IgGFc-binding蛋白质和MUC2粘蛋白由结肠球形细胞空间非共价相互作用,调节伤口愈合gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

胃肠道的消化和吸收营养物质基本功能和生存的关键。增加这个任务的复杂性,肠道是开放的外部环境,需要不断的脱离有毒物质和有害微生物粘膜上皮细胞单层的。覆盖在小肠上皮细胞由球形MUC2粘液分泌细胞,其中包含各种mucus-associated蛋白质(地图),抗菌肽和主机微生物群提供主机的分离,因此至关重要的保护和先天免疫。MUC2粘液接口是至关重要的维持宿主健康和体内平衡,不仅为上皮细胞提供一个保护盾,也作为一种食物来源和衬底土著微生物群(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。恰当,黏液层的破坏往往是与传染性结肠炎有关,炎性肠道疾病和代谢疾病(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

MUC2先生是一个大型复杂的糖蛋白(> 10 (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)与碳水化合物分子量的贡献高达80%。MUC2打包并存储在粘蛋白颗粒球形细胞释放之前为结肠2层:一个内部密度分层无菌层附着于上皮细胞和外部疏松层,微生物群(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。MUC2肽核心是在粘蛋白的粗面内质网合成单体迅速形成二聚体后N-linked糖基化。O-linked添加糖和唾液酸二聚体后转移到高尔基体。几个寡糖链连接在非还结束了第一个糖残基的肽骨干GalNAc通过gydF4y2BaOgydF4y2Ba糖苷键丝氨酸和苏氨酸残基(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。除了聚糖,MUC2脱辅基蛋白是由两个粘蛋白域组成的。每个域包含可变数目串联重复序列区(VNTR)和不规则的重复(IR)地区由脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸残基(PTS)成为高度糖(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。与蛋白质核心严重O-glycosylated, N和c端区域主要由cysteine-rich域和N-linked聚糖被称为血管性血友病D域。cysteine-rich地区是允许的关键分子间二硫桥MUC2单体之间形成,形成二聚体,随后,MUC2聚合物抗胰蛋白酶和其他消化酶和给MUC2粘蛋白网络稳定性及其粘弹性属性(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。最近,人们越来越清楚的认识到杯状细胞也产生各种各样的其他蛋白质,存在于黏液层,但其功能尚不清楚。这些地图包括calcium-activated氯通道调节器1 (CLCA1)激肽释放酶1 (KLK1),发酵菌粒16 (ZG16),前梯度2 (AGR2), FgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba片段的免疫球蛋白结合蛋白(FCGBP) (gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。这些蛋白质,FCGBP特别感兴趣的是由于其类似结构MUC2 (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),但它在结肠粘液中的作用和功能仍然是难以捉摸的。FCGBP据报道大约300 kDa MUC2和类似,它包含多个血管性血友病因子和mucin-like重复(CGLCGN) (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。MUC2包含Gly-Asp-Pro-His (GDPH)氨基酸序列的血管性血友病域内的糖基autocatalytically裂解(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。最近的研究已经确定了,人类FCGBP GDPH序列在13个血管性血友病的11个领域,进行催化裂解,类似于MUC2 (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。裂解序列通过二硫键(分泌和稳定gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。此外,它有33个潜在的N -但没有O-linked糖基化的网站。丰富的N-glycosylation网站FCGBP表明它可能与MUC2 N-linked聚糖形成共价或非共价债券,增强黏液层。然而,目前还不清楚如果FCGBP与生化反应MUC2或功能作用在细胞或黏液层。gydF4y2Ba

结肠粘液生物学的主要知识差距是地图是否杯状细胞分泌的蛋白质变成无害地混杂在一起与分泌粘液或是否与MUC2相关结构。目前还不清楚如果地图存在和打包在MUC2粘蛋白颗粒。基于这一缺陷和强烈的相似性FCGBP MUC2黏液,我们假设FCGBP扮演不可或缺的一部分和MUC2粘蛋白来维持结肠黏液凝胶的结构完整性。这里我们通过生物化学和蛋白质组学分析揭示FCGBP和MUC2协调biosynthesized,非共价结合,打包在MUC2粘蛋白颗粒,并分泌在一起形成黏液层的结构组件的一部分。在伤口愈合化验和结肠炎动物模型,细胞质FCGBP决不能MUC2发挥了内生作用在伤口愈合维持上皮屏障功能。gydF4y2Ba

2材料和方法gydF4y2Ba

2.1伦理语句和动物gydF4y2Ba

在所有的实验中,10到12个月大的C57BL / 6gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的小鼠(相同数量的男性和女性)。野生型老鼠从查尔斯河实验室购买国际(St-Constant,魁北克,加拿大)gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}老鼠从Velcich博士是内部生成同窝出生仔畜饲养的gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / -gydF4y2Ba}繁殖期和backcrossed C57BL / 6背景。无菌(GF)在C57BL / 6小鼠背景是购买国际微生物卡尔加里大学的中心。老鼠在消毒,filter-top笼子和维护标准食物和水gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba在specific-pathogen-free (SPF)条件。健康科学的动物保健委员会卡尔加里大学的研究动物护理和治疗协议(ac18 - 0218)和批准和认证申请人提出的实验程序使用的动物护理和治疗是按照最新的政策中概述的原则”指导的护理和使用实验动物”的加拿大委员会动物保健。gydF4y2Ba

2.2人类球形细胞gydF4y2Ba

人类结肠癌细胞株LS174T保持在鹰的最低基本培养基(EMEM)补充heat-inactivated 10%胎牛血清,10毫米玫瑰,10毫米青霉素和链霉素(完成EMEM)。细胞被维护在一个湿润孵化器有限公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。媒体改变了每2至3天,细胞通过一周一次,当细胞汇合的。蛋白质提取、LS174T细胞被镀上6-well板(2.5 x 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ 3毫升EMEM完成。)RNA提取,LS174T细胞被镀上12-well板(1.5 x 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ 2毫升的完整的EMEM)。10μM PMA是添加到井2小时诱导MUC2表达表示。衣霉素(5μg /毫升)被添加到井12小时中断gydF4y2BaN -gydF4y2Ba糖基化表示。gydF4y2Ba

2.3定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

从细胞RNA提取使用ωBio-Tek E.Z.N.A.总RNA设备,按照制造商的指示。RNA从组织中均质Ribozol RNA提取试剂提取(VWR),然后按照制造商的指示。DSS-treated组织,DSS被如前所述(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。短暂,RNA是孵化2 M氯化锂在冰上了2小时,其次是离心在14 000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。上层清液被删除和丢弃,RNA的颗粒溶解于200年μL RNase-free水。净化过程再次重复。颗粒状RNA是200年resuspendedμL RNase-free水和沉淀在-20°C的30分钟3 M醋酸钠和100%乙醇。一旦RNA被隔离,RNA产生使用NanoDrop1000分光光度计测量。500 ng的RNA是反向转录使用qScript cDNA SuperMix (QuantaBio)。qPCR使用引物进行以下引物和退火温度:人类MUC2 (F: CAGCACCGATTGCTGAGTTG R: GCTGGTCATCTCAATGGCAG, 56°),人类FCGBP (F: GGACCTCAAGAACACTGGCA R: GAGGATGGAGACTGAAGCGG 60°),人类GAPDH (F: TGATGACATCAAGAAGGTGGT-GAAG R: TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT 60°),人类MATH1 (F: TGCACTTCTCGAC-TTTCGAGGACA R: AACTTGCCTCATCCGAGTCACTGT 63°),人类SPDEF (F: TTGCTA-CTCAAGCCCCACAG R: CCGGATGATGCCCTTCTTGT, 58°),人类ATF4 (F: TGCTGTCT-GCCGGTTTAAGT R: CTGCTGCCTCTAATACGCCA,鼠标MUC2 (F: GAAGCCAGATCCCG-AAACCA R: CCAGCTTGTGGGTGAGGTAG 60°),鼠标FCGBP (F: GACAAAGCCTATCT-CTGCCGT R: CTTGGGTAGCAGACAGGGAA, 58°),鼠标β-Actin (F: TGGGGTGTTGAAGG-TCTC R: CTACAATGACTGCGTGTG, 58°)。鼠标Math1 (F: AAAGGAGGCTGGCAG-CAA R: TGGTTCAGCCCGTGCAT, 58°),鼠标Spdef (F: GACTCACACTCAAGGGGCAA R: TCAG-AAGAGTCGTCCGTCCT, 58°)。反应是在Corbett转子基因3000系统完成。数据分析是使用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法询问褶皱基因表达的变化。gydF4y2Ba

2.4西方的屁股gydF4y2Ba

蛋白质样本取自6-well盘子后不同时期和治疗。溶菌产物提取,用冷洗净PBS,随后细胞溶解与300年μL完成裂解缓冲(1更易与L EDTA, 20更易与L Tris-HCl, 0.1% SDS, 100更易/ L氯化钠,特里同x - 100 0.5%, phenylmethylsulfonyl氟化物,蛋白酶抑制剂鸡尾酒;Sigma-Aldrich)冰30分钟。样本然后在8000 x离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟和颗粒状碎片移除。剩余的蛋白质是由BCA量化分析和调整,以相同浓度的蛋白质,然后resuspended到5 x Laemmli缓冲和煮5分钟。溶菌产物被加载到7.5%,10%,12%,15% SDS聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到硝化纤维膜。转让后,膜被封锁在渐变PBS奶粉5%和0.1%。膜被探测的主要抗体:MUC2(内部纯化抗体中海糖化MUC2粘蛋白(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba圣克鲁兹)或糖基sc - 515106), FCGBP (Cloud-Clone PAP389Hu01),和CLCA1 (Abcam 1808521)。管家标记,鼠标单克隆anti-glyceraldehyde 3 -磷酸脱氢酶(GAPDH) (Calbiochem 6 c5)使用。相应HRP-conjugated二级抗体稀释在PBS奶粉3%和0.1%渐变然后可视化使用ChemiLucent发射极耦合逻辑检测(EMD微孔)和成像Bio-Rad ChemiDoc成像仪。对于非还条件下样品准备,β-Mercaptoethanol和SDS 5 x样本中遗漏了缓冲区。gydF4y2Ba

2.5共焦和超分辨率显微镜gydF4y2Ba

1.5 x10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞被播种在1.5号无菌玻璃盖玻片和24小时让其生长。盖玻片和冰冷的PBS洗两次,然后用4%多聚甲醛固定15分钟在37°C,然后再洗两次与PBS。特里同细胞然后用PBS permeabilized包含0.35%在室温下5分钟。与PBST洗涤三次后(PBS渐变为0.1%),盖玻片被封锁对PBST驴血清5%,1小时洗两次,一夜之间孵化与主要抗体MUC2 (sc - 515106,圣克鲁斯)或FCGBP (PAP389Hu01 Cloud-Clone)湿润在4°C室。第二天,盖玻片洗了三次PBST和孵化1小时用荧光二次抗体和DAPI(技术)。细胞迁移和增殖研究复染色与桩蛋白(05 - 417,微孔)和整合EdU量化按照制造商的指示(C10637,热Fisher),分别。盖玻片是安装FluorSave (Calbriochem)和使用尼康成像A1R共焦激光扫描显微镜或尼康Ti Eclipse宽视野显微镜。、成像使用相同的协议;然而,成像进行了使用一个Aberrior STEDYCON显微镜相连的尼康Ti Eclipse宽视野显微镜。量化和图像分析是在斐济(ImageJ)来确定蛋白质进行强度和colocalization。gydF4y2Ba

2.6粘蛋白颗粒的制备gydF4y2Ba

粘蛋白颗粒是由支流烧瓶LS174T细胞。细胞用PBS、收集和在300 x g离心5分钟。由此产生的颗粒在MES resuspended同质化缓冲区(250毫米蔗糖,MES 25毫米,0.1毫米MgSO4, EGTA 2毫米,0.1毫米PMSF)和均质Dounce均质器。匀浆然后离心机在300 xg 5分钟和上层清液收集re-centrifuged 300 xg 10分钟。当时清理上层清液离心机在2100 x g 15分钟。由此产生的颗粒被洗3次与PBS和原油粘蛋白颗粒不及时治疗或治疗octyl-glucoside家伙1%或1%。进一步纯化,粗颗粒resuspended成2毫升消息灵通的缓冲区(20毫米玫瑰,137毫米氯化钠),小心地放在一个蔗糖梯度(2毫升每个2 M蔗糖的分数,1.5蔗糖,1 M蔗糖,和0.5蔗糖)和超离心机000 xg过夜。离心后,1毫升分数被孤立,在PBS洗了三次,准备进行分析。gydF4y2Ba

2.7猎枪蛋白质组学分析gydF4y2Ba

WT和gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2BaLS174T球形细胞用于猎枪蛋白质组学分析。蛋白质样本细胞溶解1% SDS, 0.1 EDTA在200 nM消息灵通的pH值(8),和蛋白酶抑制剂平板电脑(罗氏)。蛋白质变性的最终浓度的10毫米德勤。样品被烷基化孵化15毫米的最终浓度碘乙酰胺在黑暗中在室温下了25分钟的pH值6.5。接下来,将α-肽和ϵ-amines样本孵化18 h与isotopically重37°C(40毫米13 cd2o + 20毫米NaBH3CN(钠cyanoborohydride)]或光标签(40毫米光甲醛(CH2O) + 20毫米NaBH3CN]。这些都是最终的浓度。样品受到C18色谱法在液相色谱和串联质谱(质/ MS)。gydF4y2Ba

2.8质谱gydF4y2Ba

所有女士实验是由阿尔伯塔省南部质谱(SAMS)卡尔加里大学的核心设施,加拿大如前所述(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。分析在一个Orbitrap融合lumo Tribrid女士(热科学)与Xcalibur(版本4.0.21.10)和耦合热系统。胰蛋白酶的肽(2μg)被加载到一个使用C18陷阱(75μm x 2厘米;赞誉PepMap 100, P / N 164946;ThermoScientific) 2μl /分钟的流量的溶剂(0.1%甲酸和3%乙腈质年级水)。肽筛选了使用120分钟梯度从5到40%(5 - 28%在105分钟增加到40% B在15分钟)溶剂B(0.1%甲酸质成绩80%乙腈)0.3μL /分钟的流量和分离C18分析柱(75μm x 50厘米;PepMapRSLC C18;P / N ES803;热科学)。肽被电喷射使用2.3 kV电压进入离子传输管(300°C) Orbitrap lumo在积极的运营模式。 The Orbitrap first performed a full MS scan at a resolution of 120,000 FWHM to detect precursor ions with an m/z between 375 and 1575 and a +2 to +7 charge. The Orbitrap AGC (Auto Gain Control) and the maximum injection time were set at 4 x 105 and 50 ms, respectively. The Orbitrap was operated using the top speed mode with a 3 s cycle time for precursor selection. The most intense precursor ions presenting a peptidic isotopic profile and having an intensity threshold of at least 5000 were isolated using the quadrupole and fragmented with HCD (30% collision energy) in the ion routing multipole. The fragment ions (MS2) were analyzed in the ion trap at a rapid scan rate. The AGC and the maximum injection time were set at 1 x 104 and 35 ms, respectively, for the ion trap. Dynamic exclusion was enabled for 45 s to avoid the acquisition of the same precursor ion with a similar m/z (plus or minus 10 ppm).

2.9蛋白质组学和生物信息学分析的数据gydF4y2Ba

光谱数据匹配肽序列在人类使用吉祥物UniProt蛋白质数据库(gydF4y2Bawww.matrixscience.comgydF4y2Ba)。裂解位点特异性被设定胰蛋白酶/ P为蛋白质组学数据,允许两个错过了分裂。蛋白质鉴定后,产生的点击提交Metascape (gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)生物信息学分析生成基因本体途径分析和转录因子分析。在蛋白质相互作用研究中,字符串v11 (gydF4y2Bahttps://string-db.orggydF4y2Ba)使用软件(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.10制备原生LS174T黏蛋白gydF4y2Ba

粘蛋白制剂从LS174T收集分泌物(如前所述)(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。短暂,媒体LS174T细胞透析,冻干,resuspended列缓冲区,并将其应用于琼脂糖4 b列(50 2.5厘米;Bio-Rad实验室),平衡与列缓冲在4°C。列被使用已知的标准校准:蓝色葡聚糖(2000 kDA),甲状腺球蛋白(669 kDA),牛血清白蛋白(67 kDA),和Chymotrysinogen (kDA 25日)。4毫升分数收集和阅读DU800分光光度计(贝克曼库尔特)。适当的样本集合和透析在4°C对去离子水一夜之间,冻干,resuspended 100µL水。蛋白质浓度决心通过BCA试验前准备样品为西方墨点法。gydF4y2Ba

2.11瀑样成长和培养gydF4y2Ba

如前所述来自结肠瀑样gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。短暂,冒号被切除,隐窝使用温和的细胞消化分离缓冲(干细胞技术)和大约100隐窝是嵌入GFR-matrigel (BD)穹顶。每两天瀑样喂养与先进的DMEM补充L-WRN(写明ATCC crl - 3276)以及N2, B27, GlutaMax, SB202190,烟酰胺,n -乙酰半胱氨酸常A83-01, mEGF。Colonoids与TrypeLE通道每7 - 10天。实验,colonoids种植在完成媒体7天,然后再辅以L-WRN-conditioned媒体只包含N2, B27,烟酰胺,Glutamax 3天。五µM榫眼是管理实验媒体24小时之前收获实验使用colonoids倾斜杯状细胞表型。gydF4y2Ba

2.12 Luminex生长因子的分析gydF4y2Ba

生产和测量WT和MUC2 KO LS174T细胞生长因子的评估使用Luminex多元分析(夏娃技术,卡尔加里,AB,加拿大)。伤口细胞中生成使用2-well硅胶插入定义500µm差距(IBIDI),游离在48小时后,文化将被移除,上层清液收集在第0天测量。新媒体被添加和删除天2和4。上层清液离心机在10 000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟前去除细胞碎片的分析。gydF4y2Ba

2.13抗生素治疗gydF4y2Ba

动物服用抗生素鸡尾酒如前所述减少细菌负荷(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。每12小时短暂,老鼠强饲法与抗生素鸡尾酒。第一3天,鸡尾酒包含两性霉素b(1毫克/公斤)。开始4天,包含的鸡尾酒万古霉素(50毫克/公斤),新霉素(100毫克/公斤),甲硝哒唑(100毫克/公斤),和两性霉素b(1毫克/公斤)在接下来的14天。另外,氨苄青霉素(1毫克/毫升)添加到饮用水和消耗gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba。动物使用抗生素治疗后2天才能从体循环被清除。gydF4y2Ba

2.14感应的结肠炎gydF4y2Ba

化学结肠炎引起的(如前所述)(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)使用DSS (MW: 36000 - 50000;MP生化药剂,圣安娜,CA)溶解在自来水。的gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}动物收到3.5% 5天,虽然gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}老鼠收到3天跟进1%水随意。老鼠重日报和牺牲了4天,8、12、15 post-DSS。gydF4y2Ba

2.15统计分析gydF4y2Ba

所有的实验都重复独立至少3次。所有统计分析是使用GraphPad棱镜8。两个或两个以上的团体之间的统计学意义与双向方差分析分析,而学生的学习任务是用于比较两组。意义是假定在P < 0.05。误差线描绘平均值±标准偏差(SD)。gydF4y2Ba

3的结果gydF4y2Ba

3.1 MUC2和FCGBP表达协调调控在球形细胞gydF4y2Ba

尽管FCGBP被称为mucus-associated蛋白质,如果没有到目前为止的研究的报道gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba和gydF4y2BaMUC2gydF4y2BamRNA表达协调调控或如果在结肠粘液分泌的蛋白质结构上,在回应粘液促分泌素。为了解决这个可能性,我们量化的时间表达gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna在WT (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)和CRISPR / Cas9gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2BaLS174T球形细胞(gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba在文化()gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。迟滞期后从2到6天,gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna表达WT细胞明显在7号和8号天达到高峰,分别为(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。相比之下,gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna表达gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞显示无显著的变化表达天2和9之间。来确定gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2BamRNA表达相关蛋白的生产,西方的屁股是每2天透露FCGBP和糖化MUC2 (g MUC2)蛋白表达与峰值WT细胞暂时增加表达在第七天与mRNA表达一致(gydF4y2Ba图1 a, BgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。在gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞,FCGBP蛋白表达同样增加暂时与峰值表达式在7天(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。来确定gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba基因表达是诱导类似gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),细胞被刺激MUC2促分泌素,佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。令人惊讶的是,PMA显著调节两者的表达gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna和蛋白质产量在WT球形细胞,而gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna表达和蛋白质持平gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba图1 c, DgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。这些结果说明MUC2和FCGBP相互关联在WT球形细胞和分泌在一起,应对粘液促分泌素。这是形成鲜明对比观察gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞。确定基底WT和表达的蛋白质gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞,全球蛋白质组是由定量量化猎枪蛋白质组学分析(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。WT细胞新陈代谢活跃,最丰富的蛋白质,是调节MUC2粘蛋白和热休克蛋白beta 1,而在gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞,FCGBP和UDP-glucuronosyltransferases高度调节(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。阐明见解的功能蛋白质组,基因本体富集分析表明,WT细胞调节与温度相关的基因刺激,生物合成的过程中,蛋白质的稳定性和翻译gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞钙粘蛋白稳定的高度调节通路(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。WT细胞也显示增加生物过程与对刺激的反应和代谢过程(gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba),其中可能包括对粘液促分泌素的反应如PMA和高要求的生产和分泌代谢过程MUC2粘蛋白。用免疫荧光共焦显微镜显示~ 45% WT球形细胞FCGBP与~ 80% MUC2与粘蛋白与蛋白大量出现在顶端细胞表面膜(gydF4y2Ba图2 a, BgydF4y2Ba)。令人惊讶的是,另一个池WT FCGBP蛋白质的扩散在整个细胞质与MUC2无关(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba左上角中间面板)。符合蛋白质组数据显示高FCGBP蛋白表达gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba),FCGBP表达明显高于(~ 40%)和广泛地分布在细胞质中gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba相比WT细胞(gydF4y2Ba图2 c, DgydF4y2Ba右上角中间面板)。这些结果说明FCGBP和MUC2黏液协调调控在WT球形细胞,表明存在MUC2 FCGBP的表达和分泌的影响。此外,一个免费的细胞质FCGBP池与MUC2粘蛋白表明FCGBP可能有不同的功能在细胞内。gydF4y2Ba

3.2 Muc2和Fcgb表达gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的gydF4y2Ba

验证如果人类球形细胞培养显示类似Fcgbp和MUC2的表达谱gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,结肠瀑样被产生gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的。优化杯状细胞谱系,colonoids预处理与榫眼,切口抑制剂增加球形细胞的数量(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。的gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}与榫眼colonoids分化有显著提高gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba信使rna和蛋白质表达而不是gydF4y2BaFcgbpgydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 a, BgydF4y2Ba)。的gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}colonoids榫眼处理出现了轻微的但不显著增加gydF4y2BaFcgbpgydF4y2BamRNA表达这些老鼠以来保持球形细胞没有Muc2的存在(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图3 a, BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

确定是否有区域差异在基底Muc2的表达和Fcgbp近端和远端结肠的老鼠,组织分离和分析mRNA和蛋白表达。我们先前已经表明,成熟的杯状细胞的数量是最高的近端结肠(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。按照,gydF4y2BaMuc2gydF4y2BamRNA水平显著增加的近端而不是远端结肠gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}然而,gydF4y2BaFcgbpgydF4y2Ba在mRNA水平相似gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。可以预见的是,糖化Muc2蛋白高表达在近端和远端结肠gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}同窝出生的(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。虽然Fcgbp蛋白表达在两个基因型的近端结肠高,远端结肠的缺席gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。蛋白质组学分析,近端/结肠组织透露,Fcgbp中期和Clca1非常丰富gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba},而Muc2和Fcgbp丰富gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}同窝出生的(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba突出显示)。这些观察表明,Muc2和Fcgbp协调调控在结肠的长度相关联的近端结肠中表达最高的高杯状细胞的数量比远端结肠。gydF4y2Ba

如众所周知的肠道微生物群影响杯状细胞谱系和Muc2粘蛋白生产和函数(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),我们量化Muc2的表达和Fcgbp specific-pathogen-free (SPF)动物和那些未经处理或给予广谱抗生素(Abx)减少微生物群的多样性和丰富(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)以及无菌小鼠(GF)。SPF小鼠接受Abx显示显著下降gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba信使rna表达和更大的减少gydF4y2BaFcgbpgydF4y2Ba(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba)。GF老鼠非常低的基底gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba而gydF4y2BaFcgbpgydF4y2BamRNA表达低高,显示Muc2蛋白表达在Abx-treated GF老鼠老鼠和更低的水平。Fcgbp蛋白表达也减少Abx-treated SPF小鼠GF老鼠而基底水平高(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba)。Fcgbp不是女朋友下降的老鼠,我们假设鉴于黏液层明显更薄和更少的女朋友老鼠中定义(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。抗生素治疗减少Fcgbp SPF小鼠,我们不能排除这样一种可能性,即抗生素本身可能会影响Fcgbp的表达。gydF4y2Ba

3.3 FCGBP MUC2内局部粘蛋白颗粒gydF4y2Ba

MUC2和FCGBP高度与在培养球形细胞(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba),这可能表明,蛋白质是biosynthesized粘蛋白颗粒和打包在一起。确定这些蛋白质互相紧密地绑定到或粘蛋白颗粒内是在空间上分开,我们分离和纯化MUC2黏液颗粒。为此,指数期球形细胞(天5 - 6)均质,和一系列的差速离心后,粘蛋白颗粒富集分离使用蔗糖梯度(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。FCGBP净化颗粒丰富,糖化MUC2分区分数9,密度1.16 ~ - 1.19 g / ml蔗糖,这表明蛋白质都是本地化。通过电子显微镜,净化粘蛋白颗粒是截然不同的和不规则的形状,异构直径大小(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),包含一个脂双分子层(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。清除脂质双分子层的弱洗涤剂,皮套裤,octyl-glucoside出人意料地增加FCGBP和MUC2免疫反应性(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba),清楚地表明这些蛋白质都是本地化和粘蛋白颗粒内屏蔽。然而,主要问题仍然:FCGBP和MUC2相互作用通过glycan-glycan生化反应和/或粘蛋白颗粒内蛋白质间交互作用?最近的研究表明,FCGBP不是MUC2分泌粘液(共价结合gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。跨链二硫债券涉及多个高度保守的cysteine-rich蛋白质域通常是N -但不是O-glycosylated (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba通过交互),我们假设FCGBP N-linked glycan-glycan互动MUC2 c端跨链债券。因此,确认的重要性N-linked聚糖MUC2和FCGBP球形细胞治疗N-linked糖基化抑制剂衣霉素(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)表明载脂蛋白的迁移模式的转变在琼脂糖和sds - page凝胶积累显著降低总糖化MUC2粘蛋白(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。确定如果FCGBP和MUC2互相分离在杯状细胞粘蛋白颗粒膜(如gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba在WT细胞),细胞基底和与衣霉素孵化后的成像。正如预测的那样,FCGBP和MUC2明显彼此分离后用衣霉素治疗和蛋白质分散在细胞质中,没有明显的杯状细胞外壁比未经处理的控制(gydF4y2Ba补充图2 a, BgydF4y2Ba)。整个细胞衣霉素处理过的细胞溶解产物显示变化FCGBP(琼脂糖凝胶)和MUC2琼脂糖和sds - page丙烯酰胺凝胶(gydF4y2Ba补充图2 cgydF4y2Ba)。这些结果说明FCGBP和MUC2粘蛋白颗粒可能通过N-linked聚糖一起互动(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)和杯状细胞的分离膜和分散细胞细胞质(gydF4y2Ba补充图2一个gydF4y2Ba)。然而,我们不能排除这种可能性,N-linked聚糖也需要适当的细胞内划分/ FCGBP和MUC2的排序。gydF4y2Ba

基于免疫印迹数据显示,颗粒丰富FCGBP和MUC2粘蛋白(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba),显微镜用于可视化的colocalization蛋白质。使用宽视野显微镜,MUC2 ~ 97%的颗粒是阳性(红色)和FCGBP(绿色)使用使antibody-tagged蛋白(gydF4y2Ba图4 e, FgydF4y2Ba)。粘蛋白颗粒很小(0.5 - 2µm) (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),宽视野显微镜的分辨率是不足以辨别antibody-tagged蛋白质的空间结构。为了解决这个问题,我们使用受激发射损耗(发生的)超分辨率显微可视化和图像高分辨率的蛋白质颗粒约30 - 50海里(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)对共焦显微镜的分辨率。、显微镜显示,MUC2(红色)和FCGBP(绿色)蛋白质颗粒随机分布,是异构的,并不是所有的颗粒有相同的本地化的蛋白质(gydF4y2Ba图4 g, HgydF4y2Ba)。然而,在大多数颗粒,MUC2和FCGBP蛋白质相互空间与(分别为53%和58%;gydF4y2Ba图4我gydF4y2Ba)。这些结果表明,MUC2和FCGBP异构亚种群的高度与粘蛋白颗粒。gydF4y2Ba

3.4粘蛋白颗粒的定量蛋白质组学分析gydF4y2Ba

获得洞察功能FCGBP和MUC2和其他公认的颗粒之间的相互作用蛋白,纯化粘蛋白颗粒减少和非还条件下通过sds - page电泳,和全球不同分子量的蛋白质组分数解决使用定量的蛋白质组分析(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。减少和非还条件被用来最大化的定位地图,可以通过二硫键和MUC2互动。相关感兴趣的蛋白MUC2粘蛋白、地图和蛋白质参与粘液胞外分泌被发现在所有4在减少和非还凝胶分数(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。可以预见的是,MUC2丰富分数1和2(叠加凝胶;SG)在减少和非还凝胶,但也发现在其他2分数解决凝胶。AGR2在MUC2装配过程中发挥作用,折叠,贩卖,位于整个非还条件下凝胶。同样,网罗蛋白质,STXB1 STX3, SNP23与MUC2粘蛋白胞外分泌(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),位于整个凝胶。重要的是,FCGBP分数1 - 3在减少的条件下存在,并在非还条件下分数1和2。丰富FCGBP和MUC2的分数越高1和2(叠加凝胶)条件下非还表明,这些蛋白质之间的相互作用很容易中断通过减少代理。重要的是,所有的地图,只有FCGBP和AGR2被蛋白质组学分析中确定净化颗粒。这些发现强调了大量FCGBP / MUC2打包在粘蛋白颗粒。gydF4y2Ba

获得洞察粘蛋白颗粒的功能蛋白质组,从减少数据(gydF4y2Ba图5 c、GgydF4y2Ba)和非还(gydF4y2Ba补充图3 a, DgydF4y2Ba)分析了凝胶通路和基因本体浓缩和蛋白质网络使用荟萃分析(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)(metascape.org)。所有4分数显示浓缩蛋白参与了极高的新陈代谢活动,如脂质代谢,细胞对压力的反应,葡萄糖代谢和vesicle-mediated运输(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。更具体地说,这些蛋白与代谢和细胞过程以及有关生物学过程相关免疫系统流程和信号(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)。基因本体论通路数据表明,粘蛋白颗粒蛋白是复杂的,包括蛋白质相关的一系列流程和功能与高代谢活动有关。除了基因本体通路分析,MUC2的转录因子,SP1 (gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),高度与粘蛋白颗粒蛋白(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba)。蛋白质的分布分析了维恩图解显示重叠的蛋白质之间的4分数(gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba这是一致的荟萃分析结果显示浓缩蛋白在所有4分数参与代谢和细胞过程和转录因子。重要的是,MUC2出现在所有4分数减少和非还条件下,而FCGBP出现在分数1 - 3在减少,在非还凝胶分数1 - 2。gydF4y2Ba

阐明功能之间的交互MUC2 FCGBP和其他地图,我们使用STRING-db v11分析数据库(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)(gydF4y2Bahttps://string-db.orggydF4y2Ba)。引人注目的是,只有FCGBP显示多个交互与其他地图包括CLCA1 ZG16, TFF3。最长、CLCA1 ZG16, KLK1没有相互作用(gydF4y2Ba补充图3 dgydF4y2Ba)。其他蛋白质相互作用被识别包括转录因子NPAS4、粘附分子(PCDH17和CDHR5)和C1QC complement-associated蛋白(gydF4y2Ba图5克gydF4y2Ba)。MUC2蛋白相互作用主要是与MUC12 MUC4, MUC16, MUC7, MUC1和MUC17 (gydF4y2Ba图5克gydF4y2Ba)。此外,大量的多肽N-acetyl-galactosaminyltransferases (GALNT14, GALNT4 GALNT2, GALNT7)已知与粘蛋白糖基化识别(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。重要的是,没有地图除了字符串分析FCGBP和MUC2的互动。感兴趣的其他蛋白质鉴定的蛋白质组学数据(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)包括CDHR5,一个重要的肠道微绒毛和肠上皮细胞间粘附分子(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)。此外,多个N-acetylgalactosaminyltransferases被确定(GALNT1、GALNT2 GALNT3, GALNT4, GALNT5, GALNT6, GALNT7, GALNT10, GALNT12, GALNT13和B3GALNT2)。这个家庭的糖基转移酶是重要的黏蛋白,如MUC2 O-glycosylation (gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。N-Acetylglucosaminyltransferases也发现包括MGAT1、MGAT2 MGT4A, MGT5A。这群acetyl-glucosaminyltransferases与细胞器全身N-linked聚糖(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。特别感兴趣的是蛋白质,之前已经被确认在分泌粘液从老鼠和人类研究和决心通过蛋白质组学分析(Muc2密切相关gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。事实上,一些蛋白被发现在整个胃肠道分泌粘液粘蛋白颗粒被确定(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba),包括ERP29 TAGL2 S100a6、PIGR RNH, PSMD2, ELAVL1, CTSD,宽带,FAM3D, GPA33 LGALS3, LGALS3BP。而没有实用意义归结为这些蛋白质在粘蛋白颗粒或分泌粘液,这是观察感兴趣的蛋白质颗粒内的重叠和MUC2分泌粘液。综上所述,蛋白质组学数据突出粘蛋白颗粒的复杂性质,证明内容包含大量蛋白质与MUC2粘液分泌有关。gydF4y2Ba

3.5 FCGBP共价结合MUC2分泌粘液gydF4y2Ba

MUC2和FCGBP显示大量表达,包装,和局部粘蛋白颗粒,我们下一个调查这些蛋白质的交互方式和分区分泌本机聚合物黏液凝胶。以确定FCGBP和MUC2互相共价连接到(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),分泌粘液从LS174T花文化媒体本地条件下纯化(Tris-HCL缓冲区,pH值8.0)使用琼脂糖4 b (S4B)柱层析法(如前所述)(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。高分子量MUC2粘蛋白筛选了空隙体积(VgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba分数29-36)而其他non-mucin蛋白质筛选了不同分子量分数指定的F1, F2, F3(的颜色)。蛋白质,形象化S4B蛋白质分数由sds - page分离(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)减少(左面板,4%堆垛解决凝胶凝胶(SG)和12% (RG)]和非还[右面板,4%堆垛解决凝胶凝胶(SG)和7.5% (RG)]条件表明,大多数FCGBP和MUC2互相绑定(红色框区域)。在非还条件下,与MUC2 FCGBP在场叠加凝胶(SG;右面板上方的红色箭头),和减少的条件下,FCGBP分为几个蛋白质分数与两个主要的乐队在70和26 KDa(左面板)。在还原条件下,大多数的70 KDa FCGBP释放MUC2和在场所有分数,但丰富的低分子量F2分数(分数70 - 77)。在非还条件下,大多数FCGBP和MUC2叠加在一起在座凝胶暗示这些蛋白质之间的二硫键的作用分泌粘液。然而,STRING-db分析显示FCGBP和MUC2之间没有蛋白质-蛋白质之间的关系。相反,FCGBP显示直接互动与其他地图包括CLCA1 (gydF4y2Ba图5克gydF4y2Ba点画圆),事实上,墨迹探测与FCGBP V CLCA1显示它的存在gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba在减少和非还条件下(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba第三小组)。阐明如果MUC2和FCGBP共价结合,VgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba从S4B MUC2粘蛋白纯化使用氯化铯密度梯度超速离心法(中海)共价和非共价结合蛋白(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。中海密度梯度的量化分数(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)透露,FCGBP分区只在低密度分数4 (1.31 g / mL) 26 KDa蛋白质而MUC2在场的高密度分数7 - 9 (1.48 - -1.58 g / mL),堆垛凝胶(SG,gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)。这些发现表明FCGBP和MUC2共价结合在分泌粘液,与先前的猜测(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。基于这一独特交互,FCGBP-MUC2绑定可能是由不同的pH值和减少肠道内稳定代理类似情况发生在急性/慢性炎症的感染和炎症性肠病(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

量化MUC2和FCGBP如何在相互粘蛋白颗粒分区和合并从LS174T细胞分泌结构上形成粘液链,发生免疫荧光显微镜是用来跟踪颗粒内容(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。细胞主动分泌粘液是探测与使抗体MUC2(红色)和FCGBP(绿色)和DAPI荧光染色(蓝色)。从羽新分泌的粘液链(细胞核染色细胞表面附近的蓝色)的尾巴都清晰可见,显示FCGBP和MUC2的空间分布(gydF4y2Ba图7 a, BgydF4y2Ba)。地区,粘液链显示FCGBP (gydF4y2Ba图7gydF4y2Bamid-body绿色)是主要的,而MUC2(红色)最高的细胞数量较低的结FCGBP (gydF4y2Ba图7 a, CgydF4y2Ba)。在尾部区域,颗粒蛋白失去结构颗粒聚结形成红色的粘液链。FCGBP的命运和MUC2老粘液链(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)失去了组织,包含丰富的MUC2骨料和FCGBP松散附着在细胞或被掐掉胞体(如图所示)。这些数据表明FCGBP和MUC2黏液分泌在一起,发挥关键作用的空间组织粘液链。gydF4y2Ba

3.6功能MUC2的角色绑定到FCGBP和上皮细胞质FCGBP归还gydF4y2Ba

MUC2和FCGBP都打包在分泌粘蛋白颗粒,并在一起形成黏液层,它是确定感兴趣的这些蛋白质相互作用在受伤的细胞和赔偿。要做到这一点,WTgydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba球形细胞被镀成2-well硅胶插入定义50μm差距游离。在细胞成为支流(2天),插入删除,细胞可以迁移到关闭伤口差距(白色箭头)开放。引人注目的是,他第二天在伤口完全愈合了gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba但是直到天6治愈WT细胞(gydF4y2Ba图8 a, BgydF4y2Ba)。可视化的分区MUC2和/或FCGBP返还期间,细胞生长没有插入作为基底控制和删除插入后,细胞方面使用共焦显微镜成像在天1,3,5。基底,MUC2和FCGBP在WT与细胞,而FCGBP是广泛地出现在细胞质中gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba,量化gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。意外,一旦受伤,MUC2和FCGBP都高度极化WT伤口边缘的细胞和前沿的细胞,直到伤口关闭一天6。相比之下,FCGBP MUC2的束缚gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞不分区的前缘伤口,表明细胞质FCGBP可能发挥作用在归还没有MUC2的2天内愈合。的证据的表达式gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna在归还WT细胞明显减少,而gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba信使rna表达仍然很高,一成不变的gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。在这两种细胞类型,应激反应基因gydF4y2BaATF4gydF4y2Ba受伤的细胞,但回到控制水平显著降低伤口只有在关闭gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba天5 - 7细胞(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。伤口愈合是介导主要由转录因子分泌细胞谱系的细胞迁移gydF4y2BaMATH1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSPDEFgydF4y2Ba明显下调后伤口(gydF4y2Ba补充图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

获得机械的见解的原因gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞在2天内愈合,分泌生长因子被多路复用评估分析表明相当高的表皮生长因子(EGF)水平gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba,但不是在WT细胞;其他生长因子(HGF和PLGF)并不在伤口愈合中发挥作用(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)。专门确定改变利率的差异所导致的赔偿是细胞迁移、增殖,或者两者兼有,伤口关闭量化使用共焦显微镜在受伤的细胞的日子1,2,3。细胞迁移是量化为焦点粘连蛋白染色桩蛋白(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)和扩散是衡量5-ethynyl-2 -deoxyuridin (gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)(EdU)合并。正如预测的那样,有一个显著增加桩蛋白和EdU公司2天内明显的第三天在伤口关闭gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba相比WT细胞(gydF4y2Ba图9 b, CgydF4y2Ba)。细胞迁移和增殖的关键细胞过程所需的伤口闭合和治疗(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。WT细胞,FCGBP绑定在伤口边缘与MUC2大大减少EGF生长因子分泌,细胞迁移和增殖强烈表明,cytoplasmic-free FCGBPgydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba在伤口愈合细胞发挥了重要的作用。gydF4y2Ba

评估如果我们人类LS174T球形细胞中观察到的现象是真实的更复杂和相关疾病,MUC2的表达/ FCGBP决心从人类活检样本健康控制和活跃的患者在缓解期溃疡性结肠炎(UC)和加州大学(UC-R)。在活跃的UC患者,gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba分别显著调节25倍和三倍(gydF4y2Ba补充图4 cgydF4y2Ba),并在UC患者在缓解期(UC-R),gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba表达式是类似于健康对照组。这些发现表明,gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFCGBPgydF4y2Ba是高度管制在活动性疾病和赔偿。综上所述,这些数据表明,MUC2和FCGBP协调改变在上皮受伤/赔偿和MUC2的缺席,细胞质FCGBP加速伤口愈合。gydF4y2Ba

3.7 Fcgbp表达式在DSS结肠炎小鼠迅速改变gydF4y2Ba

以确定Muc2和Fcgbp协调调控在加州大学的动物模型,gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}和gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生了DSS诱导的饮用水结肠炎和近端结肠组织收集rt - pcr和免疫印迹分析从天0到15 post-DSS如前所述(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba)。为了一致性,我们使用相同的批处理和剂量的DSS我们之前的研究(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。减肥作为一项指标与分数相关的疾病活动的粪便一致性、便血、和整体动物出现在两个基因型。组织学检查组织损伤与增厚肌肉层,地下室建筑的损失,在结肠的长度和细胞浸润,大部分伤害远侧地发生。在这两种基因型,结肠炎与最大减肥从天4 - 8(急性疾病)返回之前白天逐渐基底体重17(愈合病变)post-DSS (gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba)。在gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}同窝出生的,gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba表达显著下降早在第四天post-DSS(感应阶段)和基底以下水平15天(gydF4y2Ba图10 bgydF4y2Ba正如先前所显示的(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba)。形成鲜明对比,gydF4y2BaFcgbpgydF4y2Ba信使rna表达显著增加到了第四天,高架post-DSS 15天(gydF4y2Ba图10 bgydF4y2Ba)。在gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的,即使gydF4y2BaFcgbpgydF4y2BamRNA表达显著下降早在4天post-DSS和保持低15天,结肠蛋白质稳步下降,在天12 - 15 post-DSS察觉。Fcgbp蛋白表达gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}早在第四天post-DSS察觉,但白天回到基础水平15 post-DSS在返还(gydF4y2Ba数字10 c, DgydF4y2Ba)。确定影响的杯状细胞谱系Muc2的表达和Fcgbp急性疾病和返还,我们量化的表达分泌细胞谱系gydF4y2BaMath1gydF4y2Ba早在第四天,显著下调和保持在低位一天15 post-DSS (gydF4y2Ba图10 egydF4y2Ba)。作为Math1影响到所有分泌的血统,我们分析gydF4y2BaSpdefgydF4y2Ba表达,转录因子的关键终端杯状细胞分化和观察稳步增加gydF4y2BaSpdefgydF4y2Ba表达在归还尤其是在12和15天。DSS可以影响微生物群丰度的变化(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和微生物群可以影响Muc2和Fcgbp mRNA和蛋白表达(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba伤口愈合的关键),这些发现并不与培养LS174T细胞中观察到。尽管如此,这些结果表明,恢复FcgbpgydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}同窝出生15天可能扮演了一个被忽视的角色在粘膜愈合。gydF4y2Ba

4讨论gydF4y2Ba

黏液层至关重要的宿主防御多种病原体和毒素,它遇到在胃肠道。近年来这种认识已增加MUC2黏液层的核心作用在维持和滋养土著微生物群肠道内稳态和健康所必需的。嵌入在分泌粘液地图目前还不清楚他们是如何交互的生化和MUC2表达和增强粘液保护屏障功能。在这项研究中,我们为特征的分子间相互作用和功能作用一个地图,FCGBP,因为它是一个大型和MUC2和高度糖基化的分子结构相似。这里我们发现利用基因和蛋白质表达研究和生化分析FCGBP和MUC2协调biosynthesized,非共价结合,包装和MUC2黏液颗粒,分泌黏液层的结构部件。重要的是,利用蛋白质组学,STRING-db v11分析,和西方的印迹,我们发现FCGBP,再加上CLCA1,与MUC2粘蛋白。生化研究表明,MUC2和FCGBP共价结合,在一起通过N-linked聚糖分泌粘液。用共焦显微镜显示两个池FCGBP;一池绑定到MUC2粘蛋白颗粒和细胞质中的另一个游泳池是免费的在培养球形细胞。在受伤的WT球形细胞,MUC2 / FCGBP蛋白质在伤口边缘高度极化和发挥了合作作用在伤口愈合慢6天。 In marked contrast, in wounded CRISPR-Cas9 gene-editedMUC2 KOgydF4y2Ba细胞,细胞质FCGBP广泛分布,受伤的细胞在2天内痊愈。这是与高水平的相关生长因子EGF。归还从DSS结肠炎WT老鼠与Fcgbp表达增加有关。据我们所知,这是第一个报告,把功能合作角色FCGBP和MUC2黏液粘膜保护和赔偿。gydF4y2Ba

MUC2粘蛋白分泌基底条件下持续明显调节黏液促分泌素和炎性因子通过刺激释放(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。本构粘液分泌确保有一个基础功能黏液层在整个消化道,而刺激释放引起高输出粘液分泌,以应对病原体和有毒物质限制接触底层的粘膜上皮细胞。观察FCGBP和MUC2 mRNA和蛋白表达适度调节基底和诱导的黏液促分泌素PMA表明FCGBP黏液层的一个组成部分。PMA已被广泛证明移植MUC2表达通过PKC途径(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba通过与转录等因素的互动gydF4y2BaSP1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba)。事实上,MUC2和FCGBP分享转录因子等gydF4y2BaSP1gydF4y2Ba,以及其他转录因子等gydF4y2BaCREB1gydF4y2Ba,gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba,gydF4y2BaATF2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba),提供额外的证据co-regulation和MUC2的表达和FCGBP。有趣的是,在LS174T球形细胞,与FCGBP存储MUC2黏液与原子核周围的鞘。然而,只有大约50%的FCGBP与MUC2和其余的扩散和分布在整个细胞。这表明,有可能是二次函数FCGBP无关的球形内粘液细胞。我们的研究结果表明,胞质FCGBP可能发挥作用,加速伤口愈合gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba球形细胞。在老鼠身上,Fcgbp强烈中的与近端结肠Muc2包含最多的球形细胞比远端部分(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。一个意想不到的发现是,Abx-treated SPF小鼠显示显著降低表达Fcgbp的,然而,在女朋友老鼠,表达Fcgbp高。Abx SPF小鼠治疗是减少Muc2的表达,可能产生负面影响的表达Fcgbp (gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。当女朋友老鼠了Muc2 mRNA表达和一层黏液层(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),这些发现表明,减少Muc2 Fcgbp特异表达表达,类似于我们观察到在gene-editedgydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba在LS174T细胞。gydF4y2Ba

即使粘蛋白颗粒在结肠粘液的唯一来源,它是合理的假设其他杯状细胞分泌蛋白不存在粘蛋白颗粒聚合存在分泌粘液。了解粘蛋白的生物学方面的一项重大突破粒蛋白质和它们的交互是通过、显微镜图像粘蛋白颗粒蛋白的能力。尽管小颗粒的大小(平均约1µm (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),、成像决定性地证明FCGBP MUC2黏液颗粒中重要组成部分。这些发现支持我们的研究结果,MUC2和FCGBP biosynthesized和包装在一起,粘蛋白颗粒和存储在球形细胞为后续版本。新分泌的粘液、成像数据链的球形细胞表明虽然FCGBP和MUC2高度丰富的分泌后,他们不同的分区并迅速失去once-tight colocalization。看来MUC2和FCGBP隔离特定区域内的粘液链并迅速失去colocalization聚合。我们不知道如果这是由于FCGBP退化或丧失免疫反应性聚合。在老股粘液,MUC2和FCGBP发现总量不附加任何明确的结构,保持或过程中被掐掉细胞表面。虽然我们不能把这些发现,发生在结肠,数据显示,MUC2和FCGBP都密切参与黏液凝胶的空间组织。gydF4y2Ba

粘蛋白粒蛋白质组景观揭示了一些有趣的发现与地图有关。使用字符串分析蛋白质相互作用预测,所有其他的地图(CLCA1、ZG16 TFF3)被证明是集群FCGBP,决不能MUC2黏液。这是有趣的,因为它表明的存在和命运分泌粘液的地图与FCGBP高度依赖他们的交互。这个意想不到的发现和MUC2协会,支持地图的FCGBP MUC2屏障功能中发挥着重要作用在中心舞台。粘蛋白粒蛋白质组同时显示,在没有被发现的许多蛋白质分泌粘液的蛋白质组(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba),可以从杯状细胞或蛋白质来自其他粘膜上皮细胞中嵌入的黏液层。鉴于MUC2的重要性和FCGBP形成一个集群与地图,我们感兴趣的是这些蛋白质是如何分区的分泌粘液。使用凝胶过滤层析,本机分泌粘液显示MUC2的存在和FCGBP VgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba和在所有低分子量分数降低的条件下使用免疫印迹(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。这表明,在分泌FCGBP没有紧密地绑定到MUC2或退化。FCGBP仍然绑定到MUC2分离叠加的减少和非还条件下凝胶。在减少情况下,FCGBP MUC2分开作为两个主要的蛋白质乐队70 KDa 26 KDa。存在多个FCGBP乐队在西方墨迹减少的条件下是一致的存在多个autocatalytically裂解产品最近如图所示(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。此外,在减少和非还条件下,CLCA1大量表达,与FCGBP和MUC2有关。使用中海密度梯度超速离心法、FCGBP和MUC2被证明是共价结合在本机MUC2分泌粘液。这就提出了一个有趣的问题,如何FCGBP分泌粘液和MUC2互动?既包含N-linked聚糖分子,我们推测,N-linked glycan-glycan绑定形式跨链债券以稳定蛋白质。支持这一点,N-linked糖基化抑制剂(衣霉素)显示破坏FCGBP和MUC2 colocalization和蛋白质是分散在整个细胞的细胞质中。此外,在琼脂糖和sds - page凝胶,载脂蛋白的迁移模式的转变与总糖化MUC2显著减少。gydF4y2Ba

获得的见解与MUC2 FCGBP及其交互的功能作用,我们跟着蛋白质在伤口愈合的命运。先前的研究显示结构的弱化与损失相关联的粘液屏障FCGBP的蛋白质和MUC2发病前炎症在加州大学(gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba)。到目前为止,没有研究看着MUC2 / FCGBP结肠细胞的蛋白表达在伤口愈合。在受伤的WT球形细胞,MUC2和FCGBP都高度与伤口的边缘与降低损伤和恢复期间mRNA的表达。形成鲜明对比,在受伤gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞,FCGBP高度表达,广泛地分布于整个胞浆细胞和未分化的伤口边缘,在2天内痊愈。这些细胞也分泌高水平的生长因子EGF与细胞迁移和增殖,增加有关支持的蛋白质组数据预测的稳定和扩张粘附adherens结gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2Ba细胞。基于这些发现,人们很容易把细胞质FCGBP在伤口愈合功能的作用。在DSS结肠炎gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}DSS结肠炎急性和恢复性阶段期间,尽管Muc2 mRNA表达很低,Fcgbp mRNA和蛋白表达增加高15天相比gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生和赔偿。在gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba},Fcgbp mRNA表达低于基础水平在急性结肠炎和愈合慢于归还gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{+ / +gydF4y2Ba}同窝出生的。一个合理的解释是,微生物群在密切接触表面上皮细胞在缺乏粘液保护屏障gydF4y2BaMuc2gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}同窝出生的不断驱动colitis-inhibiting Fcgbp表达式(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

之间的交互和功能地图和MUC2的角色并不广为人知,我们研究的结果关注FCGBP几个重要的观察,对先天免疫和宿主防御。我们表明,球形细胞有两个FCGBP池:一池绑定在粘蛋白MUC2颗粒和注定要形成黏液层和另一个池免费在细胞质中,可能有不同的内生函数,也许在伤口愈合。有趣的是,我们发现通过使用生化和蛋白质组分析FCGBP和MUC2协调biosynthesized,非共价结合,打包在MUC2粘蛋白颗粒,并在一起形成分泌黏液层的结构组件的一部分。重要的是,FCGBP显示多个蛋白质-蛋白质之间的关系与其他地图包括CLCA1 ZG16, TFF3,反过来,与通过N-linked MUC2聚糖共价相互作用形成跨链债券。这也许与MUC2的互动使FCGBP不稳定和高度容易退化分泌粘液。FCGBP的消失和MUC2 DSS结肠炎的恢复性阶段表明分子都是严格监管,可能产生持久的影响在组织愈合和上皮屏障功能。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。进一步询问可以针对相应的作者。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物研究回顾和批准的卡尔加里大学的健康科学动物保护委员会,检查动物护理和治疗协议(ac18 - 0218)和实验程序和认证申请人提出批准使用的动物护理和治疗是按照最新的政策中概述的原则”指导的护理和使用实验动物”的加拿大委员会动物保健。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

HG和KC构造的实验设计。HG, KC、调频和广告贡献试剂和系统的支持。HG和调频执行大部分的实验和数据分析。调频导致鼠标DSS结肠炎的研究。HG、广告和KC写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作从加拿大卫生研究院资助的研究(pjt pjt拖把- 142776 - 162284 - 173551)授予KC。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢冰镇Colarusso和露西迅速从活细胞成像设施斯奈德研究所技术支持。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1211336/full补充材料gydF4y2Ba

补充图1 |gydF4y2BaMUC2和FCGBP协调调控蛋白表达gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba量化的颞MUC2和FCGBP LS174T球形细胞蛋白表达的文化。蛋白质是量化每2天。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001 (n = 4 - 8)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化的LS174T杯状细胞分泌的蛋白质在基底条件和黏液促分泌素反应,PMA。* * * * p < 0.0001 (n = 10 - 12)。gydF4y2Ba

补充图2 |gydF4y2Ba治疗LS174T杯状细胞的5μg N-linked糖基化抑制剂衣霉素的能级和MUC2 FCGBP绑定。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba免疫荧光共焦显微镜图像显示MUC2(红色),FCGBP(绿色),和DAPI(蓝色)。图片是代表三种不同的实验。酒吧= 10μm规模。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化的colocalization MUC2和FCGBP之间的共焦显微镜图像。* * * * p < 0.0001 (n = 15)。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba治疗LS174T细胞衣霉素引起的转变MUC2脱辅基蛋白和FCGBP迁移模式1%琼脂糖凝胶或sds - page /免疫印迹。gydF4y2Ba

补充图3 |gydF4y2Ba蛋白质组学分析,净化人类非还条件下从LS174T细胞粘蛋白颗粒。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaMetascape分析显示通路基因本体浓缩非还条件下利用每一个分数。感兴趣的途径以红色突出显示。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaMetascape分析显示基因本体与蛋白质相关的生物过程出现在每一个非还条件下4分数。感兴趣的途径以红色突出显示。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaMetascape分析显示相关转录因子蛋白从每个非还条件下粘蛋白颗粒分数。感兴趣的转录因子以红色突出显示。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba字符串分析显示已知蛋白质交互mucus-associated蛋白质AGR2 CLCA1 ZG16, KLK1。gydF4y2Ba

补充图4 |gydF4y2Ba在归还MUC2和FCGBP球形细胞中表达。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba共焦图像的量化。荧光FCGBP和MUC2的控制(没有伤口)和受伤的细胞在伤口边缘和外部伤口保证金返还期间(点画开放盒装地区)。* * * * p < 0.0001 (n = 6 /天)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba伤口使用文化生成插入方法。post-inoculation在0到7天,gydF4y2BaMATH1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSPDEFgydF4y2Ba,gydF4y2BaATF3gydF4y2Ba信使rna被rt - pcr分析。GAPDH是用作看家基因。* * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001 (n = 6 /天)。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaMUC2 FCGBP mRNA表达健康对照组和加州大学结肠活检样本通过rt - pcr分析。GAPDH是用作看家基因。Ctrl =健康控制;加州大学=活跃的溃疡性结肠炎;UC-R =溃疡性结肠炎缓解每组(n = 5 - 6)。gydF4y2Ba

补充表1 |gydF4y2Ba猎枪从WT和蛋白质组学蛋白质gydF4y2BaMUC2 KOgydF4y2BaLS174T细胞。gydF4y2Ba

补充表2 |gydF4y2Ba猎枪蛋白质蛋白质组学从LS174T杯状细胞减少和非还条件下颗粒。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba