原始研究的文章

前面。Immunol。,08 February 2023
秒。B细胞生物学
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1094871

双重刺激自身抗原和CpG培养精疲力竭的扩散风湿性factor-specific CD21。表征^低B细胞球蛋白血症引起丙型肝炎virus-cured混合

玛蒂娜Del随军牧师^1‡,

雷蒙娜Marrapodi ^1‡,

Ylenia a Minafo^{1 __},

伊娃钢琴Mortari ^2、3,

乔凡娜菊苣^{1 __},

奇亚拉地掷球³,

劳拉Gragnani ⁴,

亚历山德罗Camponeschi ⁵,

普Colantuono ^{1 __},

露西娅Stefanini ¹,

普Basili ¹,

丽塔Carsetti ³,

马西莫Fiorilli ¹,

Milvia Casato ¹和

玛塞拉Visentini ^{1 *}

¹平移和精密医学Sapienza大学罗马,罗马,意大利
²Sapienza大学分子医学部门的罗马,罗马,意大利
³B细胞单位,免疫学研究领域,IRCCS婴孩Gesu儿童医院,佛罗伦萨,意大利
⁴实验和临床医学系,佛罗伦萨,意大利佛罗伦萨大学
⁵风湿病和炎症的研究,医学研究所,萨尔格学院,哥德堡,瑞典的哥德堡大学

作品简介:球蛋白血症引起丙型肝炎病毒(HCV)导致混合驱动克隆扩张(MC)的B细胞表达B细胞受体(bcr),通常由vh1 - 69变量编码基因,同时赋予类风湿因子(RF)和anti-HCV特异性。这些细胞显示非典型CD21low表型和功能就是疲惫睡着BCR和toll样受体9 (TLR9识别)刺激。虽然在MC抗病毒疗法是有效的血管炎,致病性B细胞克隆持续长之后,会引起virus-independent疾病复发。

方法:克隆B细胞从HCV-associated 2型MC患者或健康的捐赠者是刺激与CpG或heath-aggregated免疫球蛋白(如代理免疫复合物)单独或结合;增殖和分化被流式细胞术然后评估。一种蛋白激酶的磷酸化和p65 NF-kB亚基通过流式细胞仪测定。TLR9识别被qPCR量化细胞内流式细胞术,并使用rt - pcr MyD88异型体进行了分析。

讨论:我们发现双重触发自身抗原和CpG恢复疲惫vh1的能力- 69 - pos B细胞增殖。BCR / TLR9识别串音的信号机制仍然是难以捉摸的,自从TLR9识别信使rna和蛋白质以及MyD88信使rna通常表示,CpG-induced磷酸化p65 NF-kB在MC克隆B细胞完整,而BCR-induced p65 NF-kB磷酸化和PI3K / Akt信号受损是完好无损。我们的发现表明自身抗原和CpG微生物或细胞起源可能联合培养持久的致病性射频HCV-cured MC患者的B细胞。BCR / TLR9识别相声可能代表一个更一般的救援机制加强系统性自身免疫疲惫autoreactive CD21low B细胞。

介绍

丙型肝炎病毒(HCV)导致单克隆B细胞淋巴增殖性疾病,包括2型混合冷沉球蛋白血症(MC) (1)和非霍奇金淋巴瘤(2)。在这两种情况下,单克隆B细胞表达限制的刻板印象,或quasi-identical, B细胞抗原受体(bcr)通常由V编码_H1 - 69 / Vκ3-20变量基因(3,4)。这些刻板的bcr都赋予类风湿因子(RF)活性和特异性丙肝病毒。丙肝病毒的特异性是由序列同源性与人类抗体识别病毒的E2包膜蛋白(3,4),尽管抗体的反应性克隆与E2 HCV-associated淋巴瘤或其他丙肝病毒蛋白质尚未证明到目前为止(5)。最有力证据的依赖这些刺激淋巴增殖性疾病治疗的丙肝病毒来源于直接的感染抗病毒药物(DAAs)导致在大多数病人临床改善(6,7)。然而,冷球蛋白仍可检测在大部分HCV-cured患者(6)和复发的血管炎发生在约12%的人(8),即使多年后清除病毒,经常与事件的特点是增加产量的免疫复合物(ICs)如感染或实体肿瘤(9)。

MC患者的致病B细胞显示一个特殊表型的特点是低表达CD21 (CD21。表征表征^低B细胞),典型的表达CD11c归航的数组和抑制表面受体,并通过受损的BCR信号;同时,增生性反应触发BCR和TLR9识别缺陷(10,11)。表型和功能类似CD21。表征^低CD11c^posB细胞积聚在艾滋病毒感染(12在干燥综合征),(13),在普通变量的子集免疫缺陷(CVID) (14),在老老鼠,他们被称为与年龄有关的B细胞(15)。

有趣的是,大部分克隆致病B细胞存在于许多MC患者长时间的血后间隙感染丙肝病毒的抗病毒疗法(16),可能构成HCV-independent复发很大比例的患者中观察到的血管炎(8,9)。致病性克隆B细胞坚持抗病毒治疗后逐渐恢复他们的一些异常特征,包括BCR信号缺陷、细胞凋亡倾向和CD21。表征^低表型,但仍然受损的增殖能力,以应对TLR9识别激活(17)。

尚不清楚RF-specific致病性B细胞克隆如何生存在MC患者没有丙肝病毒引发的,并且它可以推测,这可能取决于自身抗原的刺激。我们以前观察到的同步触发BCR anti-Ig抗体和TLR9识别的CpG导致反应迟钝的克隆B细胞扩散HCV-viremic MC患者(11)。在目前的工作中,我们调查了anti-Ig自身抗原是否可以模拟这种效果。我们的结果表明,co-stimulation CpG和自身抗原,以代理的形式免疫球蛋白ICs,诱发RF-specific克隆B细胞扩散坚持HCV-cured MC患者。这表明,循环ICs和微生物或细胞衍生核酸可能配合支持致病性B细胞的生存没有丙肝病毒。

方法

研究对象

在这项研究中,我们选择13 HCV-associated 2型MC血管炎患者循环B细胞克隆识别了流式细胞仪通过轻链限制和独特的immunophenotype或V的表达式_H1 - 69 -编码bcr G6认可的抗体,如前所述(11,16,17)。除了一个病人的DAA治疗,持续的病毒学反应,和所有但病毒学应答者的血管炎的临床反应评估之前报道的标准(6);一个完整的响应者后来紫癜的瞬态复发。六个患者B细胞克隆识别表情的V_H1 - 69 - bcr编码;这些病人报告的进一步信息补充表1。

细胞和immunophenotyping

外周血单核细胞(PBMCs)是通过密度梯度离心;对于一些实验B细胞被负选择immunomagnetic珠纯化。Immunophenotyping fluorochrome-labeled单克隆抗体的使用组合完成从正生物科学(所有)。的G6单克隆抗体识别的抗原决定基V_H1 - 69 -编码蛋白质,由r . Jefferis友情提供,英国伯明翰。无标号G6和FITC -复染色或PE-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(becton dickinson生物科学)使用老鼠免疫球蛋白作为控制如前所述11,16,17)。流仪分析是在FACSCalibur仪器(becton dickinson生物科学)使用CellQuest (becton dickinson生物科学)和FlowJo(树明星、亚什兰或)软件。

免疫复合物和单体的免疫球蛋白

代理ICs生成,被小林et al。18),heath-aggregation单体的人类免疫球蛋白1小时在10000 x 65°C随后离心g 2分钟去除沉淀。单体的来源的免疫球蛋白g是一个商业治疗使用静脉注射免疫球蛋白(丙种球蛋白)的准备(人类免疫球蛋白静脉注射剂^®巴克斯特,100毫克/毫升)。Heat-aggregated和未经处理的丙种球蛋白被储存在4°C,用于功能化验最后10到20μg /毫升的浓度。

增殖和分化分析

细胞增殖测定了二乙酸carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)稀释测定。PBMC与CFSE标记(表达载体,生活技术),悬浮在RPMI 1640含10%胎牛血清和培养2×10⁵细胞每口井96 - U-bottom板块没有或存在CpG ODN 2006(2.5μg /毫升;在活的有机体内创),F (ab′)₂反搞笑(4μg /毫升;杰克逊Immunoresearch实验室),ICs (heath-aggregated丙种球蛋白,10μg /毫升)或单体的免疫球蛋白(丙种球蛋白,10μg /毫升)。在第五天的文化细胞收获和可行性评估小细胞大小和渗透率的染料会发生细微7-aminoactinomycin D (7-AAD);在一些实验中新鲜细胞co-stained CD20抗体,IgM和V_H1 - 69 (G6抗体)(补充图1)。Nonvital细胞没有超过7%的淋巴细胞与刺激条件没有显著相关性;我们没有发现显著差异在B细胞或B细胞的比例子集之间可行的和不能存活的细胞。初步分析后,细胞被permeabilized (Permeabilizing-Solution-2;正欲生物科学)能够探讨细胞质IgM内容,然后沾CD20抗体,IgM和V_H1 - 69,流式细胞术分析。电子的扩散参数的可行(地区R2补充图1)CD20^posIgM^posB细胞,进一步的为V_H1 - 69^pos和V_H1 - 69^负的,然后评估CFSE荧光稀释使用FlowJo软件(树明星)。参数考虑“分歧”百分比(比例的细胞开始分裂计算不考虑部门的数量),和“扩散指数”(部门总数除以数量的细胞进入分裂),反映了反应细胞的复制能力。

我们也分析了B细胞的分化诱导不同刺激通过评估cytoplasmic-IgM的频率^高CD20^低/否定细胞;这个群体包括CD38^负的preplasmablasts, CD38^posplasmablasts和CD138^pos浆细胞(19),因此,我们将把这些细胞称为IgM^高CD20^低/否定差异化的B细胞。

BCR和TLR9识别信号分析

一种蛋白激酶的磷酸化和p65 NF-κB亚基是衡量使用流式细胞仪,分别,Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^®兔子马伯# 4060贴上Alexa萤石647和兔子IgG-Alexa萤石647控制(细胞信号技术),和anti-NF-kB p65磷酸化在S529 [p65 (pS529)]鼠标马伯贴上Alexa萤石488(正),按照制造商的指示。PBMC (1.5 x10⁶细胞)分裂成两个小瓶,悬浮在100μL RPMI 1640含5%胎牛血清(完全培养基),20分钟和平衡在37°C。同等体积的prewarmed完全培养基,单独(如果控制)或含有CpG的组合(5μg /毫升),F (ab′)₂反搞笑(8μg /毫升),ICs (heath-aggregated丙种球蛋白,20μg /毫升)或单体的免疫球蛋白(未经处理的丙种球蛋白,20μg /毫升)随后补充道,和返回的细胞为20分钟37°C。细胞被固定的200μL prewarmed Phos-Flow解决缓冲区(Phos-Flow系统,正欲生物科学)10分钟37岁^°C,洗两次PhosFlow烫/洗缓冲区,我分成了两瓶,并沾anti-pAkt或anti-p65 (pS529)抗体;样本同时沾CD19马伯,IgM, CD27和V_H根据实验设计1 - 69。pAkt-specific和p65 (pS529)特殊平均荧光强度(MFI)被减去MFI计算值同fluochrome-conjugated兔子或鼠标控制免疫球蛋白,分别同anti-pAkt或反p65 (pS529)抗体。

bcr的分子特征

BCR单克隆评估根据“pcr单克隆Biomed-2协调一致的行动”指南(如前所述)(4)。PCR产品运行在non-denaturing 10%聚丙烯酰胺凝胶和单克隆乐队提取和直接测序ABI棱镜377 - 96仪器(珀金埃尔默,培育城市,CA)。获得的序列被提交给IMGT V-QUEST工具,和信息V-D-J / v - j基因和等位基因提取使用。推导的氨基酸序列IGHV,IGKVNCBI和CDR3上分析了DNA序列的基本局部比对搜索工具(爆炸)成对比较项目(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与RFs序列同源性和anti-HCV E2抗体基因库,如前所述(4);差异进行评估的确切概率法(p≤0.05)被认为是显著的。

量化TLR9识别mRNA和蛋白和MyD88亚型

TLR9识别被qPCR量化和胞内流式细胞术。细胞内TLR9识别蛋白质分析的内容固定/ permeabilized细胞间接染色法标记anti-TLR9鼠标马伯(ab134368 Abcam),或控制老鼠免疫球蛋白,复染色与FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白;样本同时沾CD19马伯,IgM, CD27或其他抗体根据实验设计;TRL9-specific荧光被减去MFI值计算得到控制鼠标可以同anti-TLR9抗体的免疫球蛋白。qPCR,净化(> 95%)B细胞是细胞溶解试剂盒(试剂盒^®RNA提取试剂,应用生物系统),根据制造商的指示。总RNA retro-transcribed互补使用上标™很™互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体)。所有样本一式三份运行15μL反应体积含2 x TaqMan普遍PCR反应混合液(ThermoFisher科学),20 x引物从集成DNA技术(ACTB和TLR9识别),30 ng cDNA和水。qPCR运行7900年Abi棱镜HT快速实时PCR系统(ThermoFisher技术)使用以下放大参数:10分钟在95°C紧随其后40 15秒的周期在95°C,和1分钟60°C。TLR9识别计算使用2的表达水平^-ΔΔCT方法。

相对大量的不同的拼接MyD88亚型,规范化激活长同种型(MyD88_l)和短期抑制同种型(MyD88_年代),分析了以半定量的方式使用rt - pcr琼脂糖凝胶电泳紧随其后使用MyD88-L / S一对引物被德阿拉斯和高山(20.):左TTGTTGGATGCCTGGCAGGGGCGCTCTGGC,右CACGGTCGGACACACACAACTTAAGCCGATAGTC。

统计数据

数据分析使用GraphPad棱镜9软件(La Jolla、钙、美国)。统计差异取决于使用Mann-Whitney U测试未配对的两组,配对t检验,Wilcoxon-Mann-Whitney测试,或非参数弗里德曼测试;p≤0.05的显著性水平被认为是具有统计学意义。

结果

Co-stimulation自身抗原和CpG驱动器TLR9-unresponsive克隆B细胞的增殖和分化MC患者

我们之前报道,在HCV-viremic MC患者克隆V_H1 - 69^pos在回应刺激B细胞扩散不佳TLR9识别CpG或BCR anti-Ig,而同时刺激TLR9识别和BCR导致相当比例的这些细胞进入细胞分裂(11)。在这项研究中,我们调查是否自身抗原,以代理的形式生成的ICs heath-aggregation免疫球蛋白,可以复制这个anti-Ig对V_H1 - 69^posB细胞G6单克隆抗体的鉴定。战略控制V_H1 - 69^pos或V_H1 - 69^负的IgM-expressing B细胞中说明了补充图1和战略分析细胞增殖的CFSE稀释方法的说明图1一个。

图1

图1Co-stimulation与自身抗原(ICs)和CpG驱动器的扩散反应迟钝RF-specific MC患者的B细胞。(一)代表分析电子的扩散的可行的V_H1 - 69^pos和V_H1 - 69^负的B细胞在不同的刺激。的封闭的山峰CFSE荧光定义细胞分裂的次数;% D(/百分比)是细胞分裂开始的数量,和π是扩散指数。(B)飞行员的实验显示,刺激ICs和CpG,但不是和ICs或CpG,诱发扩散(百分数表示的细胞进入分裂,前兆群体)的B细胞从MC患者和不健康的捐赠者(HD)。(C)ICs而不是单体的免疫球蛋白(丙种球蛋白)增加CpG-induced扩散单克隆V_H1 - 69^pos而不是V的_H1 - 69^负的MC患者B细胞;* * * p = 0.01, p = 0.001弗里德曼通过非参数测试。(D)估计情节的变化的百分比/ V_H1 - 69^posB细胞在不同刺激个体患者;假定值计算了配对t检验。

G6确认确定的B细胞的抗体,针对V_H1 - 69变量基因蛋白质产品,实际上表达了V_H1 - 69 -编码重链分子的bcr特征3 6例。在所有情况下,表达bcr被V编码_H1 - 69 / V_k3底座固定基因的轻链互补决定区进行3 d - 20区区(CDR3上)序列同源规范RFs MC患者以及E2抗体的丙肝病毒包膜蛋白(补充表2),签名中表达bcr淋巴增殖性疾病继发于丙肝病毒感染(3,4)。

我们最初进行的初步使用整个B细胞流式细胞术研究HCV-cured MC患者,发现co-stimulation ICs显著增加CpG-induced MC患者B细胞扩散而不是健康的捐赠者,而单独使用ICs是无效的(图1 b)。然而,这些实验不允许得出增生性反应引起的ICs + CpG仅限于RF-producing B细胞。因此,我们进行进一步的实验在HCV-cured MC患者V_H1 - 69^pos克隆B细胞使用G6抗体可以追踪。

V的频率_H1 - 69^pos和V_H1 - 69^负的IgM^posMC患者的B细胞,进入部门后总结了不同的刺激图1 c;这些研究在一个病人重复10个月之后,一致的结果(没有显示)。V_H1 - 69^pos在应对CpG B细胞扩散不佳相比,自体V_H1 - 69^负的B细胞(p = 0.002),但与CpG co-stimulation anti-Ig或ICs显著增强扩散;相比之下,co-stimulation CpG和ICs V没有影响_H1 - 69^负的B细胞。丙种球蛋白增加V的扩散_H1 - 69^posB细胞在某些病人,可能是因为有一些自发聚合在制备免疫球蛋白。图1 d显示了估计的百分比的变化划分vh1 pos - 69 B细胞在不同的刺激在个别病人。

上述结果反映的仅仅是B细胞进入分裂的频率,我们进一步分析了扩散指数(补充图2),完全忠实地反映了分裂细胞的复制能力。V_H1 - 69^posB细胞有显著降低(p = 0.007)增殖指数比V_H1 - 69^负的细胞对刺激CpG,但co-stimulation ICs显著增加(p = 0.03)。与anti-Ig Co-stimulation,尤其是ICs导致扩散指数的V_H1 - 69^posV B细胞没有明显的不同_H1 - 69^负的B细胞和CpG co-stimulated anti-Ig,表明co-engagement BCR和TLR9识别可能导致达到复制的能力招募V_H1 - 69^posB细胞。

我们进一步研究了IgM的分化^posCD20^posB细胞B细胞为IgM^高CD20^低/否定细胞如图2一个;必须提出,这种策略不允许歧视preplasmablasts, plasmablasts和浆细胞(19)。CpG-induced分化在V显著降低(p = 0.009)_H1 - 69^posV相比_H1 - 69^负的细胞,co-stimulation anti-Ig或ICs显著增加V分化而无效_H1 - 69^负的B细胞(图2 b)。的分化与增殖,丙种球蛋白增加V_H1 - 69^pos在一些患者B细胞(图2 c)。

图2

图2Co-stimulation CpG和ICs驱动分化成IgM^高CD20^低/否定V B细胞的反应迟钝_H1 - 69^posB细胞。(一)代表cytograms说明控制策略。从MC患者PBMC与CpG, IgM刺激5天^posB细胞电子大门;vh1 - 69^pos和vh1 - 69^负的细胞进一步封闭,并在每个人口,IgM的频率^高CD20^低/否定B细胞计算。(B)累积vh1 - 69年分化的结果^pos和vh1 - 69^负的IgM B细胞为IgM^高CD20^低/否定由不同的刺激B细胞诱导;* * * p = 0.03, p = 0.0036弗里德曼通过非参数测试。(C)估计块IgM的百分比的变化^高CD20^低/否定B细胞在不同刺激个体患者;假定值计算了配对t检验。

总之,这些数据表明,co-stimulation BCR自身抗原和TLR9识别的CpG可以促进增殖和分化,后者的限制缺乏不同阶段之间的歧视,反应迟钝的RF-specific IgM^posHCV-cured MC患者的B细胞。解开这个协同作用的机制,我们调查了BCR和TLR9识别信号通路在这些细胞。

TLR9识别和MyD88通常表现在MC克隆B细胞

自从BCR触发诱发TLR9识别表达式在人类天真的B细胞(21),我们被问及感应TLR9识别表情的BCR信号可以解释拯救MC克隆B细胞从睡着到CpG。在初步使用商用试剂流式细胞仪实验,我们得出的结论是,TLR9识别可以获得最好的染色标记抗体,然而,阻止co-staining标记anti-V_H1 - 69抗体。因此,我们调查TLR9识别蛋白质含量在整个B细胞从3 HCV-cured MC患者大B细胞(> 80%)IgMκ^pos克隆显然被轻链限制和CD21。表征^低表现型。我们发现,这些患者的B细胞克隆既定TLR9识别蛋白质的表达水平与健康的捐赠者的B细胞;然而,与正常B细胞BCR触发未能提高TLR9识别蛋白质含量(图3一)。我们下一个测量TLR9识别mRNA内容qPCR提纯B细胞从这三个MC患者加另一个病人还携带一个大B细胞克隆。TLR9识别mRNA表达倾向,虽然不明显,在MC更高的B细胞从健康的捐赠者比(图3 b),与TLR9识别蛋白,观察刺激anti-Ig增加TLR9识别mRNA内容只有在健康的捐赠者的B细胞(图3 c)。

图3

图3克隆MC患者的B细胞表达丰富TLR9识别水平没有增加BCR信号,而不表达抑制MyD88_年代同种型。(一)从MC患者PBMC大B细胞(> 80%)IgMκ^posCD27^pos克隆和健康的捐赠者(HD)培养16小时没有或存在anti-Ig ICs,然后与CD20抗体染色,IgM, CD27和TLR9识别。TLR9识别小额信贷机构指IgM^posCD27^posB细胞在两组。(B)TLR9识别mRNA水平衡量qPCR在新鲜分离纯化整个B细胞从MC患者大B细胞克隆和高清;ns,不显著p = 0.1。(C)MC和HD患者的B细胞纯化培养3小时条件下显示的面板,和mRNA的变化被qPCR测量。(D)的mrna MC患者B细胞用于实验中描述面板B用于半定量RT PCR引物,扩增受体激动剂MyD88_l同种型和抑制MyD88长_年代短MyD88适配器的同种型;结果显示近MyD88独家使用_l在这些细胞。

的upregulation TLR9识别似乎并未参与的能力BCR CpG-unresponsive MC B细胞活化诱导扩散,我们问是否这种现象可能是由于救援TLR宽容的国家。TLR呈现的刺激免疫细胞对后续通常刺激,这一过程称为TLR宽容,这是很好地研究巨噬细胞(21)。有趣的是,人类的B细胞的刺激在体外与TLR7/8合成兴奋剂R848成为对随后的刺激与R848或CpG但响应这些配体恢复BCR信号(22),从而密切回忆我们的发现。

髓细胞TLR宽容的核心机制是生产短接头变体MyD88 (MyD88_年代),与受体激动剂长形式(MyD88_l),对抗伊拉克共和国的磷酸化和NF-κB激活(23)。自从MyD88s由中也是通过体外观察TLR宽容从脓毒症患者单核细胞(24),它可以将致病性MC患者的B细胞,如果TLR宽容,过表达这种拼接变异。与这一假设相反,我们发现,只有MyD88_l由这些细胞(mRNA表达图3 d)。然而,这一发现并不完全排除,MC B细胞TLR宽容,因为可能不会引起MyD88 TLR9识别刺激_年代在人类B细胞(25)和其他分子可以负调控信号通路在TLR公差(21,24,26)。因此,我们调查TLR9-induced NF-κB激活,这是抑制TLR宽容的B细胞(22)。

熟练的TLR9-induced但不是BCR-induced信号在MC NF-κB B细胞

我们之前报道,BCR-driven磷酸化ERK受损的克隆HCV-viremic MC患者的B细胞和规范后不久清除病毒的抗病毒疗法(11,17)。这里我们研究BCR信号通过PI3K / Akt通路,BCR-induced救援所需的TLR公差(22)。我们研究了4 MC患者,发现刺激BCR anti-Ig导致一种蛋白激酶磷酸化在V_H1 - 69^负的在V_H1 - 69^posB细胞而ICs是有效的,虽然不到anti-Ig,后者只在细胞(图4 a, B)。这些数据表明,PI3K / Akt通路是完整RF-specific HCV-cured MC患者的B细胞,可以通过自身抗原激活;因此,原则上自身抗原能诱导救援从TLR宽容到BCR信号。试图理清这个问题我们在MC克隆B细胞调查TLR信号。

图4

图4PI3K / Akt和NF-kB / p65信号在MC患者B细胞克隆。(一)从代表MC患者PBMC与不同的刺激被激活;电子大门IgM⁺B细胞进一步封闭为V_H1 - 69^pos和V_H1 - 69^负的细胞亚群分析pAkt-specific荧光(灰度直方图表示V_H1 - 69^负的和白色的直方图V_H1 - 69^pos细胞)。(B)累积4 MC患者的结果(结果表示为MFI褶皱变化相比,如果细胞)说明ICs诱发一种蛋白激酶磷酸化有选择地在V_H1 - 69^pos细胞。(C)从代表MC患者PBMC IgMkCD27^posB细胞克隆,从健康捐献者(HD)左如果或激活不同的刺激。后刺激IgM^posCD27^pos细胞被封闭的变化分析p65 (pS529)特殊荧光(灰色和白色的直方图直方图表示如果细胞刺激细胞)。结果表明,p65 (S529)磷酸化与CpG刺激后而不是与anti-Ig MC细胞,同时也有效的磷酸化后在高清细胞刺激。(D)3 MC患者循环IgMkCD27累积的结果^posB细胞克隆HDs和3,说明IgM^posCD27^pos克隆B细胞的MC患者有效地使磷酸化p65 (S529)刺激后与anti-Ig CpG但不是。* p = 0.048的配对t检验。

TLR7 / TLR9识别人类B细胞与公差规范NF-κB信号通路的激活减少了这些通常(22)。因此,我们调查TLR9识别和BCR-induced磷酸化p65 NF-κB亚基在丝氨酸529 [p65 (pS529)]。我们选择这个签名p65激活,因为它标志TLR9识别信号之间的协同作用,细胞因子环境和BCR信号在促进慢性淋巴细胞白血病细胞的克隆扩张(27,28),因为p65 BCR-mediated磷酸化在CD21。表征(pS529)是有缺陷的^低CVID患者B细胞(29日)。对于这些实验我们调查整个B细胞从MC患者窝藏V B细胞克隆,不表达_H1 - 69,但被独特的IgMκCD27很容易被识别出来^pos主要是CD21^低表型(没有显示)。刺激的CpG导致类似的增加p65 CD27 (pS529)磷酸化^pos从健康的捐赠者和MC患者B细胞而p65 anti-Ig诱导(pS529)磷酸化在MC克隆B细胞缺陷;co-stimulation CpG和anti-Ig往往有累加效应p65 (S529)磷酸化在健康的捐赠者的B细胞而不是MC B细胞(图4 c, D)。

总之,TLR9-induced,不是BCR-induced NF-kB精通MC B细胞活化,强烈反对TLR公差(状态22)。

讨论

IgM抗体表达的MZ B细胞无性繁殖系地扩大HCV-associated MC polyreactive,据说赋予了射频活动和丙肝病毒抗原的特异性,可能E2包膜蛋白(1- - - - - -5)。最强的论点赞成的依赖致病性B细胞克隆的扩散MC患者持续丙肝病毒抗原刺激的是,在大多数情况下,血管炎退化的根除感染抗病毒治疗(6,7)。代替直接由病毒抗原刺激,有人建议HCV-bound免疫球蛋白g可能扩散的主要驱动这些RF-producing B细胞(1,30.),但这个模型很难解释了为什么在其他慢性感染,例如在艾滋病毒感染也有特异性CD21。表征的积累^低CD11c^posB细胞(12),没有扩张RF-expressing B细胞克隆。

MC患者中的RF-specific克隆表达一组限制的刻板的bcr,这不同于那些编码RFs在类风湿性关节炎(31日),但所表达的高度同源的CD21。表征^低CD11c^posB细胞无性繁殖系地扩大在原发性干燥综合征,另一个RF-specific B细胞淋巴增殖性疾病(13,32,33)。有人建议,在干燥综合征形成的ICs anti-Ro / SSA和anti-La /单边带自身抗体驱动射频B细胞的克隆扩张(34)。此外,克隆B细胞的bcr MC患者也高度同源表达的肿瘤中B细胞的一个子集RF-producing慢性淋巴细胞白血病推定地依赖自身抗原(4,35- - - - - -38)。因此,一些RF-specific刻板bcr似乎独特与充满活力的细胞对自身抗原的反应,即免疫球蛋白ICs,导致不同的淋巴增殖性疾病。

我们发现TLR9-driven克隆RF-specific B细胞的增殖和分化MC患者相比,同种异体或自体正常B细胞缺陷。与我们的研究结果差异,Comarmond和他的同事们(39)最近报道,TLR9识别与CpG刺激诱导促炎细胞因子的分泌以及CD21。表征的扩散^低从HCV-associated MC患者B细胞。后者的声明中,然而,只支持一个有代表性的实验没有比较正常CD21。表征^posB细胞;此外,同样的研究表明,CpG诱导大量凋亡CD21。表征^低B细胞,对比与保存完好的增殖反应。一项研究报告(13),RF-producing CD21^低干燥综合征患者的B细胞表型和immunogenetically (32,33)非常类似发现在MC,在应对CpG扩散不佳相比,他们CD21。表征^pos正常的同行。此外,CD21^低B细胞在感染艾滋病毒或CVID扩张,表型和功能相似的MC患者,在应对CpG增殖不佳(12,14)。值得注意的是,co-stimulation BCR和TLR9识别的T细胞的存在很大程度上帮助恢复CD21。表征的扩散^低从感染艾滋病毒的患者B细胞(12),也表明这种疾病抑制压力可以覆盖。

我们的研究结果提供的证据表明,ICs和CpG可能同意诱导的扩散反应迟钝RF-producing克隆从HCV-cured MC患者B细胞(图5)。地面上临床,这也许可以解释为什么HCV-independent复发相伴MC血管炎常发生的事件,如感染或癌症,确定丰富的集成电路生产,刺激微生物的DNA或细胞起源(9)。因此,在健康状况持续低级刺激的生理水平的ICs和微生物或apoptosis-related核酸可能支持生存致病性B细胞克隆(16这些配体可能over-activate细胞),而生产过剩导致临床复发。低级刺激BCR和TLR9识别看似提供增殖信号弱于从本质上不同于那些提供的丙肝病毒通过同时激活BCR病毒抗原,TLR7的单链RNA和研究coreceptor E2包膜蛋白(40);这或许可以解释为什么MC克隆B细胞抗病毒治疗后幸存的逐步宽松CD21。表征^低表型和恢复一些功能缺陷虽然仍对CpG (17)。

图5

图5HCV-dependent autoantigen-dependent扩张球蛋白血症引起类风湿因子B细胞克隆的混合。(一)丙肝病毒驱动扩散B细胞的克隆表达polyreactive BCR赋予anti-HCV和类风湿因子特异性;扩大B细胞克隆获得特殊CD21。表征^低表型和功能的疲劳。(B)一旦通过抗病毒治疗丙肝病毒CD21。表征^低B细胞克隆存活很长一段时间;这些疲惫的细胞不能增殖的订婚的BCR自身抗原(免疫复合物,ICs)和TLR9识别的CpG但增殖的同时接触两种受体,可能支持virus-independent致病性CD21。表征的生存^低B细胞克隆在活的有机体内。磷酸化的NF-kB p655单元后缺乏BCR TLR9识别刺激后刺激和熟练;因此,减少CD21。表征扩散机制^低B细胞克隆后TLR9识别刺激和BCR / TLR9识别积极相声仍未定义。

我们试图理清BCR / MC B细胞TLR9识别信号覆盖没有反应,但未能描述一致的场景。我们的发现可能会反对救援TLR公差(22)以来,面对一个增殖缺陷,TLR9识别/ NF-κB的磷酸化信号通路出现完整的基于p65 (S529)。然而,异常p65磷酸化在网站除了S529或其他NF-κB子单元的磷酸化可能负责缺陷信号(41)。

通过规范化通路受损BCR-mediated NF-κB信号(p65 (S529)磷酸化和IκBα退化),与相对保存TLR9-mediated NF-κB信号,是CD21。表征中所描述的^低B细胞CVID患者或艾滋病毒感染(29日)。因此,有缺陷的BCR信号NF-κB建议代表CD21。表征的一个共同特征^低B细胞无论潜在的障碍,和我们的研究结果支持这一观点。

一个优雅的研究类开关复合(CSR)的B细胞(42)表明,孤立信号TLR9识别(或其他通常和BCR导致边际或没有企业社会责任,而结合信号导致健壮的企业社会责任;因此,得出的结论是BCR和通常可以互补,增强相互地的通路激活通过规范化和非规范NF-κB通路。

其他信号通路可能参与协同BCR / TLR9识别相声MC B细胞。适配器的奉献者cytokinesis-8 (DOCK8)磷酸化TLR9识别激活,然后结合Lck /是的小说酪氨酸激酶(Lyn)导致脾酪氨酸激酶的磷酸化(麦克米兰,STAT3和B细胞增殖激活(43)。有趣的是,CD21^低B细胞CVID患者或艾滋病毒感染,而接近于MC的病人,既定的过表达麦克米兰但减少了激活麦克米兰和下游信号分子的BCR刺激(44)。因此,麦克米兰的DOCK8-dependent磷酸化,独立于BCR引起,可能有助于恢复信号级联。另一个分子之间重要的协同作用BCR和TLR9识别是转化生长因子β活化激酶1 (TAK1)。TLR9识别信号导致激活IRAK1,与麦克米兰合作,招募TNF receptor-associated因子6 (TRAF6)激活TAK1 (45),它起着至关重要的作用在先天和适应反应通过激活NF-kB和MAPKs (46),中央在编排TLR9识别之间的协同和BCR增殖,分化和抗体生产(47)。因此,DOCK8 TRAF6可以结合来提高BCR-induced麦克米兰和MC TAK1激活B细胞。

结论

我们证明,同时参与的BCR自身抗原的形式替代ICs和TLR9识别的CpG驱动器的增殖和分化,否则反应迟钝RF-specific致病性B细胞来自患者HCV-cured MC。这提供了一个解释许多HCV-cured MC患者长期持久的致病性B细胞克隆会导致virus-independent血管炎的复发。

我们承认我们的研究有一定的局限性。一个重要的一个是患者在某些实验;这是因为罕见的MC患者的特点明显的致病性B细胞的克隆后的治疗丙肝病毒感染。另一个限制是缺乏分化的不同阶段的识别从preplasmablasts浆细胞和类开关的诱导B细胞克隆不同的刺激。

感兴趣的是,复发的MC血管炎常与事件有关,如细菌感染或癌症,导致增加循环ICs和TLR9识别的配体(9)。Marshak-Rothsteins小组的开创性的研究显示,双接触BCR和TLR7 / TLR9识别系统性自身免疫的起始是至关重要的(48,49)。我们的结果指向一个重要的角色的BCR / TLR9识别相声延续自身免疫抵消反应迟钝时发生的这些受体激活autoreactive B细胞功能演变成疲惫CD21。表征^低B细胞。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

道德声明

综述了研究涉及人类参与者和Sapienza大学的伦理委员会批准的罗马Prot.n。678/18。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

MV、MF和MC设计研究。MDP、RM、山药、EP、GR、CB进行了实验室研究。MV, MF、RC和LS监督方法,数据管理和统计分析。LG、AC、SC和LS为研究的发展做出了贡献。MV和起草了手稿,曼氏金融数据和表。LG、AC、SC、LS、某人,RC, MC批判性回顾了手稿,促成了结论。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是支持由巴斯德史Italia-Fondazione森西Bolognetti 2017 - 76 MV, Sapienza大学校内研究项目的罗马RM11715C7D005D19 MC和意大利教育部和研究主要- 2017 wjbkkw某人。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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引用

1。Agnello诉球蛋白血症引起的病因和病理生理学混合二次丙型肝炎病毒感染。施普林格Semin Immunopathol(1997)19:111-29。doi: 10.1007 / BF00945029