冰川细菌胞外多糖产生高收益的冷冻保存gydF4y2Ba
佩尔维斯•阿里是pml - qgydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
麦阿里沙gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
什么哈桑gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
诺伯特•HertkorngydF4y2Ba
3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
迈克尔GonsiorgydF4y2Ba
4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Wasim萨贾德gydF4y2Ba
5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
陈冯gydF4y2Ba
1 *gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba海洋与环境研究所的技术,马里兰大学环境科学中心,巴尔的摩,医学博士,美国gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba应用环境和地球微生物学实验室,真纳大学微生物系伊斯兰堡,巴基斯坦gydF4y2Ba
- 3gydF4y2Ba亥姆霍兹慕尼黑中心的研究小组分析生物地球化学、德国慕尼黑gydF4y2Ba
- 4gydF4y2Ba切萨皮克生物实验室,马里兰大学环境科学中心,巴尔的摩,医学博士,美国gydF4y2Ba
- 5gydF4y2Ba生物科学部门,国立大学医学科学,巴基斯坦拉瓦尔品第gydF4y2Ba
假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2 psychrotrophic细菌隔绝Batura冰川的冰样本收集,巴基斯坦。这个菌株产生高度粘性殖民地与葡萄糖琼脂媒体补充。在这项研究中,我们已经优化生长和胞外多糖的产量(EPS)的低温gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2使用不同的营养和环境条件。gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2能够生长在广泛的温度(4-35°C),第5 - 11 ()、pH值和盐浓度(1 - 5%)。碳利用率增长和EPS生产进行了广泛的研究,我们发现葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油是可取的碳源。压力也能够使用糖浪费糖浆作为生长基质,相对昂贵的替代糖大规模EPS生产。最大生产EPS被观察到15°C, pH值6,氯化钠(10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),葡萄糖为碳源(100 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),酵母提取物作为氮源(10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),和葡萄糖/酵母提取物比例(10/1)。在优化条件下,生产EPS为2.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,这是相对较高的gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种相比,以前的研究使用相同的量化的方法。高效阴离子交换色谱法与脉冲电流检测(HPAEC-PAD)每股收益的分析揭示了葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺为主要糖单体。使用人类红血球膜保护试验显示显著减少细胞溶菌作用(∼50%)在每股收益的存在,表明其在膜的保护作用。每股收益(5%)也赋予重大cryoprotection嗜中温gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12与甘油(20%)。同时,改善脂质过氧化抑制(gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba)造成的脂质gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba与每股收益进行预处理。每股收益增加生产在低温下,冻融宽容的EPS产生应变,和生存能力的增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在EPS作为防冷冻的代理支持假设EPS产品在极端寒冷的环境中生存的策略,如冰川冰。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
低温地球上的极端环境中非常普遍。大约85%的地球生物圈永久暴露在温度低于5°C和冰川占10% (gydF4y2BaMargesin Miteva, 2011gydF4y2Ba)。寒冷的栖息地已经被微生物的生存和成功殖民甚至生长在温度接近冰点的水。冷生物被称为它们或永久psychrotrophs前者隔绝寒冷环境,后者倾向于主导环境进行热波动(gydF4y2Ba罗素1990gydF4y2Ba)。低温微生物已经进化出独特的机制来应对挑战。这些适应性包括增加膜流动性通过膜的血脂的变化(gydF4y2Ba罗素1997gydF4y2Ba;gydF4y2BaChintalapati et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaKralova 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaSiliakus et al ., 2017gydF4y2Ba)、构象的灵活性和增加酶活性参与重要的细胞过程,如转录和翻译(gydF4y2BaLim et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba罗素2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba恩斯特et al ., 2018gydF4y2Ba),冷休克诱导蛋白(csp) (gydF4y2BaPhadtare 2004gydF4y2Ba),抗冻蛋白的生产(法新社)(gydF4y2Ba吉尔伯特et al ., 2004gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2005年gydF4y2Ba;gydF4y2BaLorv et al ., 2014gydF4y2Ba),和生产的冷冻保护剂如胞外(支付系统;gydF4y2BaKrembs et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaAslam et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba腐肉et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
胞胞外多糖聚合物是由微生物产生和分泌细胞外(gydF4y2Ba萨瑟兰1972gydF4y2Ba)。微生物产生的多糖在两种形式中,每股收益和荚膜多糖(CPS)。每股收益或黏液仍然松散附着在细胞或完全释放到周围环境。CPS仍密切相关的细胞被膜通过共价键和在发病机制中扮演角色。许多微生物包括细菌(gydF4y2Ba勒维et al ., 2017gydF4y2Ba)、古菌(gydF4y2BaSquillaci et al ., 2016gydF4y2Ba)、蓝细菌(gydF4y2BaBemal Anil, 2017gydF4y2Ba)、真菌(gydF4y2Ba太阳et al ., 2016gydF4y2Ba)、酵母(gydF4y2Ba汉et al ., 2018gydF4y2Ba)和微藻(gydF4y2BaGarcia-Cubero et al ., 2018gydF4y2Ba)生产系统。每股收益提供保护天敌,抗菌药物和协助微生物忍受极端的温度(gydF4y2BaCasillo et al ., 2017gydF4y2Ba)、盐度(gydF4y2BaBemal Anil, 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaIsfahani et al ., 2018gydF4y2Ba)和干燥(gydF4y2BaTamaru et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba诺尔斯,Castenholz, 2008gydF4y2Ba)。附件的支付系统也基本微生物其他表面可能是生物或非生物(gydF4y2BaJanczarek et al ., 2015gydF4y2Ba)、营养吸收(gydF4y2BaKalpana et al ., 2018gydF4y2Ba在生物膜的形成),最重要的是(gydF4y2BaLimoli et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba罗西和腓立比,2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
胞外生产微生物从多样的极端环境中孤立的包括海洋温泉和深海热液喷口(gydF4y2Ba竞技场et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaPanosyan et al ., 2018gydF4y2Ba)、极地和寒冷的海洋环境(gydF4y2Ba曼库索尼科尔斯et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaAslam et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaCasillo et al ., 2017gydF4y2Ba),盐和高盐度环境(gydF4y2Ba波里et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaJoulak et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
假单胞菌gydF4y2Ba物种已报告之前的生产系统。这些系统演示了各种功能活动从金属切削(gydF4y2BaMaalej et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaSathiyanarayanan et al ., 2016gydF4y2Ba)、胶凝和乳化活性(gydF4y2Ba腐肉et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaMaalej et al ., 2016gydF4y2Ba)、生物膜的形成(gydF4y2Ba詹宁斯et al ., 2015gydF4y2Ba),抗氧化活性(gydF4y2BaSirajunnisa et al ., 2016gydF4y2Ba)和抗菌活性(gydF4y2BaMaalej et al ., 2017gydF4y2Ba)。分析单糖单位是一个关键系统的结构特征。系统只有一个类型的单体的单位被称为homopolysaccharides和超过一种类型的糖单体单元称为杂多糖。单糖组成的成员产生的支付系统gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种代表不同的化学结构。的每股收益gydF4y2Ba假单胞菌stutzerigydF4y2BaAS22是杂多糖包括葡萄糖、甘露糖、lactyl鼠李糖(gydF4y2BaMaalej et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2BaSathiyanarayanan et al。(2016)gydF4y2Ba报告从psychrotrophic杂多糖gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。PAMC 28620,葡萄糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、鼠李糖、核糖单体单位。南极细菌,gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。ID1杂多糖生产由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖糖单体(gydF4y2Ba腐肉et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Bap . stutzerigydF4y2BaXP1生产右旋糖酐,homopolysaccharide葡萄糖单位组成的gydF4y2Ba赵et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
近年来,快速消耗自然资源和需求增加对天然聚合物为制药、食品和其他工业应用导致显著的多糖由微生物产生的兴趣。细菌产生不同结构和功能系统,在生物技术和行业发挥着重要的作用。黄原胶、结冷胶是两个著名的商用细菌EPS与通常被认为是安全的(GRAS)状态。黄原胶在食品、石油工业、医药、化妆品、个人护理产品和农业(gydF4y2Ba萨瑟兰2001gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雷姆曾为此写过。,2009年gydF4y2Ba;gydF4y2BaImesonEd。,2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杨。,2011年gydF4y2Ba)。结冷胶广泛应用在食品、宠物食品、医药、和研究(琼脂替代和凝胶电泳)(gydF4y2Ba萨瑟兰2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaFialho et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雷姆曾为此写过。,2009年gydF4y2Ba;gydF4y2BaImesonEd。,2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba生et al ., 2013gydF4y2Ba)。右旋糖酐、海藻酸、农业和其他细菌纤维素EPS,工业和医学有重要商业价值的相关性。一些系统已经报道了抗癌、抗病毒、抗菌、抗溃疡、抗氧化和免疫调节活动(gydF4y2BaLaroche Michaud, 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba竞技场et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba诺瓦克和Vetvicka, 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaMahdhi et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朱et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2019gydF4y2Ba)。这就是为什么有益的益生菌对人体健康的影响在一定程度上归因于系统由细菌产生的。gydF4y2Ba
自然是最好的储层和探索极端环境中可以有前途的微生物代谢产物的工业来源相关性。形成鲜明对比的是另一个极端环境中,没有报道EPS产生细菌从寒冷的环境中,尤其是来自冰川的非极性区域。因此,有一个持续的兴趣等生物勘探寒冷环境冰川至少探讨利基。冰川被认为是生物圈的严酷的环境下带有一个特殊的低温性和psychrotrophic生物的生物群落。冰前的和冰川下的生态系统的多学科研究只是处于起步阶段,文学是迅速扩大的微生物存在于这些环境的潜在作用。大量的冰川在极地地区位于喀喇昆仑山脉,其中还包括Batura冰川。有非常有限的报告可以在相关的多样性和生物技术潜在的细菌存在于喀拉昆仑山脉冰川。gydF4y2Ba
Himalaya-Karakoram-Hindukush (HKH)是最冻结成冰的区域外的极地地区,因此认为地球第三极(gydF4y2BaZhang et al ., 2015gydF4y2Ba)。这些范围在一个结点在巴基斯坦北部的主人至少5000个冰川在地理边界和服务淡水很大一部分人口(gydF4y2Ba拉苏尔et al ., 2011gydF4y2Ba)。相比这些冰川不探索极地冰川的细菌多样性和功能。Batura冰川,经度和纬度36°32′N 74°40′E,是世界上最长的非极性冰川之一。我们探索这冰川使用文化相关的细菌多样性和文化无关的方法。冰川是由一群不同psychrotrophic细菌(未发表的工作)。gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp, BGI-2用于详细研究其他细菌由于其高丰富冰川冰样本,在低温下快速增长。gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2产生最高的EPS中七EPS从冰川样品生产隔离。以前,草案基因组序列数据显示,BGI-2基因组有11 EPS-producing基因相比,没有七嗜中温密切相关gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba压力(gydF4y2Ba阿里et al ., 2019gydF4y2Ba)。我们还发现更多的应激反应基因的基因组BGI-2比嗜中温密切相关。BG1-2能够茁壮成长的冰川可能由于其弹性以应对严酷的冰川条件包括频繁的冻融循环,高紫外线、干燥和低营养的可用性。这项工作表明,每股收益产生的低温gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2提供抵御严酷的环境条件(冻融事件)和化学溶解(洗涤剂)。生产的EPS这株授予重要cryoprotection嗜中温gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在cryoprotection k12的,表明其作用。此外,每股收益提供了大量稳定红血球的细胞膜受到洗涤剂溶解。增加抑制脂质过氧化的EPS进一步验证其在膜的保护作用。前工作的大多数系统都集中在它的使用作为胶凝或乳化剂在食品工业,这项工作将为每股收益的新途径,如利用冷冻保存和膜稳定剂。特别是在低温贮藏中的应用行业将是一个重大的里程碑为当前使用的冷冻剂(最常见的二甲亚砜(DMSO)和甲醇)是细胞毒性浓度更高。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
样本收集和细菌隔离gydF4y2Ba
样本收集了在2015年12月24日。一个冰斧用70%乙醇擦拭用于钻探和取样的冰。表面被冰5英寸,丢弃,底层的冰是无菌收集到无菌聚丙烯样本广口瓶500毫升。根据标准执行处理的样品微生物技术来避免任何污染。管密封,放置在一个恒温箱,和运送到微生物学研究实验室,真纳大学,伊斯兰堡,储存在−20°C。gydF4y2Ba
细菌隔离,使用两种不同的方法:(a)直接电镀的样品R2A, TSA,磅琼脂和(b)样品的浓缩R2A肉汤(Difco),胰蛋白酶的大豆肉汤(Oxoid)和Luria-Bertani肉汤(Miller)在电镀之前琼脂板上。直接电镀,镀不同稀释的样本在琼脂板使用扩散板的方法。盘子在4和孵化15°C和每天观察菌落外观。样品浓缩,10毫升的融化冰样本添加到100毫升R2A肉汤(酵母提取物0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba、蛋白酶蛋白胨0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,casamino酸0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,葡萄糖0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba、可溶性淀粉0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba丙酮酸钠0.3 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba磷酸,dipottasium 0.3 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,硫酸镁0.05 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),大豆胰蛋白酶的肉汤(胰腺消化酪蛋白15 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,酶消化的大豆5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,氯化钠5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba、葡萄糖2.5 g / L)和Luria-Bertani肉汤(胰蛋白胨15 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba酵母提取物5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,氯化钠10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),放在瓶孵化器(150 r / min) 4和15°C。2周后浊度的媒体表示细菌生长。不同的稀释浓缩样品镀R2A, TSA,磅琼脂板使用扩散板的方法。盘子在4和孵化15°C和每天观察菌落外观。BGI-2从冰样本通过样本中分离出细菌八浓缩。应变是根据平板划线分离纯化方法和低温贮藏在使用20%甘油−80°C。gydF4y2Ba
标识隔离gydF4y2Ba
初步鉴定分离是通过菌落形态(大小、高度、保证金和色素),细胞形态(革兰氏染色法),使用不同的生化检测(柠檬酸三糖铁试验、过氧化氢酶、氧化酶、利用率、硝酸盐还原)。在实验室BAS BGI-2全基因组测序的完成,海洋和环境研究所的技术,马里兰大学环境科学中心系统,使用Illumina公司Miseq测序。快速注释使用子系统技术(gydF4y2Ba阿齐兹et al ., 2008gydF4y2Ba)被用来获得完整的16 s rRNA基因序列和序列是爆炸使用EzBioCloud数据库(gydF4y2BaYoon et al ., 2017gydF4y2Ba)。16 s rRNA基因序列提交与加入数量MH681214 NCBI基因库。系统树是由neighbor-joining方法使用大型7.0软件(gydF4y2Ba斋藤和Nei, 1987年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
增长优化BGI-2gydF4y2Ba
确定最佳生长条件,BGI-2种植在不同的温度下(4-45°C), pH值(4),盐度(1 - 10%),碳源(葡萄糖、半乳糖,乳糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、和淀粉),氮源(胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、尿素、硝酸钠、和硫酸铵),和葡萄糖/酵母提取物比率(1/1,10/1,20/1,30/1,40/1,50/1)。影响不同浓度的糖浆(1 - 5%)的增长BGI-2也被调查。胰蛋白酶的大豆肉汤(17 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba胰蛋白胨,3 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Basoytone, 2.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba葡萄糖,5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba氯化钠,2.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba磷酸氢二钾)是用来生长介质的温度和pH值的优化。胰蛋白酶的大豆肉汤修改不同氯化钠浓度用于盐最佳生长要求。碳利用实验中,矿物盐介质(MSM)是根据准备的gydF4y2BaChayabutra、(2000)gydF4y2Ba(4 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaNHgydF4y2Ba4gydF4y2BaCl, 2.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaKgydF4y2Ba2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba,0.5 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba氯化钠,0.3 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaMgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba×7 hgydF4y2Ba2gydF4y2Ba啊,0.03 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaFeClgydF4y2Ba3gydF4y2Ba×6小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba啊,0.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaCaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,0.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2BaMnClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba×4 hgydF4y2Ba2gydF4y2BaO)补充不同的糖。所有的糖都是使用0.22μm注射器过滤器过滤消毒和无菌添加到媒体矿物盐。优化实验都是在250毫升玻璃瓶进行冷藏与工作腔容积50毫升瓶孵化器(英诺华4340)在150 r / min和15°C。光密度(ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba每24 h)是用于监控增长6天。光密度测量,48-well板1毫升样品卷使用和数据被标(SpectraMax M5)。所有的测试都在复制中运行。增长率也由光密度(ODgydF4y2Ba600年gydF4y2Ba)期间每2 h后的对数生长期增长。gydF4y2Ba
EPS生产优化gydF4y2Ba
环境和营养条件对每股收益的影响生产gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2研究在不同的温度下(4-45°C), pH值(4),盐度(1 - 10%)、潜伏期(1 - 6天),碳源(葡萄糖、半乳糖,乳糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醇、甘露糖,麦芽糖,甘油,和淀粉),氮源(胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、尿素、硝酸钠、和硫酸铵),和葡萄糖/酵母提取物比(1/1,10/1,20/1,30/1,40/1,50/1)。BGI-2也生长在不同浓度(1 - 5%)的糖蜜生产评估它对每股收益的影响。6天的所有实验在冷藏15°C瓶孵化器(英诺华4340)在150 r / min。估计每股收益进行日常使用microplate-based苯酚硫酸法(gydF4y2BaLe Parc et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
提取、净化和EPS估计生产gydF4y2Ba
提取和纯化后的每股收益进行方法的使用gydF4y2BaDabour和LaPointe (2005)gydF4y2Ba做了一些调整。EPS提取,细菌培养样本离心机(10000 r / min, 4°C, 15分钟),颗粒细胞。EPS在上层清液沉淀使用冷冻绝对乙醇的两卷,一夜之间在4°C (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。由离心沉淀EPS收集(10000 r / min, 4°C, 15分钟),在室温下干燥。原油EPS溶解在去离子水,12% (v / v)冷冻治疗三氯乙酸(TCA)和在4°C 1 h。由离心沉淀蛋白质被移除(10000 r / min, 4°C, 15分钟)。上层清液的脱去蛋白质的每股收益被添加两卷冷乙醇沉淀后一夜之间在4°C孵化。离心收集的沉淀EPS (10000 r / min, 15分钟,4°C)在室温下干燥。EPS是溶解在去离子水和对蒸馏水透析2天在4°C使用透析膜(Mw切断:12000 Da)删除柠檬酸的痕迹,盐,和低分子量分子和冻干冷冻干燥器(FreeZone 2.5, LABCONO)。纯化EPS溶解在去离子水和EPS的浓度是由苯酚硫酸法gydF4y2Ba杜布瓦et al ., 1956gydF4y2Ba)。快速量化,所有测量在96孔酶标使用标(gydF4y2BaLe Parc et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图1所示。gydF4y2Ba文化和发展史gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba黏液状的表现型的BGI-2胰蛋白酶的大豆琼脂补充2%葡萄糖,gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba胞外多糖的乙醇沉淀gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba系统发育树gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2使用邻居加入方法引导值(%)从1000年复制大于50。括号中的数字基因库加入16 s rRNA基因序列和数字gydF4y2Ba鲍曼不动杆菌gydF4y2BaDSM 30007根树作为外群。gydF4y2Ba
溶解性测试gydF4y2Ba
EPS的溶解度是检查在不同的溶剂包括水、苯、正己烷、乙酸乙酯,氯仿,甲醇,乙醇,丙酮,DMSO溶液。gydF4y2Ba
单糖组成分析EPS使用高效阴离子交换色谱法和脉冲测量电流的检测(HPAEC-PAD)gydF4y2Ba
单糖组成分析了EPS使用高效阴离子交换色谱法和脉冲测量电流的检测(HPAEC-PAD)采用的方法gydF4y2BaZhang et al。(2012)gydF4y2Ba。水解的每股收益进行了三氟乙酸(2 n)在100°C 1 h (gydF4y2BaMaalej et al ., 2015gydF4y2Ba)。葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖胺、葡萄糖醛酸,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-acetylneuraminic酸(Neu5AC)gydF4y2BaNgydF4y2Ba-glycolylneuraminic酸(Neu5GC)作为标准运行。gydF4y2Ba
核磁共振光谱学的EPS准备gydF4y2Ba
800兆赫gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR光谱与水抑制已获得从∼∼1毫克EPS-BGI-2 400毫克CDgydF4y2Ba3gydF4y2BaOD所描述的其他地方(gydF4y2BaHertkorn et al ., 2013gydF4y2Ba);进一步的核磁共振实验细节和采集参数所示gydF4y2Ba补充文本T1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
冻融EPS产生的生存能力gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2gydF4y2Ba
假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2受到冻融循环检查其生存能力/公差对冻结和冻融循环没有添加任何外部冷冻保存剂。这个测试是由菌落计数方法与前面描述的一些修改(gydF4y2Ba手法et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaShivaji et al ., 2013gydF4y2Ba)。生存能力BGI-2与另一个psychrotrophic non-EPS生产gydF4y2Ba红球菌属gydF4y2Basp。BGI-11孤立从相同的环境(冰川冰)和嗜中温gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的。一夜文化这些细菌的对数阶段是通过5分钟的离心收获10000 r / min。细胞颗粒re-suspended在0.85%氯化钠溶液;1毫升的每种文化被转移到消毒cryovials。CFU /毫升使用扩散板的方法做是为了确定原始细胞数量。所有的瓶都冻在冰箱−80°C。24小时后,管子被吸引的冷冻和解冻了25分钟在25°C水浴;100年μL解冻文化在0.9%盐水连续稀释。这些细菌的生存能力是决定通过比较日志CFU计数冻融前后周期。而BGI-2和BGI-11镀在TSA盘子gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba稀释文化样本镀磅盘子。管再次冻结在−80°C。这个冻融循环后重复每24小时一个星期,CFU /毫升的三种细菌使用平板计数法测定。复制所有的测试运行三个菌株。gydF4y2Ba
防冷冻的每股收益的活动gydF4y2Ba
EPS的防冷冻的财产gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12作为指示生物是由所使用的方法gydF4y2BaDubey和Jeevaratnam (2015)gydF4y2Ba与一些细微的修改。准确地说,一个一夜之间的文化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba年末日志相混合1,3,5% (w / v)每股收益的解决方案。文化首先是通过5分钟的离心收获冷冻离心机在10000 r / min。细胞颗粒re-suspended在0.9%氯化钠溶液和用于测试。同等体积的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba悬浮在1.5毫升cryo-vials与EPS溶液混合做出最后的100毫升。现在μL样本的所有管,连续稀释,镀磅板使用扩散板方法来获取原始的细菌数。所有的瓶都冻在冰箱−80°C。24小时后,管子被吸引的冷冻和解冻了25分钟在25°C水浴。冻融循环重复每24 h后1周和CFU /毫升细菌指标的确定采用平皿计数法。的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的决心通过比较日志CFU计数冻融前后周期。EPS的浓度之间的关系和冻融循环的频率也被评估。EPS的冷冻保存效果与20%的甘油,这是一个著名的冷冻保存剂细菌低温贮藏。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba文化没有添加冷冻剂(EPS或甘油)作为消极的控制。gydF4y2Ba
膜保护试验gydF4y2Ba
红细胞溶解试验gydF4y2Ba
膜保护试验是由使用人类红血球(红细胞),轻微的修改方法如前所述(gydF4y2Ba萨贾德et al ., 2018 bgydF4y2Ba)。红血球被离心分离柠檬酸盐血2000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。细胞用生理盐水洗净磷酸盐缓冲剂,然后re-suspended在同一个缓冲所需的比容水平(1:10)。红血球是使用两个表面损伤因子包括Triton-X和十二烷基硫酸钠(SDS)作为消极的控制。%损害抑制展出的每股收益是100年评估通过添加μL EPS(5毫克/毫升)红血球和孵化了10分钟,最后添加Triton-X和SDS反应混合物。最后成交调整为另一个30分钟。200μL和孵化反应混合物在5000 r / min离心机5分钟。上层清液的收集和吸光度决心在540海里。溶血百分比由下列公式计算:gydF4y2Ba
脂质过氧化抑制试验gydF4y2Ba
硫代巴比土酸(稍后通知)试验进行评估丙二醛(MDA)浓度的方法描述gydF4y2Ba佩雷斯et al。(2007)gydF4y2Ba有一些修改。MDA的脂质过氧化作用导致形成脂质过氧化标记。总脂质提取被找回,根据一个标准协议(如前所述)(gydF4y2Ba布莱和戴尔,1959gydF4y2Ba);250μL脂质样本gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在一夜之间成长文化与125μL 20%柠檬酸混合。上层清液收集和100年μL 1%的每股收益的解决方案是添加和孵化10分钟;0.5毫升FeSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(0.07)被添加到混合,在37°C的环境1 h;300年μL这个解决方案的混合0.8%稍后通知试剂(200μL), 8% SDS(200μL)和在100°C的环境1 h。发色团的吸光度测量在535海里。MDA的MDA浓度视为μM(标准曲线gydF4y2BaygydF4y2Ba= 0.0947gydF4y2BaxgydF4y2Ba−0.152)每毫克的脂质生产使用的摩尔消光系数1.56×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米/厘米(gydF4y2BaKonukoğlu et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba萨贾德et al ., 2018 agydF4y2Ba)。实验一式三份,和脂质提取没有添加任何EPS作为消极的控制。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
筛选和鉴定gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2gydF4y2Ba
BGI-2 Batura冰川的冰样本隔绝,巴基斯坦。融化冰的直接电镀样品在TSA, R2A,磅琼脂板没有产生任何增长甚至在4°C经过9个月的孵化。隔离是通过使用样品浓缩在电镀前R2A肉汤R2A琼脂板上。浓缩文化媒体变成了浑浊的(表示细菌生长)2周后孵化15°C。电镀的浓缩样品在琼脂板上取得了8个形态不同的细菌菌落在4和1个月的孵化后15°C。殖民地BGI-2出现在6天相对于其他隔离出现之后才15至21天。所有的殖民地都净化也放在单独的盘子和低温贮藏在20%甘油−80°C。gydF4y2Ba
BGI-2是最丰富的细菌分离,60%以上的每个板上的殖民地。BGI-2产生大,循环,提高了,而泥泞的殖民地在琼脂板上。这冰川隔离的独特特征是生产极其黏液状的殖民地当生长在R2A或大豆胰蛋白酶的1 - 5%葡萄糖琼脂培养基补充(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),表明EPS生产(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。革兰氏染色法显示BGI-2杆的革兰氏阴性细菌的形状。柠檬酸BGI-2展示积极的测试利用率和减少硝酸为阴性。三糖铁测试显示发酵的葡萄糖和没有观察蔗糖和乳糖发酵。BGI-2还演示了积极的结果对过氧化氢酶和氧化酶的酶。gydF4y2Ba
完整的16 s rRNA基因序列显示应变BGI-2聚集在属gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba),与最近的物种:gydF4y2Ba假单胞菌mandeliigydF4y2Ba(99.59%),gydF4y2Ba假单胞菌frederiksbergensisgydF4y2Ba(99.59%),gydF4y2Ba假单胞菌caspianagydF4y2Ba(99.45%),gydF4y2Ba假单胞菌tremaegydF4y2Ba(99.38%)和gydF4y2Ba假单胞菌amygdaligydF4y2Ba(99.32%)。gydF4y2Ba
增长的优化gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2gydF4y2Ba
BGI-2能够生长的温度范围4-35°C。最佳生长温度为BGI-2提出20 - 30°C左右。增长率最高的是观察到25°C平均指数增长率为0.467 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba和生成时间为2.14 h。降低增长率增加代时间观察4和35°C。没有观察到45°C(增长gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。BGI-2第5 - 11展示了良好的增长在一个广泛的pH值(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。最大的增长是观察到酸碱7和8。平均增长速度7 pH值为0.397 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一代时间2.52小时),在pH值8 0.399 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一代时间2.51小时)。减少向较低的增长率和高pH值观察。没有观察到增长pH值4。不同氯化钠浓度对增长的影响表明BGI-2能够盐范围的增长1 - 5% (w / v)。最大的增长是在控制(没有氯化钠)平均指数增长率为0.39 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一代时间2.56小时)其次是1%氯化钠平均增长率为0.372 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一代时间2.69小时)。降低增长率和增加生成时间观察到更高浓度的氯化钠。没有观察到增长7%氯化钠(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。不同浓度的影响(1 - 5%)的糖蜜作为碳源()的增长显示的最大增长1%的糖蜜,平均增长率为0.318 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(一代时间3.14小时)3和5%的糖蜜紧随其后。至少增长控制中可观察到没有添加糖蜜。BGI-2应变能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油和糖蜜作为碳源。没有增长时观察乳糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖,麦芽糖作为碳源。氮源的最大增长观察酵母提取物其次是蛋白胨和胰蛋白胨(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。可怜的增长记录等无机氮源硝酸钠和硫酸铵。葡萄糖/酵母提取物比,最大的增长是观察到10/1其次是20/1和1/1。生长在高葡萄糖/减少酵母提取物比(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
表1。gydF4y2Ba不同温度的影响(4-45°C)和pH第5 - 11()增长和EPS生产gydF4y2BaPseusomonasgydF4y2BaBG1-2 sp。gydF4y2Ba
表2。gydF4y2Ba不同矿化度的影响(1 - 7%)和糖蜜(1 - 5%)增长和EPS生产gydF4y2BaPseusomonasgydF4y2BaBG1-2 sp。gydF4y2Ba
表3。gydF4y2Ba影响不同的nitorgen来源和葡萄糖/增长和EPS生产酵母提取物gydF4y2BaPseusomonasgydF4y2BaBG1-2 sp。gydF4y2Ba
EPS生产gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2gydF4y2Ba
每股收益的最大生产记录15°C(283毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba在96 h)。同样的增长,每股收益产量很低在4°C的第一个72 h,达成最大在144 h(279毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。的最大生产EPS 25°C被记录在209毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba。没有观察到EPS生产35°C以上(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。pH值似乎最不影响每股收益的生产。最大的EPS生产观察到pH值6(273毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),其次是pH值7(263毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2BaL)和pH值8(256毫克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)在生长的早期固定相。没有观察到EPS生产极端的pH值(酸碱4和11)(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。盐度的最大EPS观察生产在1%氯化钠(287毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2BaL)其次是3%氯化钠(227毫克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。同样的增长,没有观察到治疗EPS生产7%氯化钠(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。不同浓度的糖蜜对每股收益的影响生产显示最大EPS产生糖蜜(675毫克升5%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)紧随其后(451毫克升3%gydF4y2Ba1gydF4y2BaL)和1%(296毫克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。至少EPS中可观察到生产控制(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。虽然应变BGI-2证明增长MSM媒体补充葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油,和糖浆;EPS生产基本培养基中可以忽略不计。氮源的最大EPS酵母提取物生产记录(375毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),其次是蛋白胨(228毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2BaL)和胰蛋白胨(217毫克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。同样的增长,没有记录的EPS生产无机氮源(硝酸钠和硫酸铵)。葡萄糖/酵母提取物比,最大的EPS生产记录(612毫克L 10/1gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)20/1(511毫克升紧随其后gydF4y2Ba1gydF4y2BaL)和30/1(355毫克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
把所有优化营养和环境条件在一个实验中导致的高收益每股收益2.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。优化的条件包括温度(15°C), pH(6),氯化钠(10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),葡萄糖为碳源(100 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),酵母提取物作为氮源(10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba),和葡萄糖/酵母提取物(10/1)。gydF4y2Ba
表4。gydF4y2BaEPS生产BGI-2在优化条件下(15°C, pH值6、10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba氯化钠,100 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba葡萄糖,10 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba酵母提取物、葡萄糖/酵母提取物比10/1)。gydF4y2Ba
潜伏期的影响以及每股收益增长生产也进行了研究。对于大多数的优化实验,观察到的最大增长从24到48 h和每股收益从72年到96年生产h。产量增长和EPS拒绝之后。gydF4y2Ba
在不同溶剂中溶解度gydF4y2Ba
每股收益是完全溶于水;部分溶于苯、正己烷、乙酸乙酯、氯仿;不溶于甲醇、乙醇、丙酮和DMSO溶液。gydF4y2Ba
单糖组成EPS使用高效阴离子交换色谱法和脉冲测量电流的检测(HPAEC-PAD)gydF4y2Ba
单糖组成的分析是非常重要的在描述复杂碳水化合物的结构。山峰的糖单体的特点是外观在不同保留时间的标准(相比gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。结果显示每股收益主要由三个糖单体组成,包括葡萄糖、半乳糖和葡萄糖胺(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图2。gydF4y2Ba胞外多糖的单糖分析:gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba高效阴离子交换色谱法与脉冲电流检测(HPAEC-PAD)色谱九糖作为标准。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba单糖在EPS HPAEC-PAD色谱。gydF4y2Ba
核磁共振谱的每股收益gydF4y2Ba
1gydF4y2BaH NMR光谱获得几张样品表示非常相似的碳水化合物的存在在所有EPS准备,伴随着变量比例的芳香族和脂肪族化合物(数据没有显示)。每股收益的所有准备工作,在所有carbohydrate-related核磁共振共振显示只有相当小的变化相对核磁共振在几乎相同的δ振幅(< 10%)gydF4y2BaHgydF4y2Ba(数据没有显示)。这被称为异头的相对比例质子(gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba)和隐含的生产的EPS分子或EPS分子的混合物,而统一的组成和结构,不论文化条件的细节。隔离BGI-2显示7个专业gydF4y2Ba1gydF4y2BaH核磁共振共振(表示ggydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)异头啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ch,gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR的比例积分(OCH +哟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)/ OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- CH∼6,表明存在peptide-derived CONH-CαH核磁共振共振(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
表5所示。gydF4y2Ba相关领域的七个主要核磁共振共振(800 MHz, DgydF4y2Ba2gydF4y2BaO)异头位置(OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ch) BGI-2 lineshape-fitting 1 d的计算gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR谱。gydF4y2Ba
图3。gydF4y2Ba胞外多糖的NMR分析。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba1gydF4y2BaEPS准备BGI-2 H NMR光谱(800 MHz, DgydF4y2Ba2gydF4y2BaO),橙色(异头carbohydrate-derived核磁共振共振阴影的扩张OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ch)和绿色(哟哟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba单位);主要异头gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR共振g注释(参看文章);数字表示相对gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR部分积分(总:100%)gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba13gydF4y2BaEPS准备BGI-2 C部门核磁共振光谱(125 MHz, DgydF4y2Ba2gydF4y2BaO), carbohydrate-derived的扩张gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR共振阴影橙色(异头OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- ch)和绿色(OCH-units)和蓝色(哟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba单位)单位;红色数字表示半角(Hz)异头和哟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR共振,最有可能造成重叠的相关但不同的化学环境;蓝色数字表示相对gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR部分积分(总:100%,对部分如图所示)。gydF4y2Ba
1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba1gydF4y2BaH TOCSY(总关联能谱法)gydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba13gydF4y2BaC HSQC核磁共振光谱(异核单量子相干)显示,每股收益的主要交叉峰准备分为那些来自碳水化合物和因肽(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。碳水化合物在EPS本身复杂,> 15 HSQC解决交叉峰代表异头OgydF4y2Ba2gydF4y2BaCH-groups在gydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba13gydF4y2BaC HSQC NMR光谱(gydF4y2Ba补充图印地gydF4y2Ba)。其中,7个主要交叉峰(峰g;gydF4y2Ba补充图印地gydF4y2Ba)建议的存在一些碳水化合物的混合物或单一的存在,统一的EPS分子。如果适用,至少19异头位置预计的每股收益(gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba)。然而,更有可能的是,我们目前EPS隔离代表不同的碳水化合物分子的混合物在给予丰富的比率;另一种选择是一些碳水化合物低聚物的存在重复的连接性但是不同的总体规模。gydF4y2Ba
13gydF4y2BaC部门- 135核磁共振光谱(无失真通过极化转移增强)显示只有质子化了的碳原子在一个更大的比可以从单脉冲信噪比gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR谱和允许的亚甲基(负振幅)和次甲基碳原子(积极的振幅)的碳水化合物。他们表示存在的四个主要(组)从他们的不同的异头碳水化合物作为推断(OgydF4y2Ba2gydF4y2BaCH)gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR的共鸣,和几个小的。变量的线宽,核磁共振共振产生的异头碳原子最可能导致类似的化学环境复杂的EPS(叠加gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S2CgydF4y2Ba),而不是从内在影响当地流动性定义化学环境的纯多糖(在这里,少移动大的碎片会产生核磁共振共振线宽)。不同的共振异头头寸的叠加gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR光谱也证实了gydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba13gydF4y2BaC HSQC NMR交叉峰(gydF4y2Ba补充图印地gydF4y2Ba);七个主要HSQC NMR交叉峰g预计在四大gydF4y2Ba13gydF4y2BaC NMR共振(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S2CgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
的生存能力gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2冻融后没有添加外部冷冻保存剂gydF4y2Ba
BGI-2的冻融生存能力是相对于另一个non-EPS生产psychrotrophic应变gydF4y2Ba红球菌属gydF4y2Basp。BGI-11从相同的环境和嗜中温分离gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的应变。七个冻融循环后,生存能力BGI-11 BGI-2 91.1%到64.5%。的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba显著降低,冻融循环和没有生存能力的增加第四周期后观察。总体生存能力下降与冻融事件变量的增加程度取决于压力(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。然而,BGI-2展示了最大公差相比其他两个细菌时遭受反复冻融循环。gydF4y2Ba
图4。gydF4y2Bacryoprotection EPS的作用:gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba冻融的生存能力gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2相比gydF4y2Ba红球菌属gydF4y2Basp。BGI-11和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的平皿计数法。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba冷冻保存效果的不同浓度的EPS (1 - 5%)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12受到七个冻融循环使用平皿计数方法。gydF4y2Ba
防冷冻的每股收益的活动gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2Bak12因cryoprotection试验作为指示生物。我们发现gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的应变恢复到不同程度取决于所使用的浓度的EPS和冻融循环的数量受到了压力。的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的显著增加,每股收益增加浓度从1到5% (w / v)。七个冻融循环后的最大生存观察EPS(89.7%),其次是5% 3%的每股收益(61.5%)和1%的每股收益(27.2%)。生存受到严重影响的控制(EPS)没有可行性4冻融循环后观察。甘油复苏与生存能力最高94.0%的速度(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
红细胞表面膜保护试验(裂解)gydF4y2Ba
红细胞表面膜保护试验使用溶解透露,增加每股收益导致显著减少%溶血(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)相比,控制只有溶解剂(Triton-X和SDS),也没有增加每股收益。这些洗涤剂表面有害物质导致红血球膜的溶解61% (Triton-X)和49% (SDS),分别。然而,孵化前的红血球EPS导致更大的保护红血球膜。总的来说,增加每股收益减少50%和34%溶血的Triton-X和SDS赖氨酸代理(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图5。gydF4y2Ba红细胞表面膜保护试验(裂解)使用人类红细胞表面显示显著减少%溶血当红血球是使用EPS控制相比没有EPS但只有表面活性剂(十二烷基硫酸钠和titron x)。gydF4y2Ba
脂质过氧化作用分析gydF4y2Ba
FeSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba和其他活性substances-induced氧化应激导致损伤细胞脂质和蛋白质,最终导致细胞死亡。每股收益的影响细胞脂质过氧化抑制测量。我们的结果表明,脂质含量gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba没有显示每股收益显著损害细胞脂质。脂质过氧化是注意到1.96μM / mg -控制是减少使用每股收益1.27μM /毫克。明确不同脂质过氧化抑制与EPS和没有EPS观察,揭示EPS作为细胞保护剂的保护作用。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2被选为进一步研究基于其丰度高,相对在低温下快速增长,每股收益最大生产相比其他冰川隔离。当冰川冰浓缩样品条纹在琼脂板、BGI-2由60%以上的细菌菌落。殖民地BGI-2出现在琼脂板的第一周内镀浓缩样品而其他细菌分离株花了2 - 3周形成可见的殖民地。采用初步观察显示这一毒株如何恶劣环境的特点是频繁的冻融循环,干燥(低水活动),高紫外线辐射,低营养的可用性。分子描述使用完整的16 s rRNA基因测序放置BGI-2属gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba与最接近的物种gydF4y2Bap . mandeliigydF4y2Ba和gydF4y2Bap . frederiksbergensisgydF4y2Ba。最近,gydF4y2BaKumar et al。(2019)gydF4y2Ba孤立psychrotrophic应变gydF4y2Bap . frederiksbergensisgydF4y2BaERDD5:01从喜马拉雅山脉的冰川流并展示其高生存能力/公差等应力条件下冻结,冻融循环,UV-C辐射。gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种被发现在不同环境中由于其代谢的灵活性。冷gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种已经从不同的冷环境中分离出世界各地包括极性和非极性区域(gydF4y2Ba张成泽et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaSathiyanarayanan et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaVasquez-Ponce et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2BaMannisto和Haggblom (2006)gydF4y2Ba特征的psychrotophic异养细菌从完成拉普兰,发现三分之一的隔离gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba,代表60%的隔离从高山苔原土壤。gydF4y2Ba梅尔et al。(2004)gydF4y2Ba发现psychrotrophic患病率高gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba在高山土壤样品中细菌社区构成的主要成员。gydF4y2Ba
温度是一个重要因素决定任何生物的生长和代谢产物生产。gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2生长良好的温度范围4-35°C。自增长率低15°C相比25°C和减少超过30°C,因此我们认为最优增长范围位于20 - 30°C。gydF4y2Ba盛田昭夫(1975)gydF4y2Ba它们定义为生物有一个最佳生长温度大约15°C或温度和最大增长20°C以下。Psychrotrophs被定义为生物能够生长在低温下,但他们的最佳生长温度高于20°C。根据这些定义BGI-2下跌的范畴psychrotrophs显而易见的事实是隔绝的环境中经历频繁的温度变化。gydF4y2Ba
尽管BGI-2最适温度是20至30°C,最大EPS生产观察到理想温度15 - 4°C。gydF4y2Ba尼科尔斯et al。(2005)gydF4y2Ba发现了相似的结果,而调查的影响孵化温度的增长和生产EPS耐寒的海冰细菌。他们的研究显示,每股收益的收益率−2和10°C高出30倍比20°C,这是为许多耐寒的菌株最适生长温度。大多数的优化实验在我们的研究中显示的最大生产EPS发生在固定相,依照先前的研究(gydF4y2BaSamain et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2BaMoriello et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba尼科尔斯et al ., 2005gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
碳水化合物和糖是EPS生产首选的碳源。的基板测试,BGI-2能够使用广泛的碳源包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油和糖蜜。代谢的多功能性gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba促进其生存在不同的栖息地和适应多变的环境条件。尽管BGI-2能够生长在男男同性恋者补充葡萄糖或半乳糖为碳源,生长和生物量产量不如在营养丰富的培养基(大豆胰蛋白酶的汤)。生长和生物量的生产BGI-2高出两到三倍比男男同性恋者在大豆胰蛋白酶的肉汤。同时,EPS在男男同性恋者补充生产与1%葡萄糖,半乳糖或糖蜜相比是微不足道的营养丰富的培养基(改性大豆胰蛋白酶的),每股收益产量高达2.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba。大豆胰蛋白酶的汤还有其他有机营养支持细菌生长和生物量的生产。代谢产品的生产在很大程度上依赖于细菌和EPS的营养要求生产深受发酵培养基中的碳和氮源。在我们的研究中,有机氮源(酵母提取物、蛋白胨和胰蛋白胨)优于无机氮源(硝酸钠和硫酸铵)在细胞生长和EPS生产。按照先前的研究中,这些结果的增长,每股收益的收益率gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种存在显著的高于有机氮化合物比无机氮源(gydF4y2BaMaalej et al ., 2015gydF4y2Ba)。根据gydF4y2Ba巴贾杰et al。(2006)gydF4y2Ba,有机氮源是复杂的和含有氨基酸和维生素,提高细胞生长和EPS产量。因此,生产EPS大大影响的碳和氮源使用。gydF4y2Ba
在优化条件下,EPS生产gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Basp, BGI-2 2.01 g LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba更高的是哪一个gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2BaEPS物种之前报道使用相同的方法量化(苯酚-硫酸法)。gydF4y2Ba侯赛因et al。(2008)gydF4y2Ba优化EPS生产了两个gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba物种,发现木糖作为碳源。每股收益的最大产量gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaG1记录木糖(368毫克升3%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba假单胞菌putidagydF4y2BaG12木糖(262毫克升2%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在另一项研究中,每股收益在优化条件下的最大生产chromium-resistantgydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba是记录为863毫克LgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(gydF4y2BaKılıc Donmez, 2008gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
培养基中碳源的选择是至关重要的,可以糖或non-sugar取决于应变。糖浪费糖浆可以用作EPS生产廉价碳源。应变BGI-2增长迅速,产量高EPS中补充了糖蜜作为碳源。生产成本仍然是一个主要障碍为大规模生产的许多有前途的支付系统。每股收益的主要营养物质生产所使用的碳源(主要是糖类)使过程昂贵。因此重要的是要优化发酵条件和更便宜的碳基质代替营养。糖蜜,制糖工业废料,不仅富含糖类,还包含其他必需品矿物质可以帮助细菌生长和EPS生产。使用糖蜜作为EPS的廉价碳基质生产之前已经报道(gydF4y2BaKucukaşik et al ., 2011gydF4y2Ba)。应变BGI-2也能够使用甘油作为碳源。粗甘油生成生物柴油行业是浪费,可以使用廉价的大规模生产EPS的碳来源。gydF4y2Ba
EPS从极端微生物是一个压力分子被认为帮助微生物处理极端的温度,盐度,干燥(gydF4y2BaTamaru et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2BaBemal Anil, 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaCasillo et al ., 2017gydF4y2Ba)。因此,BGI-2的生存能力与一系列的冻融循环与其他两个细菌。,包括non-EPS产生细菌gydF4y2Ba红球菌属gydF4y2Basp, BGI-11从相同的环境和嗜中温分离gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的。生存能力的EPS产生BGI-2显著高于BGI-11和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。高生存能力的EPS产生BGI-2 non-EPS菌株相比显示每股收益的作用而造成的损害,保护细胞免受严寒和冻融的事件。gydF4y2BaKrembs et al。(2002)gydF4y2Ba发现高浓度盐水exopolymeric物质的北极海冰的渠道。他们建议exopolymeric物质可能产生的活性细菌和硅藻cryoprotection非常低的温度和高盐度环境。gydF4y2BaCasillo et al。(2017)gydF4y2Ba展示了EPS的低温细菌防冷冻的作用gydF4y2BaColwellia psychrerythraeagydF4y2Ba34 h。gydF4y2BaTamaru et al。(2005)gydF4y2Ba研究细胞外多糖的作用在干燥陆地藻青菌和冻结公差gydF4y2Ba念珠藻属公社。gydF4y2Ba他们证明了EPS耗尽细胞敏感干燥和冷冻解冻处理相比,每股收益时完好无损。同样的,gydF4y2BaAslam et al。(2012)gydF4y2Ba提出EPS生产作为一个战略生存在寒冷的极地硅藻的海冰和盐水环境。gydF4y2Ba
EPS的生存能力的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的一系列冻融循环后在cryoprotection隐含其作用。的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba取决于所使用的浓度的EPS和冻融循环的数量受到的压力。的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bak12的应变提高每股收益的浓度从1增加到5% (w / v)。生存能力是严重影响治疗,没有增加每股收益,没有可行性四个冻融循环后观察。这明显是一个冻融循环是损害细胞和细菌寄居在冷环境中进行温度波动必须采取一些策略来应对温度的变化。BGI-2隔绝的环境中经历大的温度波动和冰冻的夜晚和温度可以高达10°C在白天导致反复冻融的事件。系统被认为在这种情况下作为冷冻保护剂。EPS证明高防冷冻的活动基于嗜中温的生存能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba压力。生存能力在5% EPS与20%甘油是一种常见的冷冻保护剂用于细菌低温贮藏。增加每股收益显著提高了公差gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba反复冻融循环,表明一个万能防冷冻的角色。这些结果符合先前的研究也证明了细菌系统(防冷冻的角色gydF4y2Ba马克思et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba腐肉et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaDubey Jeevaratnam, 2015gydF4y2Ba)。此外,我们做了进一步的测试链接EPS膜稳定性的作用。红血球细胞溶解试验显示显著减少(∼50%)在表面活性剂溶血所致,当细胞预处理的每股收益。这进一步验证了脂质过氧化抑制试验,显著减少在观察脂质过氧化作用gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba脂质是每股收益处理。的脂质含量gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba没有显示每股收益显著损害细胞脂质,揭示EPS作为细胞脂质保护剂的作用。活性物质导致氧化损伤细胞脂质导致细胞死亡。我们所知,这是第一个研究微生物每股收益被用于改进减少溶血对膜表面溶解剂(洗涤剂)。然而,抑制脂质过氧化反应使用每股收益从微生物的起源已经报道之前(gydF4y2Ba郭et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2011gydF4y2Ba)。每股收益从它们脂质氧化的抑制作用是非常关键的低温氧化应激增加(gydF4y2Ba将et al ., 2011gydF4y2Ba)。这可能是一个原因BGI-2成功殖民冰川冰。gydF4y2Ba
目前核磁共振数据和辅助信息不能满足一个明确的分析EPS的结构细节。这部分是由于缺乏有意义的交叉峰gydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba13gydF4y2BaBGI-2 C HMBC核磁共振光谱(杂环的多重键关联;数据未显示),杜绝inter-residue联系的定义。弱HMBC交叉峰部分可能会导致快速横向NMR弛豫这可能表明存在相当大的EPS分子。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba13gydF4y2BaC HSQC-TOCSY(数据未显示)和标准2 dgydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba1gydF4y2BaH TOCSY和2 dgydF4y2Ba1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba1gydF4y2BaH NOESY (gydF4y2Ba补充数据S2gydF4y2Ba,gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)和选择性1 dgydF4y2Ba1gydF4y2BaH NMR实验(核奥佛好塞效应谱)是不确定的(gydF4y2Ba补充图S4gydF4y2Ba)。然而,缺乏主要乙酰基(δgydF4y2BaHgydF4y2Ba∼2 ppm,会出现如单线态共振)和其他相关的脂质核磁共振共振(gydF4y2BaTurska-Szewczuk et al ., 2014gydF4y2Ba从核磁共振)提出了积分比率异头和各自的脂肪族核磁共振共振;HSQC交叉峰与半乳糖和葡萄糖衍生品(协议gydF4y2BaLandersjo et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaSeviour et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba要et al ., 2013gydF4y2Ba)。鼠李糖不会主要EPS分子的一部分,因为明显的甲基核磁共振共振(δgydF4y2BaHgydF4y2Ba∼1.3 ppm;gydF4y2BaCasillo et al ., 2015gydF4y2Ba)是在所有EPS样品几乎没有。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
假单胞菌gydF4y2Basp。BGI-2是一种很有前途的应变能在广泛的温度和生长博士BGI-2可以用作生产菌株的生产冷冻膜稳定每股收益。冷冻保存的菌株产生高收益每股收益在低温和可以使用糖蜜或甘油作为大规模生产廉价的碳来源。低温贮藏的细胞和组织是一个重要的工具在生物技术和医学,和进一步的研究可以为EPS-BGI-2作为一个有效的冷冻保存剂。低温微生物提供许多beenefits嗜中温同行通过节能如生产低温基本代谢物,否定要求昂贵的加热步骤,快速和容易失活的酶heat-labile。在低温工作也最大限度地减少不良化学反应和污染通常发生在更高的温度。微生物系统,天然聚合物,由于其生物降解性和无毒性,被认为是环保与当前使用的顽固的化学防冷冻的化合物。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
为本研究可以在生成的数据集16 s rRNA加入MH681214数量。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
NH和MG的NMR分析EPS样本包括数据解释。WS的高效液相色谱法分析了EPS样本包括数据分析。和跳频是参与的设计研究,包括抽样的冰样品细菌隔离。FC监督整个项目,并帮助写的手稿。爸爸做了实验工作,数据分析,和手稿写。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
我们感激地承认高等教育国际研究支持计划项目——巴基斯坦提供奖学金(IRSIP - HEC)进行本研究在海洋和环境研究所的技术(IMET)巴尔的摩,马里兰大学环境科学中心(联电),美国马里兰州。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.03096/full补充材料gydF4y2Ba
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关键字gydF4y2Ba细菌胞外多糖:psychrotrophs喀喇昆仑,冰川,低温贮藏gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba阿里P,沙AA,哈桑F, Hertkorn N, Gonsior M,陈萨贾德W和F(2020)冰川细菌胞外多糖产生高收益的冷冻保存。gydF4y2Ba前面。Microbiol。gydF4y2Ba10:3096。doi: 10.3389 / fmicb.2019.03096gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2019年4月23日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2019年12月20日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2020年2月11日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
安德烈亚斯•泰斯科gydF4y2Ba北卡罗莱纳大学教堂山分校,美国gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2020阿里,沙,哈桑,Hertkorn Gonsior萨贾德,陈。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba陈冯,gydF4y2Bachenf@umces.edugydF4y2Ba