快速术中甲状旁腺激素测定甲状旁腺识别基于免疫胶体金技术在甲状腺手术

介绍

Hypoparathyroidism是一个变态的特点是低水平的甲状旁腺激素(素(1)。hypoparathyroidism最常见的原因是意外删除或在甲状腺甲状旁腺损伤或颈部手术(2)。多达60%的患者接受全甲状腺切除术瞬态hypoparathyroidism经验,表现为低血钙症,甲状腺手术后几天内(3)。尽管大多数患者术后甲状旁腺素低甲状旁腺功能迅速恢复,大约4%的人建立一个永久hypoparathyroidism手术后持续超过6个月(3,4)。因此,原位保护甲状旁腺的区分他们从周围结构的意义。

目前,术中识别甲状旁腺很大程度上取决于外科医生的经验,导致意外甲状旁腺切除术的风险相当大。一些辅助技术被用于甲状腺手术的概率降到最低甲状旁腺切除,术后hypoparathyroidism的后续发展和低钙血症,如碳纳米颗粒悬浮-成像,可见由亚甲蓝染色或antiparathyroid抗体BB5 G1共轭汽巴龙蓝色,和伽玛探头识别(5- - - - - -9)。不幸的是,直到现在没有可靠的术中方法确定甲状旁腺。碳纳米颗粒悬浮-成像可以帮助识别甲状旁腺,但不是很有效识别脂肪从甲状旁腺组织(5,10)。术中冰冻切片进行组织学检查有助于区分甲状旁腺组织与其他组织和有选择地用于识别存在甲状旁腺组织和提供组织学确认潜在的甲状旁腺自体移植。然而,这种方法有很多缺点的识别甲状旁腺。首先,组织学检查样品分析要求原位甲状旁腺,这往往会导致组织损伤。第二,这种技术是耗时的,通常超过30分钟,也可能会推迟手术时间和影响其余的活力甲状旁腺腺自体移植物,甚至导致移植失败。

甲状旁腺素是一个与84个氨基酸和多肽分子量9.5 kDa,它是专门在甲状旁腺分泌和表达(11)。测量的甲状旁腺素水平切片样本已被证明是高度可靠识别甲状旁腺组织(12,13)。电化学发光免疫测定(ECLIA)使用商用试剂是一种可靠的方法测量血清甲状旁腺素的水平。然而,这种分析需要昂贵的设备和受过专门训练的技术人员,主要是安装在医院检测中心高通量测试血清甲状旁腺素。单个样品的交付组织洗出液需要多个部门之间的密切配合;此外,审查过程超过30分钟。受此方法识别甲状旁腺腺体,我们已经开发出一种甲状旁腺素检测技术使用ICGT甲状旁腺腺的识别。使用的检测仪器是便携式(< 500 g),可以放置在手术室。新甲状旁腺素检测技术是定量,easy-operated微创和省时的至少2分钟内工作。同时,它也适合在体外和在活的有机体内甲状旁腺腺的识别。

本研究的目的是验证一致性ICGT法和标准化ECLIA法测量血清甲状旁腺素的浓度。重要的是,我们分析的可靠性和准确性ICGT方法确定甲状旁腺在甲状腺切除术,并评价该方法的临床价值提高术中甲状旁腺识别的效率和减少术后hypoparathyroidism的发病率。我们也探讨了灵敏度和效率ICGT甲状旁腺素的检测时使用不同的样本收集技术。

材料和方法

研究伦理委员会批准华中科技大学(武汉,中国)。所有程序进行了符合赫尔辛基宣言的原则。书面知情同意了所有个人参与者包括在这项研究。研究设计和程序所示图1。

免疫胶体金技术的原理和检测过程分析

PTH-ICGT试验是由Bioda(中国)是一种新型的方法利用ICGT技术确定甲状旁腺素水平(图2)。第二的免疫测定,ICGT免疫测定的原理是使用胶体金作为示踪标记在抗原抗体反应。甲状旁腺素检测设备由塑料盒和测试条安装在盒子里。利用固相显色技术,测试条板与甲状旁腺素主要在硝化纤维膜抗体测试区(结合位点的c端甲状旁腺素肽链)。控制区域与山羊anti-streptavidin抗体预涂。化学共轭垫是涂有胶体gold-labeled甲状旁腺素二次抗体(结合位点位于53 - 68甲状旁腺素多肽链的氨基酸)和胶体gold-labeled链霉亲和素共轭。

时的检测,要测试的样本(90μl)添加进洞里的地带。甲状旁腺素的样品结合胶体gold-antibody配合预涂的共轭垫形成免疫复合物。通过毛细管作用,胶体gold-labeled复合物是由固相捕获的显色剂(甲状旁腺素抗体)位于膜上的测试区形成粉红色或黑暗的红丝带。un-reacted复合物停滞在控制区域形成一个控制行绑定到预涂anti-streptavidin抗体膜。丝带的颜色的程度成正比的甲状旁腺素水平样本测试在一定范围内。探测线和线扫描和分析,质量控制和仪表的参数预置计算血甲状旁腺素水平。孵化2到6分钟后,甲状旁腺素浓度的测试条由Bioda免疫定量分析定量检测器(Bioda诊断,武汉,中国),图3。ICGT试验的检测范围是10 - 1000 pg / ml。条会显示阴性结果当样品浓度低于最低检出限(10 pg / ml);当样品浓度高于1000 pg / ml,仪器检测的值显示> 1000 pg / ml。检测变异系数从同一批次的检测试剂< 15%。所有测量值都是由相同的技术员。

免疫胶体金技术分析样品制备

两个样品制备方法FNA)和《PTH-ICGT测定和比较(图4)。FNA)方法,目标组织用1毫升注射器负压吸气三次,获得少量的组织液,在1毫升生理盐水稀释氯化钠0.9% (w / v)。《法,1毫米³目标组织的切除标本,用手术刀片切成匀浆,然后在1毫升生理盐水稀释。组织准备洗出液使用以上方法进行化验。

研究方法和步骤

第一部分

初步研究了检查ICGT和ECLIA方法之间的一致性。甲状旁腺素中检测出的151份血清样本收集后储存在-25°C的病人接受了体检,在同济医院同济医科大学、华中科技大学2015年10月和2016年1月之间。血清甲状旁腺素水平衡量ICGT和古典ECLIA法这两种方法(罗氏)。ECLIA决心,作为黄金标准测量的甲状旁腺素比较,进行自动ECLIA系统(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。

第二部分

病人(n = 79) 2016年1月到5月之间接受单侧甲状腺切除术被录取。手术过程中,从周围的甲状旁腺组织结构的区别是第一个完成和记录由外科医生直接目视检查4 - 6年的手术经验。共有176个组织样本,包括骨骼肌、甲状腺、脂肪、淋巴结,从病人和甲状旁腺,收集。切除组织样本之前,少量的组织液被FNA ICGT甲状旁腺素测定的试验。然后,1毫米³组织样本收集和分成两半。一半用于冰冻切片检查,从另一半,组织匀浆提取和溶解在1毫升生理盐水ICGT甲状旁腺素测定的测定(《方法)。确定甲状旁腺被保存了下来原位或auto-grafted到肌肉。以冰冻切片检查为标准,1)甲状旁腺素水平不同组织之间的比较。2)截止值、灵敏度和特异性的抽样方法术中甲状旁腺ICGT试验进行了分析鉴定,和两种抽样方法的检测时间也比较。3)同时,ICGT试验的诊断精度(FNA), n = 139)和直接用肉眼目测术中甲状旁腺比较的识别。

第三部分

2016年6月和11月间,共有106名病人全甲状腺切除术,包括21岁男性(19.8%)和85名女性(80.2%),45.6±17.3岁(范围、22 - 68年),被录取。使用随机数字表,病人被随机分配到两组进行术中甲状旁腺识别:通过检测ICGT组织甲状旁腺素水平的测定(FNA PTH-ICGT集团,n = 53)或肉眼和经验的外科医生(对照组,n = 53)。PTH-ICGT组,ICGT方法被用来协助手术期间甲状旁腺组织的鉴定。在检测和基于结果后,及时组织决定保留原位或接受自体移植。所有操作都是由同一团队的外科医生。

术后血清甲状旁腺素浓度是由罗氏ECLIA,定期检查和血清钙水平。术后短暂的低钙血症的发病率,这是定义为一个血清总钙浓度≤2.12更易/ L (8.5 mg / dL)测量手术后24小时内,记录(14)。

统计分析

所有统计分析使用SPSS16.0软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)和GraphPad棱镜软件(版本6;GraphPad软件有限公司、美国)。定量数据提出了均值±标准差(SD)。分类变量被表示为一个绝对的数量和百分比。比较两组进行使用independent-samples t测试。分类数据比较使用卡方或确切概率法。PTH-ICGT之间的一致性和ECLIA方法由线性回归分析研究。P < 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

第一部分

之间的一致性甲状旁腺Hormone-Immune胶体金技术和电化学发光免疫测定方法

共收集151份血清样本的甲状腺手术验证PTH-ICGT和ECLIA方法之间的一致性。最小化偏差造成的极端值,甲状旁腺素测量> 1000 pg / ml, (n = 0)或< 10 pg / ml, (n = 0) PTH-ICGT或ECLIA被排除在外。通过Bablok分析显示甲状旁腺素之间的线性关系测量结果PTH-ICGT和ECLIA方法,检测到的,方程如下:y = 0.293640 x - 11.533234 (图5测量),y是甲状旁腺素(pg / ml)的国际清洁方法,和测量x是甲状旁腺素(pg / ml) ECLIA法。一致性的相关系数为0.9163 (P < 0.001),表明这两种方法之间的良好一致性。

第二部分

比较的量化甲状旁腺Hormone-Immune胶体金技术分析不同的组织

共有79名患者,包括17个男性(21.5%)和62名女性(78.5%),40.6±8.3岁(范围28 - 65)年,被录取。甲状旁腺素水平ICGT探测到在不同的组织或结构进行比较,以确定是否这种定量PTH-ICGT试验可以用来区分甲状旁腺腺和其他组织。共有176个组织样本收集。所示图6的甲状旁腺素浓度non-parathyroid组织匀浆(整体(14.8±2.1 pg / ml, n = 97);骨骼肌(14.5±1.5 pg / ml, n = 13),甲状腺组织(15.0±1.3 pg / ml, n = 26),脂肪组织(15.3±1.2 pg / ml, n = 36)和淋巴结(14.0±1.2 pg / ml, n = 22))明显低于甲状旁腺(955.3±16.1 pg / ml, n = 79, P < 0.0001)。数据显示术中组织甲状旁腺素水平允许精确的区别和甲状旁腺组织的检测。因此,它是可行的区分甲状旁腺组织与周围结构的甲状旁腺素使用PTH-ICGT试验测量。

比较不同的抽样方法免疫胶体金Technique-Parathyroid激素检测

我们比较的甲状旁腺素水平non-parathyroid和甲状旁腺组织收集使用不同的抽样技术(表1)。甲状旁腺素水平在甲状旁腺组织(955.3±16.1)pg / ml和(224.0±54.6)pg / ml,当检测到ICGT样本中收集的《旅和FNA)方法,分别为(图6 c)。甲状旁腺的甲状旁腺素水平远高于那些non-parathyroid组织,不论使用的抽样技术(《15.3±0.9 pg / ml和FNA) 14.1±0.9 pg / ml)。《旅的截止值是136.3 pg / ml, FNA 63.99 pg / ml。FNA)的敏感性低于那些《(χ²= 8.333,P < 0.05) (图6 b)。在检测过程中,《方法更快,反应只花了2分钟,清楚乐队;FNA)方法,花了6分钟完成反应。两种方法明显短于的时间消耗的冰冻切片检查(> 30分钟)。因此,ICGT方法可以显著提高术中甲状旁腺识别的效率。

免疫胶体金技术的诊断准确率的方法确定甲状旁腺组织

冰冻切片检查的结果显示78年甲状旁腺组织和61年non-parathyroid组织。以活检为标准,诊断准确率为98.6% (137/139;PTH-ICGT组P > 0.05 vs .活检),而这是74.1%的病人标识下直接目视检查(103/139;P < 0.001 vs .活检)。因此,PTH-ICGT表现出较高的诊断准确率(P < 0.001),与金本位冰冻切片检查。相比之下,直接目视检查,ICGT显示歧视能力比直接目视检查确定甲状旁腺腺(97.4vs。(100 78.2%)和non-parathyroid组织vs。68.9%;图6 c)。ICGT方法的应用可以大大提高识别的准确性甲状旁腺手术期间。

第三部分

临床结果的患者使用甲状旁腺Hormone-Immune胶体金技术测定甲状腺手术

的106患者中,共有111个甲状旁腺腺被识别和记录在对照组(n = 53)。

术后血清钙和血甲状旁腺素水平以及术后短暂的低钙血症的发生率两组之间的比较来证实PTH-ICGT试验是否可以防止hypoparathyroidism的发生。PTH-ICGT患者检查的方法有更高的术后血清钙浓度和血甲状旁腺素水平在1和3个月时,比那些甲状旁腺腺被外科医生的经验(P < 0.05,图7 a, B)。然而,术后血清钙浓度和血甲状旁腺素水平之间变得比较两组患者在6 - 12个月(P > 0.05)。PTH-ICGT组术后短暂的低钙血症的发生率(13.2%,7/53)明显低于对照组(37.7%,20/53;P < 0.01;图7 c)。

讨论

在这项研究中,我们引入了一个新的技术区分甲状旁腺组织和其他结构,一个挑战在甲状腺或颈部手术。通过使用ICGT分析与组织匀浆样条,ICGT能够迅速反映出组织的甲状旁腺素的浓度,从而确定组织的性质和减少甲状旁腺切除的可能性。考虑到这种技术是快速、廉价和收益率较高的诊断率,高潜力成为术中甲状旁腺识别另一本小说。

使用术中FNA)结合快速甲状旁腺素测定报道替代冰冻切片检查(15)。然而,这个过程延长手术时间40分钟,需要特殊的设备和训练有素的专业(15)。在目前的研究中,一种新颖的基于甲状旁腺素测定测量引入缩短检测时间,样品测量读出时间2到6分钟。

扁等人运用罗氏ECLIA试验测量甲状旁腺素,并发现甲状旁腺素的平均值是3369 pg / ml确定证实副甲状腺和25.7 pg / ml确定non-parathyroid组织,建议ECLIA分析是一种有效的方法来区分甲状旁腺和non-parathyroid组织(12)。我们在151年首先检查甲状旁腺素浓度血清样本使用ICGT和ECLIA(罗氏)方法。通过Bablok分析显示良好的测量结果之间的一致性甲状旁腺素检测到PTH-ICGT ECLIA,相关系数r为0.9163的一致性。然而,ICGT化验有自己的优势,包括操作简单、快速的读出,方便,没有昂贵的设备和受过专门训练的人员要求。此外,ELCIA只适用于血清样本检测,而ICGT分析能够发现甲状旁腺素水平在血清和组织匀浆样品。因此,这些数据表明,ICGT化验可能作为一种替代方法快速,术中测量甲状旁腺素浓度,即使在组织匀浆样品。

甲状旁腺组织的术中识别甲状旁腺素水平依赖于事实,甲状旁腺素表达只在甲状旁腺组织非常高,当它只不过是表达non-parathyroid组织,不论组织类型和位置。我们发现很低水平的甲状旁腺素non-parathyroid组织,如骨骼肌,甲状腺,脂肪,和淋巴结,这强大的组织表达甲状旁腺素。相比之下,甲状旁腺素浓度高达955.3±16.1 pg / ml甲状旁腺组织。使ICGT甲状旁腺鉴定甲状旁腺素测定的一种可靠方法。

在这项研究中,我们使用两种方法对样本集合操作期间,FNA),《旅。不同的抽样方法,截止值确定甲状旁腺腺多样。FNA相比《灵敏度较低。可能的原因可能是细针错过或渗透甲状旁腺组织,导致未能收集组织液。然而,FNA)方法的优点方便,最小的组织损伤现场组织抽样,和建议现场组织鉴定。《方法更适合在体外组织识别,具有较高的敏感性和特异性以及属性更快的检测。

在这项研究中,ICGT试验的能力从non-parathyroid歧视甲状旁腺腺组织在106年检查病人总甲状腺切除术。ICGT显示能力高于直接目视检查确定甲状旁腺腺和non-parathyroid组织。PTH-ICGT组术后血清钙浓度和甲状旁腺素水平高于对照组,1和3个月。此外,PTH-ICGT化验发现降低瞬态低钙血症的发病率,而直接目视检查由经验丰富的外科医生。上述数据显示,术中甲状旁腺识别ICGT是个不错的选择,特别是对于条件如手术的外科医生经验不足,第二或复杂的颈部手术如甲状腺癌切除,如果主要的医院无法执行冰冻切片检查或不配备昂贵的设备。

这项研究有一些局限性。这是一个初步研究执行在一个中心,一个相对比较小的样本大小。此外,该技术的优化,包括最优截断值的甲状旁腺素,读出甲状旁腺素的测量,以及避免假阳性/阴性的检测,需要实现更准确,术中快速识别。可以克服这些限制大规模前瞻性研究与大样本大小和多中心设计在未来。

总之,PTH-ICGT分析有很高的潜力成为小说选择术中甲状旁腺识别基于其优点包括快速检测诊断率高。它尤其适用于特殊条件,如在外科手术中由新的外科医生经验不足,复杂的颈部手术,没有冰冻切片检查。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

涉及人类受试者的研究伦理委员会审查和批准的华中科技大学(武汉,中国)。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

XL、天气、生理、WS ZZ, ZY构思和设计研究。XL、天气、WS和ZZ收集数据并进行了研究。生理和ZY分析和解释数据。天气、生理和ZY最初的论文中写道。WS和XL修订。天气有主要责任最后的内容。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究受到了同济医学院的医生临床研究项目,华中科技大学(5001540018)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

引用