在秋粘虫的维氏腺中的基因表达表明了它们在蜕皮和免疫方面的作用

1介绍

弗氏腺(1)是表皮真皮细胞的衍生品(2)．它们成对出现，分别位于每节的背侧、每条腿的腹侧和肛前肢(3.)．弗氏腺包含三种细胞，一种是分泌细胞，一种是囊状细胞，一种是导管细胞(4，5)．分泌细胞占据了弗氏腺的大部分体积。它在幼虫和蛹蜕皮时产生特定片段的蛋白质(6)．维氏腺的大小与幼虫蜕皮周期有关;它们会长到蜕皮，每次蜕皮后又缩小。它们在蛹前阶段达到最大尺寸(增加50倍)(7)并在幼虫蛹蜕皮后进行细胞程序性死亡。蛹期特异蛋白的合成和弗氏腺的生长受幼体激素和蜕皮激素(8)．佛氏腺的生长与换毛周期密切相关，表明佛氏腺分泌物有助于换毛液(9)．组织化学研究显示，酸性硫酸粘多糖胶结层是由弗氏腺分泌的(4，10)．维氏腺的液体含量具有酚氧化酶活性(7)．这种活性也在蜕皮液中发现，有助于角质层晒黑和免疫。在这些腺体中发现了免疫蛋白，证实了它们的抗菌功能(11)．进一步的研究表明，维氏腺将这些免疫蛋白分泌到血淋巴中(12)．形态学、组织化学、发育和蛋白质组学研究表明，Verson腺体参与脱毛和抗菌防御。然而，弗森腺的确切功能仍不清楚。

在我们之前的研究中(13)，是转基因动物Spodoptera frugiperda(秋粘虫，FAW)菌株表达绿色荧光蛋白(GFP)和系统性RNA干扰缺陷蛋白1 (SID1)秀丽隐杆线虫分别在hr5-IE1和IE1启动子的控制下建立(以下简称FAW-SID1)，以提高RNA干扰(RNAi)效率。IE1启动子在大多数昆虫的所有发育阶段驱动强大且无处不在的表达(14，15)．出乎意料的是，我们发现Verson腺体中的GFP荧光明显高于其他组织。此外，与其他组织相比，Verson腺体的RNAi效率提高更多。独特的GFP荧光使Verson腺体更容易被观察和解剖，高效的RNAi反应使基因敲除研究成为可能。进行RNA-seq分析，以确定Verson腺体中高表达的基因。通过对高表达基因的功能分析，我们证实了先前关于Verson腺体在脱毛和免疫应答中的功能的报道。

2材料与方法

2.1转基因FAW的建立和昆虫饲养

如前所述，建立了FAW-SID1转基因株系(13)．昆虫维持在27±1°C, 60±10% RH。幼虫用从Southland Product Inc. (Arkansas, USA)购买的人工饲料饲养。成年鼠被喂食10%的蔗糖溶液。

2.2成像

使用尼康SMZ745立体显微镜(日本尼康)进行图像拍摄。使用Olympus IX71倒置显微镜(Olympus Life Science, Japan)对装在载玻片上的组织进行成像。

2.3 RNA-seq分析

从FAW-SID1的三个不同发育阶段(L6末龄幼虫、前蛹和蛹)解剖Verson腺体，并使用Trizol(分子研究中心公司，辛辛那提，OH)分离总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)测定分离RNA的数量和纯度。RNA-seq是在北京基因组研究所完成的。检测RNA样品质量，利用BGISEQ-500 NGS平台制备文库并进行测序。这些序列在CLC Genomic Workbench (Version 9.5.9, Qiagen Bioinformatics, Valencia, CA)中组装和分析。原始RNA-seq数据与FAW基因组(16)，设有映射选项;失配代价为2，插入代价为3，删除代价为3，长度分数为0.8，相似分数为0.8。通过计算转录本百万分率(TPM)来确定表达水平。为寻找Verson腺体中表达水平高于其他组织的基因，利用L6末龄幼虫FAW脂肪体、中肠和表皮组织的序列数据(17)。将3个不同发育阶段(L6末龄幼虫、蛹前和蛹)的维氏腺样品分组为重复，分别与脂肪体、中肠和表皮样品进行比较。选择与FDR调整p值(padj) < 0.01的其他组织相比，Verson腺体中上调的基因进行进一步分析。利用eggNOG-mapper对识别的基因进行基因本体识别(18)．在R中的clusterprofiler包中使用“enricher”函数进行基因本体富集分析。对于KEGG通路富集分析，使用相同的包，具有“enrichment KEGG”功能。对FAW基因进行blast搜索黑腹果蝇数据库和d .腹直系同源物作为输入进行KEGG通路富集分析。对所选基因进行TPM，利用Morpheus生成热图(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)．维恩图使用BioVenn (https://www.biovenn.nl/index.php)．RNA-seq原始数据存放在GEO存储库，GEO登录号为GSE220983。

2.4 dsRNA注入

使用M-MLV逆转录酶(Invitrogen™)从FAW-SID1 Verson腺体中分离的总RNA合成cDNA。500ng总RNA与dNTP、随机引物和低聚引物混合，体积为13µl。在65°C下孵育5 min，加入5X buffer、DTT、逆转录酶使其总体积为20µl。混合物在37°C下孵育1小时，然后在70°C下孵育15分钟，使酶失活。引物(表S1)被设计用来扩增目标基因片段。在50µl反应中进行PCR扩增，每个引物含有5µM, 25µl 2x Taq master mix (NEB)和2µl cDNA。PCR条件为95°C持续3 min, 95°C持续30s, 57°C持续30s, 68°C持续1 min，循环35次，最后在68°C持续5 min延长一步。PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。以纯化的PCR产物为模板，使用Megascript T7 RNA合成试剂盒(Life Technologies, Carlsbad, CA)合成dsRNAs。利用该方法合成了靶向荧光素酶(Luc)、GFP、凋亡抑制剂(IAP)、肌动蛋白(actin)和空泡型atp酶(VATPase)的dsRNA。注射前，将FAW-SID1幼虫置于冰上固定10分钟。每只幼虫腹壁外侧注射2µl含4µg/µl的dsRNA。注射时，使用装有玻璃毛细管针的吸入管组件。为了制作玻璃毛细管针，3.5“玻璃毛细管由一个拉针器(型号P-1000，萨特仪器，诺瓦托，加州)。dsRNA注射后，将幼虫放置在冰上20分钟，以防止幼虫移动导致注射液泄漏。 Injected larvae were maintained in individual cups containing artificial diet.

2.5统计分析

为了比较两组(对照组和治疗组)之间的均值，使用了双尾t检验。为验证重复的正态分布，使用Statistics Kingdom网站(https://www.statskingdom.com/shapiro-wilk-test-calculator.html)．采用f检验，p值为0.05，以确定各处理间方差相等。在Excel Version 2211 (Microsoft)中进行t检验和f检验。

3的结果

3.1 GFP荧光显示弗氏腺

转基因FAW-SID1在Verson腺体中显示出较高的GFP荧光信号，即使从外部透过幼虫和蛹的角质层也能看到(图1一个)．弗氏腺在不同发育阶段的观察(图1 b)显示，Verson的腺体在饲养期间增大，换毛后减小。随着幼虫发育，弗氏腺的大小逐渐增大，在幼虫期结束时达到最大(图1 c)．佛氏腺的大小变化主要由分泌细胞决定，分泌细胞占据了佛氏腺的大部分体积。然而，囊细胞的大小变化(由白色箭头所示)图1 c)也很明显，特别是在L5和L6。在喂食阶段，在强光下不容易看到弗氏腺，但在换毛前，弗氏腺变成淡黄色时就可以看到，尤其是L5和L6 (图1 d)．弗氏腺经过程序性细胞死亡，在化蛹后24小时消失(图1C、D)．

3.2维氏腺中高表达脱毛液、抗菌肽、角质层蛋白等基因

为了确定弗氏腺的生理功能，我们使用RNA-seq鉴定了弗氏腺中高表达的基因。从3个不同阶段(L6末龄幼虫、蛹前和蛹)Verson腺体中分离的RNA进行了测序。进行差异基因表达分析，比较Verson腺体与中肠、表皮和脂肪体的基因表达(图2一个)．在Verson腺体中鉴定出2514个deg，与中肠、表皮和脂肪体中的表达量相比，它们的表达量更高(图2 b；表S2)．已鉴定的DEGs的丰富基因本体术语包括蛋白质翻译、折叠和修饰(图2 c)．丰富的KEGG通路术语包括几种代谢生物合成通路和Hippo信号通路(图2 d)．已鉴定的DEGs包括在蜕皮液中发现的蛋白质编码基因(19) (图3一)、抗微生物肽(图3 b)和角质层蛋白(图3 c)．与中肠、表皮和脂肪体中的表达相比，Verson腺体中有52个表达下调(图S1A而且表S3)．丰富的基因本体术语中，下调的DEGs包括脂肪酸代谢过程(图印地)．丰富的KEGG途径术语包括脂肪酸降解(图就是S1C)．

3.3血淋巴蛋白编码基因在弗氏腺中高表达

以往报告(11，12)显示弗氏腺分泌蛋白质进入血淋巴。我们检查了一汽弗森的腺体是否确实有助于血淋巴蛋白。我们首先使用了在家蚕中发现的血淋巴蛋白列表，家蚕（20.)以识别FAW同源物。鉴定出六百零七个编码血淋巴蛋白的基因(表S4)．有趣的是，有144个基因(24%)在Verson腺体中被鉴定为高表达(图S2A；表S5)．丰富的基因本体论术语编码的144个基因的血淋巴蛋白高表达在弗氏腺，包括囊泡和几丁质代谢过程(图开通)．丰富的KEGG通路术语包括碳代谢和ecm受体相互作用(图S2C)．

3.4 RNAi抑制Verson腺生长

在我们之前的研究中，我们观察到FAW-SID1菌株Verson 's腺的RNAi效率得到了极大的提高(13)．我们敲除了一些必要的基因，包括IAP、肌动蛋白和vatp酶(21- - - - - -23)．这些基因的抑制显著影响了Verson腺体的大小(图S3)，特别是构成腺体大部分体积的分泌细胞(图4)．虽然Verson腺体的生长和存活受到显著影响，但经dsrna处理的幼虫发育成蛹和成虫(图S4)．与dsLuc和dsGFP对照组相比，处理后的幼虫也没有明显的死亡率(图S5)．dsGFP在FAW实验中常用作对照，不影响幼虫发育和存活(13，23- - - - - -25)．因此，实验中观察到的基础死亡率可能是由于注射损伤造成的。

4讨论

蜕皮液有助于旧角质层中的角质层蛋白质和几丁质(26)，并保护有柔软角质层的昆虫免受微生物侵害(19)．佛氏腺被认为有助于蜕皮液的分泌(4，6，27)．事实上，包括几丁质酶、肽酶和酚氧化酶在内的脱壳流体蛋白质的编码基因在弗氏腺中高度表达(图3；表S6)．在脱壳液蛋白质的93个编码FAW直系同源基因中鉴定出b .森（表S7)，有19个基因(20%)在弗氏腺高度表达(图3一；表S6)．换毛液被认为是由表皮腺体和真皮腺体共同产生的(19，26)，所以Verson的腺体可能不是一汽蜕皮液的唯一来源。需要进一步的研究来验证弗氏腺和其他蜕皮液分泌源之间的分泌蜕皮液的蛋白质含量是否不同。

在蜕皮过程中，旧的角质层脱落，露出新形成的柔软角质层。这种刚脱壳的昆虫面临感染风险，在蜕皮期间对昆虫管理这种风险是很重要的。对家蚕换壳液的蛋白质组学分析显示，所鉴定的总分泌蛋白中有9%为免疫相关蛋白(28)，这表明在换毛过程中有相当大的保护投资。的确，蜕皮液来自b .森抑制细菌生长在体外（19)．据报道，弗森氏腺也具有免疫功能。Nardi等人在Verson 's腺体中发现了与免疫反应相关的新蛋白质(11)．我们鉴定了几种抗菌肽，包括gallerimycin和诱导型金属蛋白酶抑制剂蛋白，这些蛋白在FAW的Verson 's腺中高度表达(图3 b；表S6)．河马信号通路在Verson腺体中富集(图2 d)．Hippo信号通路受Toll信号通路控制，调控抗菌肽表达(29)．27个编码角质层蛋白的基因在弗氏腺中高度表达。表皮蛋白基因通常在表皮表达(30.)．不同发育阶段的维氏腺角质层蛋白编码基因的表达是否具有特定功能或与表皮蛋白编码基因的表达冗余，尚需进一步研究。然而，看起来很清楚的是，维氏腺有助于角质层蛋白质的产生。

昆虫表皮腺的分泌物利用导管细胞穿过外角质层，到达细胞外空间(31)．弗氏腺由分泌细胞、囊状细胞和导管细胞三种细胞组成。有一条通道连接导管细胞和球囊细胞。然而，在导管细胞和分泌细胞之间没有连接通道的证据。（11)．超微结构分析表明，蜕皮过程中，分泌细胞内的空泡内陷在基底层，并将物质排出到血淋巴中(12)．这些观察表明，弗氏腺的分泌细胞直接将蛋白质分泌到血淋巴中。事实上，我们确定了144个在Verson腺体中高度表达的血淋巴蛋白基因(图S2A)．这些蛋白质似乎在多种代谢途径中起作用，包括几丁质分解代谢(图开通)．脂肪体是产生血淋巴蛋白的主要来源(32)．我们的研究和先前的报道表明，弗氏腺可能也是血淋巴蛋白的重要来源之一，特别是在蜕皮期间。我们观察到囊状细胞与分泌细胞相似，在喂食期间也会生长，而在蜕皮后体积会减小(图1 c)．囊细胞中产生的蛋白质可通过与导管细胞相连的通道将其排出角质层外。综上所述，从弗氏腺产生的大分子可以分别从囊细胞和分泌细胞分泌到血淋巴外和内。这一假设需要进一步的研究来证实。

我们注射了靶向细胞生存所需的管家基因的dsRNA，并观察到Verson腺体中的细胞大小显著减小(图4)．我们还观察到处理后的幼虫Verson腺体中的GFP荧光略有下降(图4，S3)．很可能是家政基因的敲除影响了细胞活力，并影响了包括GFP蛋白在内的整体蛋白质生产。然而，这种处理不影响幼虫的整体发育(图S4)，并没有导致显著的死亡率(图S5)．这一结果与我们之前的报告一致，在对照组和dsIAP治疗中，近80%的注射FAW-SID1成功化蛹(13)．在我们之前的研究中，注射dsGFP只降低了FAW-SID1幼虫Verson腺体中的GFP荧光水平，而在其他组织中没有。dsGFP注射液可使Verson腺体中GFP基因表达下调93.3%。在马氏小管和睾丸中有中度但显著的下调，但在其他组织(表皮、脂肪体、中肠、卵巢和唾液腺)中未观察到下调(13)．虽然我们在本研究中没有测量靶基因(IAP, Actin, VATPase)在不同组织中的敲除水平，但很可能我们的治疗主要影响Verson的腺体，而不是像我们在之前的研究中观察到的其他组织。这些结果提示Verson腺体可能不是蛹蜕皮所必需的。虽然dsRNA治疗显著损害了Verson腺体的生长，但仍有可能存在一些蛋白质分泌。另一种可能性是，没有弗氏腺的幼虫只有在受到致病微生物的挑战时才会受到影响。在不同生理环境下，维氏腺对幼虫发育的影响有待进一步研究。

本研究报告了FAW不同发育阶段Verson腺的形态特征，并对其进行了转录组分析。我们鉴定了Verson腺体中的高表达基因，以验证之前对Verson腺体生理学的观察。我们的研究结果表明，Verson腺体可能有助于角质层蛋白的产生，脱毛液，血淋巴蛋白的产生和免疫反应。本研究为进一步研究鳞翅目昆虫维氏腺的生理意义提供了有价值的工具。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和登录号可以在article/中找到补充材料．

作者的贡献

JK和SP设计研究;JK和XC进行研究;JK和SP分析数据;JK和SP共同撰写了这篇论文。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了农业和食品研究计划竞争性资助号2019-67013-29351和美国农业部国家食品和农业研究所HATCH 2353057000的支持。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

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参考文献