米孔测序过的

快速检测(POCT)通常是执行与便携式实验室设备;它也被称为快速测试或near-patient测试(费雷拉et al ., 2018)。执行测试直接下一个病人将帮助提供快速反馈结果。过的不需要运输测试样品和分析过程简化;它并不一定需要实验室工作人员执行测试;病人、家庭成员、护士等,能做到。快速测试结果可用于筛查、监测或诊断。POCT预计将发挥更重要等地的医院,急诊室,专家诊所,或救护车和还可以用于病人在家完成自测。新一代的望远镜需要样本少,体积小,携带方便,操作简单,可以在各种复杂的环境中完成测序,会议POCT的需要。

偏远地区远离实验室经常有更多的防疫和控制困难。埃博拉病毒(EBOV)、西非的疫情始于2014年,是一个典型的例子;在西非的埃博拉暴发期间,现场诊断实验室的研究人员在利比里亚成功地使用了一种新的袖珍纳米孔测序仪(Hoenen et al ., 2016)。这种技术的优点是方便和速度。只需要3 h的示例来识别委内瑞拉马脑炎病毒埃博拉病毒,可以有力的证明了POCT在检测现场RNA病毒(Kilianski et al ., 2016)。癌症可能发生在人体的任何地方,和癌前往往是很阴险的,因此癌症的早期检测是非常重要的,但目前对癌症治疗后癌症复发和监控检测缺乏速度和及时性。研究报告,基于纳米孔测序检测结构变化可以实现个性化疾病监控基于循环肿瘤癌症患者的DNA。这种方法可以提高疾病监测水平的敏感性,可以设想的智能处理方法(Valle-Inclan et al ., 2021)。此外,研究人员发现,便携式望远镜有可能快速分子诊断癌症,提议使用纳米孔测序加速全面诊断和改善病人的护理(Euskirchen et al ., 2017)。纳米孔测序可能成为一个优秀的工具的低级分子检测复发,及早发现、治疗监测(所需或癌症相关的结构性变化诺里斯et al ., 2016)。

基因组分析是一个典型的临床试验。望远镜已经被证明是一个有效的工具,TP53突变监控(Minervini et al ., 2016)。一项研究显示了奴才设备可以识别病原体从尿液样本和获得抗性基因在大约只要PCR测序(施密特et al ., 2017)。联合使用纳米孔测序和等温扩增提供了发展的可能性,及时分析其他病毒(McNaughton et al ., 2019)。研究还表明,即使在有限的条件下,纳米孔测序设备奴才,结合等温扩增,表现良好在识别人类疟原虫(Imai et al ., 2017)。实验表明,实时临床分离株基因组测序的花费更少的时间比表型磁化率测试(柠檬et al ., 2017)。纳米孔测序结果还表明,检测结核分枝杆菌的诊所需要不到24小时(李和Pai, 2017年)。

最近,结合使用的便携式纳米孔测序设备简化样品制备协议打开了DNA测序的可能性在微重力环境中(麦金太尔et al ., 2016)。的奴才纳米孔测序设备已经证明了它的多功能性在各种恶劣环境中,以及后续的测序平台的小型化(SmidgION)和图书馆准备相关工具的出现(Zumbador VolTRAX)进一步完善纳米孔测序DNA测序应用程序和RNA-sequencing应用程序(Jain et al ., 2016)。

6.2。纳米孔测序在植物基因组中的应用

自2000年第一个植物拟南芥的基因组破译(拟南芥基因组计划,2000年),DNA测序一直是生物学中发现新的见解的决定性的一步。植物基因组通常有很多重复的序列,和基因组规模相对较大。纳米孔测序的读特征应用到植物基因组测序组装更容易高质量基因组序列(Murigneux et al ., 2020)。作为一个新兴技术,纳米孔测序发现许多有意义的应用程序在植物基因组测序。有研究报告使用Illumina公司和纳米孔测序平台的结合提供第一chromosome-level基因组数据的红豆杉和构建整个基因组发展史。树奠定了基础为提高红豆杉的优秀遗传性状在未来(Ning et al ., 2020)。结构变化是改善作物品质的基础。科学家们应用纳米孔测序检测作物结构变化和成功捕获238490结构性变化超过100种不同的番茄品种。并通过定量遗传学和基因组编辑的结合,研究人员展示了如何改变基因和表达水平的结构性变化影响产量、规模和其他特征的西红柿,改进具有指导意义的优秀特质的西红柿(Alonge et al ., 2020)。在另一项研究中,科学家利用纳米孔测序设备两个印度香米品种的整个基因组序列,为随后的基因组和功能分析(提供材料崔et al ., 2020)。信使核糖核酸甲基化(m6A)突变是表观遗传学的重要研究内容。它指的是修改和改变6-methyladenosine (m6A)发生在信使rna分子,调节基因表达和拼接。RNA稳定等方面发挥着重要的作用。研究报告使用纳米孔执行直接野生型和信使RNA的RNA序列甲基化的模式植物拟南芥突变体,揭示了复杂的mRNA加工长单分子读取和修改可能导致拟南芥基因组注释的细化(帕克et al ., 2020)。短内容测序技术由Illumina公司往往导致不完整的和分散的结果由于植物基因组的高度可再生的和自然多倍体。因此,研究人员开发了一个基于读协议测序设备(奴才或PromethION测序仪)和光学映射(Saphyr系统);他们使用这个协议为两个新生成高质量的基因组芸苔属植物Z1双子叶植物形态类型。序列证明其有效性贝尔瑟et al ., 2018)。

6.3。应用纳米孔测序的细菌基因组

细菌的表型之间的差别很小,和细菌的大小通常是非常小的,难以监控。因此,它是至关重要的类型细菌通过全基因组测序技术。来自美国宇航局的科学家环境卫生系统(EHS)使用望远镜序列微生物收集和培养在国际空间站(ISS)和将结果传送给地球。然后,地球上相同的样品测序在标准实验室确认身份的微生物样品。这标志着第一次地球之外的微生物已经完全测序(伯顿et al ., 2020)。

奴才™DNA测序仪是价值高的分辨率和微生物多样性分析。这个平台已经被用于许多研究在这个领域。例如,放大器的细菌16 s rRNA基因测序,并足以重建获得的数据超过90%的16 s rRNA的20个物种基因序列模拟参考社区(Benitez-Paez et al ., 2016)。科学家发明了一种方法使用的奴才™DNA测序仪的长阅读能力快速序列“rrn核糖体运营商(宏基因组)复杂的自然的社区。由于小和方便的平台,的可能性描述微生物群现场或在机器人平台上已经成为现实Kerkhof et al ., 2017)。奴才™DNA定序器还可以提供更准确的分布。平台突破短阅读的局限性决定的成分在整个shotgun-based宏基因组DNA测序(宏基因组),并获得根号的测序结果(布朗et al ., 2017)。与此同时,研究人员使用一个奴才™DNA定序器执行长的扩增子测序。获得的数据足以模拟的两种微生物群落的研究多路复用的方式,几乎完全重建这两个模拟的微生物多样性社区(Benitez-Paez Sanz, 2017)。

Illumina公司测序平台得到了广泛的应用,但短期读取长度限制了其适用于基因组的能力,而纳米孔测序长度长阅读的优势,弥补了这一缺陷。一项研究表明,12株肺炎克雷伯菌测序用的奴才测序设备,并结合传统的Illumina公司测序结果,良好的测序结果(灯芯et al ., 2017)。其他研究人员也进行了类似的实验,以伤寒立克次氏体分离株的基因组序列,使用v9.5化学制备、测序库在万象的奴才,老挝,Illumina公司测序一个英国实验室的设备。和上面相同的隔离被测序。从纳米孔测序序列读取设备的奴才和读取Illumina公司设备在娇美的结果表明,假阳性错误的频率太高了(艾略特et al ., 2020)。蝠鲼Sereika测序活性污泥的厌氧消化池使用单一的Illumina公司MiSeq 2×300个基点,PacBio高保真,牛津纳米孔R9.4.1 R10.4和显示,牛津纳米孔R10.4可以用来生成near-finished微生物基因组从隔离或基因组不短内容或参考抛光。

传统的微生物淡水测试侧重于检测特定细菌指标物种,并通过宏基因组测序所有微生物DNA是一种有效的方法。研究报告使用确定性成分和时空的微生物群的地表水剑桥河提供优化实验和生物信息学的指导方针。发现望远镜的应用在基因组学可以描述水文核心微生物和细时间梯度,与互补的物理化学测量(城市et al ., 2021)。也有研究报道,炭疽杆菌全基因组测序的纳米孔从人类炭疽隔离完成几小时后在一个高度封闭的实验室(麦克劳克林et al ., 2020)。另一个类似的研究使用的测序设备从Illumina公司和牛津纳米孔技术(一)或SMRT太平洋生物科学(PacBio)比较混合程序集20细菌隔离,包括两个参考菌株。结合观察和Illumina公司基因组中读取装配过程促进高质量的基因组重建(De Maio et al ., 2019)。宏基因组测序可以更快速地识别细菌性下呼吸道感染(LRI)病原体在诊所,为临床诊断提供了重要的参考,但这种方法需要删除大量的人类DNA在这些样品。为此,研究人员开发了一个方法来识别细菌爱丽丝望远镜的基础上,通过实验验证。第一次测试的方法是在40个样本,然后优化41个样本,和优化方法可以准确地检测抗生素抗性基因(Charalampous et al ., 2019)。

6.4。病毒基因组中应用纳米孔测序

望远镜有一个独特的优势病毒实时监控、病毒进化和基因突变的研究由于其长度超长阅读,可以覆盖大部分的病毒基因组和方便和快速排序的过程,它已经被广泛使用。与下一代测序(上天)平台相比,纳米孔测序可以获得许多病毒的全基因组不使用任何组装算法,从而避免工件和错误。此外,漫长的读取从纳米孔测序可以揭示病毒的基因组片段插入宿主基因组,集成事件等乙肝病毒和人乳头状瘤病毒在人类基因组中,带来新的见解病毒相关肿瘤发生的机制。登革病毒的基因组测序过程需要很长时间,是昂贵的,依赖于PCR技术。为此,研究人员开发了一个全面的分子完成登革病毒基因组测序方法,使用纳米孔测序技术在使用生物信息学工具(Nano-Q)区分病毒变异的宿主。结果表明,覆盖的前提下> 100年登革热病毒基因组序列通过这种方法和生成的对应Illumina公司成对序列相似度超过99.5%。和最大似然系谱树产生的共识序列生成的纳米孔可以准确的繁殖树Illumina公司测序一个保守的99%导阈值(1000年以后重复和10%老化)(Adikari et al ., 2020)。以来的病理学研究乙型肝炎病毒(HBV)是基于完整的乙肝病毒基因组结构数据,研究人员已经开发出一个协议,它使用一个等温轧制圆放大HBV DNA在使用纳米孔测序技术。这个协议还提供潜在选项的早期检测乙肝病毒和其他病毒(McNaughton et al ., 2019)。塞内加病毒(上海广电)已被确定为水泡的原因疾病在不同的国家,但我们缺乏的知识预防和诊断基于病毒的序列结构。因此,科学家们进行直接的RNA序列和PCR-cDNA测序股东价值分析模型使用的奴才纳米孔测序设备然后组装的整个基因组序列。一致的精度分析优化后的99%和94,分别。它提供了一个参考为提高股东价值分析的理解和发现,预防其他传染性病毒(谭et al ., 2020)。有研究报道,直接cDNA序列的甲型肝炎病毒(HAV)使用测序设备可以获得整个甲型肝炎病毒基因组(巴蒂斯塔et al ., 2020)。小反刍动物有害病毒(PPRV)是一种病毒,国药控股关注和控制。同时,PPRV存在于许多偏远落后的地区。这些实验室缺乏高通量测序的条件。为此,一些研究人员已经开发出一种新的全基因组测序PPRV协议使用便携式miniPCR和奴才。这个协议已经成功地从细胞中提取完整的基因组文化和自然感染山羊样本(Torsson et al ., 2020)。传统的短内容(Illumina公司)测序方法很难实现良好的测序结果由于放大和重新编码RNA病毒直接测序,而读望远镜可以弥补这些缺点。一些研究人员使用单纯疱疹病毒(HSV)来华的主要成纤维细胞作为模板使用牛津纳米孔技术的构建提供指导直接RNA序列库,它提供了一个重要的参考其他研究者进行实验(Depledge和威尔逊,2020年)。埃博拉病毒大规模传播,有非常高的致命率,快速变异。数据显示,埃博拉病毒基因组(EBOV)替换率在Makona应变估计为0.87×10(−3)/网站每年。和1.42×10(−3)突变。因此,长期监测埃博拉病毒的基因组测序已经成为当务之急的埃博拉病毒的预防和治疗。一些研究人员开发出一种基因组监控系统使用望远镜,2015年在几内亚进行了大量实验,生产结果在不到24小时后收到积极的埃博拉病毒样本。这表明,有可能建立在偏远落后地区的实时监控基因组,为监测提供重要的参考埃博拉病毒和其他传染性病毒(快速et al ., 2016)。

6.5。纳米孔测序SARS-CoV-2的检测中的应用

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)是冠状病毒疾病背后的罪魁祸首(COVID-19)大流行,2019年开始,一直延续到今天。准确检测SARS-CoV-2病毒利用基因测序设备是至关重要的防疫和控制和跟踪SARS-CoV-2病毒生产疫苗的发展(陈et al ., 2020)。纳米孔测序可用于各种环境,方便和速度使纳米孔测序的优势被广泛用于检测COVID-19和其他呼吸道病毒。COVID-19流行2020年在印度期间,国家疾病控制中心(NCDC)的104年印度进行全基因组测序COVID-19病人使用的奴才纳米孔测序设备,发挥了重要辅助作用在防疫和疾病控制(Kumar et al ., 2020)。COVID-19大流行期间在英国在2020年3月,研究人员使用的奴才纳米孔测序设备序列1000 COVID-19样本在英国剑桥大学医院,747年收益率高质量的基因组。这种方法使我们能够有效地监控无形SARS-CoV-2病毒。它也表明,纳米孔测序和PCR测序技术相结合可以有效地评估绑定能力在临床测试(梅瑞迪斯et al ., 2020)。摩尔等人在英国也进行了一项类似的研究,取得了良好的结果(摩尔et al ., 2020)。在奴才COVID-19流行2020年9月,纳米孔测序设备也用于预防和控制疫情。重新测试619出院COVID-19测试呈阳性的病例发现87 SARS-CoV-2 (陆et al ., 2020)。2020年COVID-19爆发在美国,研究人员利用其纳米孔测序设备来执行宏基因组测序的NP拭子标本50 COVID-19病人和检测到的微生物群落多样性减少这些患者,建议的有效性望远镜的宏基因组测序SARS CoV-2 NP拭子(Mostafa et al ., 2020)。纳米孔测序的读取长度比前几代测序技术,周转时间和优势,可移植性,和成本,使得纳米孔测序广泛用于对抗COVID-19暴发的前线在不同的国家。然而,有限的纳米孔测序测序准确性也引起关注的应用监控SARS-CoV-2纳米孔测序。因此,研究人员对157份SARS-CoV-2病人样本进行病毒全基因组测序和合成RNA控制使用纳米孔测序设备和Illumina公司传统的测序设备,分别。结果表明,安大略省的测序结果错误率高于Illumina公司设备,但仍取得了高度精确consensus-level测序。同时,安大略省的测序工具结构多样性也发现了新的信息(牛et al ., 2020)。类似的研究是由研究人员使用传统Illumina公司测序设备和纳米孔测序设备执行SARS-CoV-2全基因组测序(WGS)来评估性能(Charre et al ., 2020)。

6.6。纳米孔测序的应用直接RNA序列

直接的RNA序列不需要逆转录和放大,降低错误由于重组和不匹配的可能性。直接RNA序列可以描述细胞形态,揭示病毒基因组信息,确定细胞基因表达状态和检测转录后可变剪接的差异和RNA的修改。读,快速方便,望远镜是非常适合直接RNA序列。科学家开发出了一种直接基于望远镜RNA-seq测序方法,这是一种高度并行的,实时的,单分子的方法,不需要逆转录和放大,一直读长度,并能生成完整,strand-specific RNA序列(Garalde et al ., 2018)。单分子N6-methyladenosine (m6A)检测是RNA序列的一个重要组成部分,但目前还没有全面的直接检测的方法。为此,研究人员开发出一种新方法,”Nanom6A”,使用纳米孔技术直接基于XGBoost RNA序列样本模型,可以实现单碱基m6A修改分辨率和定量分析(高et al ., 2021 a)。理解基因组组织和基因调控需要深入了解的RNA转录,处理和修改。一些研究人员使用纳米孔直接序列拟南芥野生型和mRNA methylation-deficient (m6A)突变体rna。结果表明,直接使用望远镜的RNA序列可以揭示的复杂性在目标基因mRNA加工和修改,这些发现有助于进一步完善拟南芥基因组注释(帕克et al ., 2020)。一些研究人员使用纳米孔直接核糖核酸测序技术检测N6-methyladenosine (m6A) RNA修改准确率90%。这些结果初步揭示了望远镜的应用前景领域的直接RNA序列(刘h . et al ., 2019)。

6.7。纳米孔技术的进步领域的蛋白质测序

纳米孔技术在生物分析显示了伟大的多功能性。它可以快速、方便地分析样本,此外,修改的可能性,提高了纳米孔结构,以满足更多的需求。近年来,随着纳米孔测序设备的发展和支持工具的提高,纳米孔测序设备越来越显示它的多功能性检测各种生物分子。尤其是在DNA测序,安大略省的随后发起了各种商业纳米孔测序设备。纳米孔测序的未来发展方向是应用望远镜检测蛋白质和多肽,在生命活动中发挥直接作用。

根据当前的研究现状,测序蛋白质和肽是非常具有挑战性的工作。目前,我们主要面临三个困难:(1)如何安全有效地展开的蛋白质结构。蛋白质分子量比DNA和RNA,当前纳米孔太小,蛋白质结构是复杂的,和电荷密度分布是不均匀的。因此,如果我们想要检测和分析蛋白质,我们需要先解开的高层结构蛋白质和氨基酸的链,可以通过纳米孔;(2)肽被纳米孔的信号。目的是确保氨基酸链穿过纳米孔在一个稳定的和适当的速度,产生一个足够辨认不同离子电流的变化。不幸的是,目前的研究无法控制的速度通过纳米孔的氨基酸链达到商业水平;(3)氨基酸的识别。这最后一步是区分基于氨基酸的差异产生的离子电流氨基酸链穿过纳米孔。同时,不同的修改可能是分布在多肽链,如甲基化、乙酰化、磷酸化等等。 These structures affect the resolution of protein sequencing.

近年来,研究人员已经进行了许多研究将望远镜应用于蛋白质测序,以及一系列的进步。研究表明,蛋白质使用aerolysin纳米孔测序发现,离子电流变化的差异引起的通过20自然氨基酸通过纳米孔的水平,可以检测到当前设备。为此,研究人员提出了用σ′值增加溶液的电导率。的σ′值描述了纳米孔中的离子迁移率的综合结果,这有助于蛋白质纳米孔测序提供进一步的见解(霍et al ., 2021)。另一项研究报道,大肠杆菌蛋白质OmpG单一多肽链,这也是一个理想的替代蛋白纳米孔测序,丰富蛋白质纳米孔测序材料的选择(Sanganna粗毛et al ., 2019)。

传统的纳米孔测序、DNA测序等依赖于统一的线性电荷密度的DNA。然而,蛋白质和多肽与复杂的结构往往是异构的电荷密度,使其不确定执行纳米孔易位。为此,研究人员开发了一个直接、模范自由、实时监测易位的单分子方法无序异构带电肽通过纳米孔。这两个“选择性标记”结束时流产主要是用来证明肽的高灵敏度的易位应用跨膜电位(Hoogerheide et al ., 2018)。纳米孔测序材料的选择是关键。蛋白质序列的可行性进行了实验,分子动力学模拟石墨烯纳米孔,和单链苯丙氨酸甘氨酸重复肽作为示例。发现肽将坚持石墨烯并显示当受到跨膜偏差或静水压力梯度。当易位发生,离子电流的差异变化生成的纳米孔运输期间改变氨基酸通过纳米孔的类型。作者最初使用石墨烯材料的可行性验证蛋白纳米孔测序(威尔逊et al ., 2016)。这项研究还报道的方法使用三色荧光蛋白质测序和等离子体纳米孔设备。计算机仿真结果表明,该方法可以正确地识别大多数蛋白质在人类蛋白质组。此外,即使考虑到实际实验条件,深度学习蛋白质分类器整个蛋白质组的精度可以达到97%。将该方法应用于临床相关的蛋白质数据集,一个正确的蛋白质(获得了约98%的识别率Ohayon et al ., 2019)。除了开发新的蛋白质纳米孔测序材料,改进现有材料的使用也是一个重要的发展方向蛋白质测序。研究报告使用平衡所有原子分子动力学模拟估计α-hemolysin纳米孔的变化信号与20标准氨基酸有关。结果表明,当前α-hemolysin影响氨基酸的体积,疏水性,净电荷和不能生成一个信号有足够的分辨率。这个结果的基础上,提出了一种改进的方法修改α-hemolysin纳米孔(Di Muccio et al ., 2019)。

7所示。纳米孔测序的生物信息学

在初始启动商业纳米孔测序设备的奴才,公司没有提供支持序列分析工具,而所有其他工具然后不能过程设备的特殊FAST5输出数据格式。位于安大略省的这个发明了一种Poretools工具包,可以直接操作本机FAST5文件格式,以及提供一系列的格式转换、数据探索和可视化工具(河野与荒川,2019年)。

与此同时,另一个新的问题出现了。分析工具开发了基于传统测序方法不再能满足分析的需要由纳米孔测序结果设备。因此,研究人员一直在努力开发新工具用于各种目的。表中给出以下的讨论是不完整的,但我们试图引入尽可能多的有代表性的工具,可以应用于纳米孔测序结果的分析。

7.1。基本要求

基础识别任何测序方法的初始步骤。在纳米孔测序,当一个D链穿过纳米孔,纳米孔的电流变化,电流变化引起的不同的基地也是不同的。基础识别将核苷酸序列(A、C、G、T)读数从收集到的电信号变化纳米孔测序仪器(GridION奴才,或PromethION)。一系列的进步基于纳米孔测序的基本要求分析近年来进行了。长鳍、古比鱼和凯龙星经典basecaller工具。关于精度指标,位于安大略省的长鳍和孔雀鱼是优越的,而第三方工具凯龙星不执行。就速度而言,孔雀鱼是最快的由于其GPU加速,虽然凯龙星是最慢的,尽管使用GPU加速(灯芯et al ., 2019)。此外,鲣鱼,一个开源的研究项目提供的汽水机,完成培训和basecalling过程。鲣鱼GPU-focused项目主要是在原始精度方面有显著的提高,但以牺牲发现算法较慢的基地。你可以找到这个方法的开源代码在表的末尾部分如果你感兴趣的发展。

最近,这是一个有前途的方向使用深度学习和神经网络技术来分析纳米孔测序数据。一些研究人员提出了一种改进的U-net模型变换前典型的基于标签序列调用任务分成一个多标签分类基本要求的任务。这个改进是基于欧盟的基本要求和分割,取得竞争的结果(Zhang et al ., 2020)。其他研究人员已经提出了一个新的深度学习模型使用一个临时同步网络(TCN)。相比传统的深度学习模型使用递归神经网络(RNN)的TCN优势的基础要求精度和速度(曾庆红等人。,2020年)。根据当前的不足和实际需要,研究人员已经开发出各种新算法和工具与不同的功能和优势。EpiNano,一个算法预测m6A RNA从dRNA修改序列数据集,可以现在火车模型与特征提取basecalled dRNA seq FASTQ数据和原始FAST5纳米孔输出(刘h . et al ., 2021)。Ravvent是一个新的basecaller使用联合处理原始和事件数据和基于递归神经网络(encoder-decoder架构Napieralski诺瓦克,2022)。NanoReviser,开源DNA basecalling校订者,是基于一个深度学习算法正确basecalling错误引入的当前默认basecallers提供(王et al ., 2020)。DeepNano珊瑚达到实时基础要求在测序精度略优于孔雀鱼基地的快速模式调用者和非常节能,只用10 W的功率(Perešini et al ., 2021)。Sigmap,纳米孔原始信号映射工具,可以映射原始纳米孔信号实时选择排序和具有相当大的性能图yeast-simulated原始信号(Zhang et al ., 2021)。未交是一个开源mapper流快速匹配的纳米孔电流参考信号序列(Kovaka et al ., 2021)。有很多新的分析工具的研究,提出了一些基本调用计算满足日益增长的需求。定制FPGA与CPU运行在高速串行连接和一个简单的API实现了测量加速了处理器仅仅basecalling超过100×能源效率改进的三个数量级(吴et al ., 2020)。Readfish,工具包,可以使用GPU来选择性的特定序列DNA分子在一个池,使枚举和删除解决生物问题(佩恩et al ., 2021)。我们还发现纳米孔测序主流基本调用者(爱德华兹et al ., 2019;Mitsuhashi et al ., 2019;Shabardina et al ., 2019)。这些基地呼叫者的特点不同,和每一个适用于特定情况。此外,有些是过时由于技术进步,但他们仍然可以见证望远镜的发展。下面是一个描述的软件用于基本要求:

7.2。对齐

尽管安大略省的测序的整体精度逐渐提高,一些读的准确性相对较低,和1 d的错误率读和2 d / 1 d2读很高。因此,在下游分析,自我纠错和混合纠错算法通常用于获得更高的灵敏度和提高测序数据的质量。

算法来处理这个问题已经研究了很长一段时间,爆炸和最著名的和有效的算法(史密斯和沃特曼,1981年)。研究人员已经开发出一些序列比对工具来解决长读取出错的具体特征。Graphmap,第一个校准器设计专门为测序,在2016年被释放。Graphmap可以逐步提高候选人比较减少错误率。而对于~ 10 kb嘈杂的读取序列,minimap2更快。Minimap2 (李,2018),由哈佛大学的李亨,是最优秀的序列比对工具,它可以执行连接感知比较互补脱氧核糖核酸RNA序列或直接读取。据研究人员刘et al。(2019),使用基于对齐骨架,他们提出了淡化,拼接参考序列提供精致的比对。淡化工具可以解决一些挑战,比如小外显子拼接严重的测序错误和行业共识。生产完整的比对的方法提供了一种方法更高层次的质量,有很大的潜在的转录组研究。加速与基因组序列图的对齐,GraphAligner (Rautiainen Marschall, 2020)开发一个工具,基因组地图长读图。

与前面的工具相比,GraphAligner是12倍。此外,它的内存使用量低5倍,使其与调整读取线性参考基因组。GraphAligner已经发现几乎三倍更准确和15倍其他纠错工具使用时纠正错误。在解释Joshi et al。(2021),QAlign预处理器设计用于对纳米孔测序读对齐算法。此外,它还可以用于重叠long-reads或对齐RNA-seq读取转录组除了将读取的基因组。尽管类似的计算时间,QAlign提供更精确的比其他校准程序基于核苷酸序列比对。调整序列读的有向无环图是常见的误差修正。根据这个,的作者高et al。(2021 b)现在abPOA(自适应联合偏序排列),一个SIMD-based C库,使用自适应联合动态编程来实现快速偏序排列。除了其独立工作的能力与共识作为对齐工具调用,它也可以被纳入任何工作流读纠错和组装。尽管之前类似的对准精度工具,abPOA 15倍速度比以前的工具。后(傅et al ., 2021),火神使用双模读一致性提高sv的识别。由于变异率的变化,火神基因组的不同区域使用不同的校准技术,改善SV检测。SV检测也可以提高了映射长读与火神较小的编辑距离。也是相关的,范围广泛的相关工具,以下是最受欢迎的软件工具,适用于调整长读的纳米孔测序:

7.3。序列组装

至关重要的基因组注释和完整的生产微生物为了更深入的了解他们的多样性和生物。组装方法使用合并计算序列如序列比对和构建时间连续从短片段的DNA序列。特别是序列组装比较两组之间的重复区域拼接短测序片段(读)获得的基本识别成一个长连续的序列(重叠群),然后将长序列拼接到一个长骨架(支架),允许空白序列(gap)。通过消除骨架错误和空白序列,这些骨骼是位于染色体获得高质量的全基因组序列。这种技术形成,因为核酸分子测序通常更长时间比现有的DNA测序技术。这个分析的目的是重建的原始外观测序DNA测序结果的分子长度有限。纳米孔测序读超过前面的测序,可以生成大量的数据在一个运行。

与其他测序平台相反,纳米孔测序GC-rich地区不存在偏见和覆盖repeat-rich序列和结构变异不融入传统测序方法。但它仍然不能完成测序整个基因组的测序,并有许多基因组测序错误和重复测序数据。可能需要更多的误差校正,消除错误进一步提高装配精度,尤其是对组装方法没有误差校正步骤。此外,纠错可以增加当地的组装和读数之间的相似性映射读取装配和改变装配提高选秀大会的准确性。因此,序列组装的首要任务是合理和有效地处理这些问题(El-Metwally et al ., 2013)。

在望远镜的不断成熟,越来越多的开源工具装配方法。可以完成一个圆形细菌基因组CCBGpipe,根据这项研究(廖et al ., 2019)。创建叠连群涉及抽样读取并将其装配多次创建圆形重叠群共享一个序列。可以使用CCBGpipe自动组装圆形细菌基因组。与现有的增强的差距关闭工具,需要多个比较错误率高、研究人员徐et al。(2019)称为TGS-GapCloser开发了一个软件工具,关闭差距没有使用任何纠错,提高选秀大会将军平均25%。与长读和低成本短读的结合,POLCA大会抛光工具可以产生高度相邻组件整体较低的错误率。作为替代,短在组装阶段读可以合并或用于波兰的共识,结果长读(Zimin扎尔茨贝格,2020)。利用结构之间的同线性程序集和参考序列草案,作者狭谷et al。(2020)生成高质量的基因组序列。与轻量级NtJoin映射方法实现基于有序最小值素描图的数据结构。NTJoin,高度连续的程序集可以更快和更少的内存使用生成比现有reference-guided装配工。根据花瓶和Šikić(2021)为提高,有效的方法存在新创从错误long-reads基因组组装。

本文中提供的工具,乌鸦是最快的一个选择而消耗的最低数量的内存。摘要(贴梗海棠et al ., 2020为识别)描述了一种新的管道新创菌株当多个metagenome给定样本社区是可用的。coassembly图独特的存储简化前的变异,从而防止歧义的映射和利用更多的信息了解变异的同现读比变异单独治疗。在Fritz et al。(2021),一些研究人员描述Haploflow de Bruijn基于汇编从混合组装病毒基因组序列样本。相比一般的宏基因组装配工和病毒单体型汇编、Haploflow既是更快和更准确。

在以前的工作相比,福尔et al。(2021)作者提出GraphUnzip,快速,节省内存,和准确的工具,生成高质量的gap-less supercontigs只通过连接序列重叠潜在的联系。在Murigneux et al。(2021),作者提供了一个快捷、集成解决方案获得高质量的细菌的基因组结合与创建MicroPIPE Illumina公司测序,组装细菌基因组的端到端流程。然而,开发相关的生物信息学工具,主要是定量分析工具,仍然是不够的。因此,应选择合适的纳米孔测序序列组装工具基于特定疾病的病原微生物实现更好的结果。我们总结了几个目前流行的工具组装纳米孔测序读备查。

7.4。SNP和变异检测

每个给定物种的基因组层面上是独一无二的。例如,我们和其他人的区别是大约300万个基点,或0.1%。因此,参考基因组通常表示为常见序列从几人。然而,个人特性或疾病易感性是由细微变化引起的DNA。单核苷酸多态性,微小的插入或删除(indels),结构变化,如大indels,和复杂的重组,如易位和反演,是遗传变异的例子。

结构变异(sv)是许多研究领域的焦点,从癌症研究作物识别sv和编码所需的特征。在大多数情况下,sv megabases的大小,所以在短部分测序和组装他们是不可能的。因此,不完整或不正确的程序集可能结果,而PCR需求可能阻止sv impossible-to-amplify地区出现。阅读与牛津纳米孔的长度并不局限:单读取频繁达到数百个碱基,与当前记录超过四个字节。因此,即使大sv通常可以测序单读、端到端允许精确的描述,通常消除装配的必要性。除了识别sv整个基因组没有放大,这种方法可以识别重复扩张和重复区域。

通过这种方式,完整的修改基地可以测序,允许sv及其表观遗传效应的识别在一个实验。在这方面,牛津纳米孔技术提供研究sv的高可扩展性和高效。例如,在Aljabr et al。(2020),研究人员使用牛津纳米孔测序读结合amplicon-based MERS-CoV测序的快速排序,提供一致的基因组数据,MERS-CoV小突变,缺失突变体。使用这种方法,可以确定插入和删除冠状病毒基因型的变化负责。尽管如此,纳米孔技术并非没有挑战。例如,癌症基因组测序的分析提出了许多挑战。特别是,突变确定由多个变体调用者往往不一致,即使他们使用相同的基因组测序数据。

此外,阅读需要调用映射和变体识别体细胞突变,这是复杂的过程。因此,开发了一个简单的方法来评估使用K-mers癌症基因组测序数据序列(李et al ., 2020)。这种方法验证突变通过比较突变的频率在正常和肿瘤之间k-mers序列匹配的统计。

此外,除了上述挑战,随着嘈杂的长阅读导致复杂SV签名,很难同时实现高吞吐量和性能优良。因此,研究(江et al ., 2020)提出了cuteSV、敏感、快速、可伸缩的方法检测读签名与高灵敏度和可伸缩性sv现有最先进的工具,使用一个自定义的方法来收集签名的各种类型的sv。另外一项挑战是牛津纳米孔的高错误率显示在研究(冯et al ., 2021);协会通过检测用于弥补差距,逐步小单核苷酸变异频率低至0.2%。这种方法具有重要意义在理解细胞遗传学异质性在物种基于读宏基因组信息。当应用于4×WGS数据,SV调用软件通常无法检测致病性SV,特别是当SV由长删除,删除,复制,和不平衡易位。所示梁et al。(2022)为SV SENSV,新开发的软件调用,对所有类型的SV高度敏感,断点的准确性一般100个碱基对,都是有关的。此外,我们提供了一个列表的一些最常用的变量调用下面的工具为您的方便。

7.5。信号分析和可视化

望远镜的信号处理主要的担忧减少噪音和提高准确性,和近年来出现了许多新的研究活动。

一些研究人员优化自适应乐队事件对齐算法高效运行在异构CPU-GPU架构(Gamaarachchi et al ., 2020)。一般基于结合脂质体纳米孔方法分析物控制的信号放大和报告分子纳米孔检测报告。这种方法极大地扩展了应用范围的纳米孔,和很容易变化的敏感性纳米孔从水平μM水平调频(田et al ., 2019)。纳米孔的分析方法基于中心极限定理(此时)。最优电压检测中使用的标准偏差是由阻塞电流和时间常数在不同电压补偿。与传统的数据分析方法相比,阻断信号处理解释水平理论导致更为集中阻断电流和持续时间的分布。它允许拟合高斯时间直方图并避免盒子大小的影响在持续时间分析(时间常数燕h . et al ., 2021)。CpelNano,一种新的统计方法,使用隐马尔可夫模型的真实但未知(“隐藏”)测量状态是通过一个伊辛模型的概率分布是一致的测量手段和对相关性,而纳米孔电流信号与观测一致状态(Abante et al ., 2021)。一些研究人员结合混合连锁反应(HCR)与纳米孔检测DNA的存在小目标转换成long-nicked DNA的聚合物纳米孔特征信号。纳米孔的放大信号通过HCR不仅克服了固体纳米孔的功能限制,也大大提高了选择性和信噪比,从而使检测ctDNA检测极限的2.8调频(S / N = 3)和单碱基决议(太阳et al ., 2020)。其他研究人员已经提出了一种新的强大的方法,该方法能够准确地分类原始纳米孔信号数据通过将当前强度转换为图像或像素阵列,然后利用深度学习算法进行分类。第一个实验协议的开发直接RNA序列库条码多路复用证明了这一策略的力量(史密斯et al ., 2020)。科学家提出了SquiggleNet,第一深度学习模型,可以直接从他们的电信号分类纳米孔。SquiggleNet运行速度比DNA通过毛孔,允许实时排序和阅读飞机。SquiggleNet区分人类和细菌DNA有超过90%的准确率,延伸到细菌物种没有发现在人类呼吸系统宏基因组样本,而准确地分类包含人类长期渗透重复序列(保et al ., 2021)。深度学习方法去除离子电流噪声电阻脉冲传感器。电位移nano-corrugated单个纳米粒子的纳米孔检测。噪音降低卷积神经网络自动编码,旨在优化迭代比较和最小化两个波形之间的区别通过梯度下降法。去噪在高维特征空间已被证明能够检测波形信号来自涟漪。原始曲线或不能识别这些信号频域下给定的噪声基线数字处理后,迅速的动电的分析单个纳米粒子和双纳米粒子可以被跟踪原位。label-free学习去除噪声的能力在不影响时间分辨率可能有助于固态纳米孔检测的蛋白质结构和多核苷酸序列(Tsutsui et al ., 2021)。

新领域的研究也出现了纳米孔测序数据可视化。BulkVis是一个工具,可以加载批Fast5文件,覆盖MinKNOW(为期音序器软件控制)分类信号跟踪,并显示映射到参考。用户可以导航到一个通道和时间或跳读到一个特定的位置对于一个给定的FASTQ头。BulkVis可以导出一个区域作为一个阅读兼容Nanopole基本调用者(佩恩et al ., 2019)。红杉资本、可视化分析工具,允许用户交互式地探索纳米孔序列。红杉资本结合的面向后端多视点可视化界面,使用户能够进口Fast5格式的原始纳米孔测序数据,集群序列基于当前的相似性,并深入信号识别感兴趣的属性(Koonchanok et al ., 2021)。部分相关的工具如下:

7.6。自适应采样

自适应抽样或选择性测序,允许快速、灵活,适应大型基因组测序众多地区或特定子集的多个基因组因为拒绝单个分子的能力而被测序(宽松的et al ., 2016)。通过减少时间和成本的测序和样品制备,这些方法使研究人员能够读测序关注特定区域解决生物问题。

已经在这个领域进行了一些相关研究。不同于以往的模式匹配方法,标题在序列空间,允许实时选择性测序牛津的奴才。此外,标题的预审特性减少了计算要求只允许信息和及时读取承认在决策过程中,从而使实时基地发现,对齐,和选择的奴才读取无需专用的高性能计算环境(爱德华兹et al ., 2019)。此外,研究人员Thomsen et al。(2019)已经创建了一个合理设计的DNA纳米孔最大的通道内腔到目前为止,已加上一个可编程的触发,显著扩大纳米孔的功能。他们展示size-selective、模块化和响应闸门机制之间的分子隔间隔开脂质影响基于直接观察和详细分析个人DNA的插入和易位动力学对脂质体纳米孔。另一种方法称为未缴可以快速匹配流纳米孔电流信号与参考序列流。FM-index为基础,未交的可能性考虑信号代表一个K-mers并相应地梅干候选人基于概率分析(Kovaka et al ., 2021)。使用牛津纳米孔技术,与此同时,T-LRS能够解决突变更精确地使用自适应抽样,这已经被证明是一个有效的和具有成本效益的方式来分析基因和优先领域,导致更好的质量数据(米勒et al ., 2021)。此外,研究人员在万纳et al . (2021)采用纳米孔自适应采样序列l .猩红热mitogenome从粪便,非侵入性的样本。没有浓缩测序相比,自适应抽样导致双重增加一部分host-derived和mitochondria-derived序列。合成模拟metagenomic社区和一个复杂的真实示例使用校正自适应采样的软件丰富。针对性的浓缩low-abundance物种显著减少所需的时间组装高精度,single-contigs比作一道测序。他们的研究结果表明,重复抛射的分子从毛孔影响孔隙比以前报道的稳定性,减少和纳米孔宏基因组研究将受益于自适应抽样(马丁et al ., 2022)。小说的方法称为ReadBouncer纳米孔自适应采样基于交叉布鲁姆过滤器,和快速的CPU和GPU下面是基本要求。通过提高阅读分类的敏感性和特异性,ReadBouncer提高低丰度序列的潜在浓缩,超越现有工具的功能。而软件运行在商品硬件没有gpu,甚至是足够健壮删除阅读属于大型参考序列。这使得研究人员可以在地里干活(乌尔里希et al ., 2022)。的效用RPNAS浓缩病毒基因组已经被一些研究者强调临床样本。通过使用自适应排序,可以获得特定的基因组数据,可以缩短恢复时间,可以应用于传染病病原体检测和监测在现阶段具有灵敏度高、周转时间短(林et al ., 2022)。为了您的方便,我们已经包括列出了一些最常用的自适应采样工具如下:

7.7。表观遗传修饰检测

表观遗传修饰是指环境因素引起的可遗传的基因表达的变化不改变DNA序列(就和佳日,2015年)。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、DNA蛋白质相互作用,染色质可访问性、组蛋白修饰和更多的(Alizadeh et al ., 2017)。从DNA与组蛋白的RNA,这些化学修改发生在不同维度互动,最终影响突触,内存和神经通路。此外,他们影响蛋白与神经信号的变化。为了推动生物医学研究,有必要对表观遗传机制的深入了解,他们的互动,改变在健康和疾病。

通过分析DNA甲基化,研究人员能够获得宝贵的见解基因调控和识别潜在的生物标记物。一些疾病,包括癌症、肥胖和上瘾,已经与异常的DNA甲基化有关。最初,DNA甲基化的研究集中在识别检测基因的甲基化的位置和数量的确定5-methylcytosine出现在DNA。5-methyl胞嘧啶和重亚硫酸盐处理nonmethylated基地是有区别的,这是一个广泛使用的和有效的方法(Zhang et al ., 2015)。使用亚硫酸氢的检测5-methyl胞嘧啶,尽管广泛使用,并有一定的局限性,包括不完整的转换,假阳性结果,难以使用(Laird et al ., 2016;Gholizadeh et al ., 2017)。由于纳米孔测序不需要PCR扩增,基地装饰可以同时检测到在核苷酸序列没有额外的样品制备。此外,纳米孔测序是免费的GC的偏见,使其更容易获得一致的基因组的测序深度和识别区域不能被传统的测序方法和methylation-calling技术。亚硫酸氢盐数据相比,纳米孔甲基化分析收益率较低的偏见,更好的映射,优越的再现性和更快的分析。因此,越来越多的分析工具被开发来检测DNA甲基化在纳米孔测序数据。当使用纳米孔DNA甲基化检测的数据,一个方法论的挑战出现时,即检测DNA单体CpG网站修改。单件和单体之间的区别是CpG位点的数量每10-basepair地区。论文认定的甲基化状态在一个10个基点地区被认为是相同的,所以识别变化论文认定附近的另一个挑战。尽管几种方法(如表中列出)已经开发检测dna甲基化在单件,仍然很难检测dna甲基化在单体(辛普森et al ., 2017;倪et al ., 2019)。与此同时,DNA甲基化水平的变化取决于基因组上下文和不遵循线性分布(李和张,2014年;格林伯格和Bourc 'his, 2019年),不同的基因组区域可能会产生不同的甲基化的结果。为此,一个全面的调查提供了一个系统的比较新一代甲基化调用工具,并为他们的发展提供指引(刘y . et al ., 2021)。为我们贡献的一部分,我们还提供了相关的可用工具协助检测表观遗传修饰。

7.8。压缩和文件格式

尽管纳米孔测序基因组景观重塑,大量基因组测序数据最近几十年已经生成,需要大量的存储空间。由于存储和传输这些数据,困难瓶颈发生在基因组测序分析。

在这方面,压缩存储的已成为一个重要方面,传输和分析数据。目前,压缩方法,专注于短内容长测序已经不再适用于基因组学将读长序列的统治地位。这促使研究人员研究读长压缩技术在更大的深度。减少原始FASTQ原始测序数据的大小,提出了几种压缩技术,包括Picopore ENANO, RENANO, NanoSpring FastqCLS, CoLoRd (Gigante 2017;Dufort y阿尔瓦雷斯et al ., 2020,2021年;孟et al ., 2021;Kokot et al ., 2022;李和歌曲,2022年)。作为一个例子,Picopore (Gigante 2017)提供了一个软件套件,包含三个压缩方法:原始、无损和深度无损压缩。所有这些方法都能同时进行排序,从而减少直接和长期存储的必要性。ENANO算法(Dufort y阿尔瓦雷斯et al ., 2020),重点是质量分数压缩和提供了最大和快速压缩模式,交易效率和速度之间的压缩过程。ENANO相比,RENANO (Dufort y阿尔瓦雷斯et al ., 2021)达到显著提高压缩读取序列,但仅限于对齐的数据与一个可用的参考。相比之下,NanoSpring (孟et al ., 2021)是一个reference-free工具,依靠近似组装方法以达到压缩收益,但是它需要更多的时间和内存来完成压缩收益。FastqCLS (李和歌曲,2022年)压缩算法使用阅读重新排序压缩长读长序列数据在不牺牲信息和表现良好的压缩比。CoLoRd (Kokot et al ., 2022)使用数据冗余重复读取的纳米孔测序数据的大小降低一个数量级不影响下游分析精度。此外,论文(Gamaarachchi et al ., 2022)认为,纳米孔测序依赖Fast5文件格式进行有效的并行分析为了解决大数据量和计算瓶颈。此外,它引入了SLOW5,高效并行的另一个格式纳米孔数据并加速其分析。作为一个例子,在一个典型的高性能计算机,人类基因组的DNA甲基化分析从/ 2周减少到大约10.5 h。下面是一个表,提供上面提到的工具。

7.9。固态纳米孔测序数据分析

而蛋白质纳米孔受限于他们的寿命很短,固态纳米孔主要用SiNx制作、SiO₂或金属氧化物半导体₂在过去十年中吸引了大量的研究活动(Goto et al ., 2019)。然而,直接由固态纳米孔测序仍然是具有挑战性的,主要是由于分子的超快速度易位和重要的噪声嵌入到原始信号(Fragasso et al ., 2020)。因此,最根本的一步固态纳米孔测序数据分析事件检测,旨在准确定位分子易位的时间范围和确定不同级别的易位事件由复杂的构象如DNA节(喜气洋洋的et al ., 2020;温家宝et al ., 2021)。

提出了一些自动化工具执行事件检测通过考虑均值和/或当前值的标准偏差,比如Transalyzer EasyNanopore (图et al ., 2021)和EventPro (Bandara et al ., 2021)。最近,我们也开发了两个事件检测工具集中在本地范围内接近峰值电流的值在每个分段片:前者使用简单统计方法选择从大量的片真实事件(太阳et al ., 2022),而后者考虑分子的直径的比值相对于纳米孔。近年来,基于机器学习的方法也被提出执行事件检测任务,比起和的基于变压器方法了(Dematties et al ., 2022),以及一个bi-path方法来检测事件从低信噪比当前的痕迹(Dematties et al ., 2021),显示出令人印象深刻的表演。

事件检测后,一些研究人员开始采用机器学习的方法来提取事件由不同的分子特性和分类事件。深入学习方法来区分单核苷酸开发(迪亚兹Carral et al ., 2021);另一种方法是识别不同的冠状病毒开发高精度结合固态纳米孔结构和机器学习模型(谷口et al ., 2021)。这个创新的测序平台促使推出一个新的商业公司,Aipore Inc .在第三个研究中,研究人员证明了成功利用图像识别技术对事件进行分类由四个合成粘多糖(夏et al ., 2021)。这些开创性的研究表明,在不久的将来,人工智能和机器学习技术将扮演越来越重要的角色在固态纳米孔测序的发展。

7.10。便携式纳米孔分析

集成电路的小型化和其他计算机硬件在过去的几十年里,纳米孔测序以较小的形状大小、便携式甚至手持形式因素,已经出现在地平线上。这种趋势推出了一个新时代,笔记本电脑,平板电脑甚至是智能手机和便携式Android设备可以提供计算资源以支持纳米孔测序(Palatnick et al ., 2020)。自5 g技术拥有一个安全的和高数据传输速率,东南大学的研究团队和中国移动已经开始了一家合资企业,将纳米孔测序与一个完整的5 g网络云计算框架执行在线纳米孔测序和数据分析实验室和计算机设备。

8。结论

根据望远镜的单分子检测技术已被广泛用于多种生物样品的分析,并将应用于在未来更多的方面的分析。作为一个有前途的下一代测序技术,望远镜预计将成为一个不需要,快速、低成本的DNA测序技术,这将使世界的希望测序,随时随地。纳米孔检测技术,DNA序列,研究人员已经能够识别和分析各种类型的分析物在动物、植物、细菌、病毒(尤其是COVID-19检测),等,同时要求小的样品制备。长读长(10000 - 50000),不需要放大和修改(直接读取序列,操作方便),可用于各种环境,取得了良好的效果。在生物物理学和nano-biotechnology、生物和固态纳米孔是有效的单分子传感器。使用固态纳米孔与其他单分子技术允许一个综合的方法来识别单个DNA分子的微小的特征。尽管纳米孔测序具有良好的可操作性和广阔的应用前景,一些重大困难有待克服。在这些精确的需求,高速DNA检测超出了现有的空间和时间分辨率的光学和电子技术,这是一个关键的纳米孔测序DNA在单分子水平的限制。因此,DNA碱基识别和减少速度仍然是主要问题。纳米孔技术将显著影响DNA测序以及个人健康和疾病诊断的未来。 Integrating the advantages of nanopore experiment strategy, micromachining technology, circuit design, and the development of improved algorithms will hasten the advancement of nanopore technology toward inexpensive and tailored DNA detection, particularly DNA sequencing.

目前,高错误率仍然是阻碍其应用的关键。目前,奴才音序器的单碱基精度约为85% (Cretu Stancu et al ., 2017),修改后的共识序列的准确性(97%Jain et al ., 2018)。对大基因组和生物变异率相对较低,如动物和植物,增加测序深度可以达到一定的纠错效果,并对研究结果的影响不是特别大。然而,临床测试通常需要非常严格的数据准确性。此外,病毒基因组小,突变率高,出错率的影响是不容忽视的。因此,改善纳米孔测序平台的准确性,以便能更好地为科研人员仍然是我们努力的方向。单分子望远镜需要发展的方向更高的吞吐量,精度高,自动化程度高。

同时,研究人员和纳米孔测序研究人员需要努力加强和整合当前的技术和环境,以及发展新的技术方法和研究生物挑战的解决方案。我们应该考虑自己的研究目标和需求,利用现有的平台,相互学习,制定适当的测序计划实现新的科学发现。此外,测序技术的性能应该不断完善,随着测序技术的适用范围应根据实际和新实验的要求。

作者的贡献

电脑,z, JW:数据管理、模型创建、和纸稿。XL:设计的方法。海尔弟弟:正式的分析。JC,艾尔,FQ:样本收集。YC, CY、JS和生理改变:手稿审查。L-QX和杰:整个项目设计、概念化、调查、监督和修订。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

学术作者承认金融支持中国国家自然科学基金(批准号32270607)。和所有作者感谢中国移动(成都)工业研究所资助的研究(批准号8531000015和8531000015)。作者还谢谢支持中国载人航天计划的空间医学实验项目(HYZHXM01004)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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引用

Abante, J。,Kambhampati, S., Feinberg, A. P., and Goutsias, J. (2021). Estimating DNA methylation potential energy landscapes from nanopore sequencing data.科学。代表。11:21619。doi: 10.1038 / s41598 - 021 - 00781 - x