过氧亚硝基提高TLR4激活化学改性的草花粉过敏原Phl p 5

1。介绍

过敏性疾病的发病率和严重程度由机载全球植物花粉和其他过敏原在增加(1- - - - - -5)。可能的驱动因素等,这一趋势是过敏原的接触活性氧和氮物种(ROS / RNS)造成的空气污染(5- - - - - -8)。人为空气污染物臭氧(O₃)、二氧化氮(没有₂),和颗粒物质会引起或增强氧化应激和炎症过程导致内源性活性氧的形成/ RNS如过氧亚硝基(ONOO^{- - - - - -})(5,9)。ROS / RNS反应oxidation-sensitive氨基酸的蛋白质,特别是酪氨酸,形成硝基酪氨酸分子内和分子间dityrosine交叉连接,称为炎症和氧化应激的标记(9- - - - - -15)。除了修改ONOO^{- - - - - -}酪氨酸残基的蛋白质也可以直接修改的环境。例如,空气污染会损害花粉细胞壁,促进过敏性蛋白质和其他细胞质物质的释放到环境中(16- - - - - -20.)。过敏的蛋白质可以被直接暴露在空气中污染物促进化学蛋白质改性前吸入和沉积在呼吸道的蛋白质。特别是夏季烟雾条件下高O₃也没有₂硝酸浓度已被证明有效的和交联蛋白(小时天内21- - - - - -24)。

蛋白质结构的变化和其他属性由于硝化和寡聚化可以改变蛋白质的过敏和炎症的潜在影响,敏化的过程和过敏的反应阶段(9,10,25- - - - - -31日)。开发的ige过敏,即敏感,是一个多步骤的过程包括先天和适应性免疫系统的相互作用。过敏原的识别受体的气道上皮细胞,如toll样受体4 (TLR4)和其他过敏原与气道上皮的直接相互作用后的第一个事件过敏原吸入(32- - - - - -37)。过敏原的相互作用导致细胞因子的释放,趋化因子,和危险信号,启动表示过敏原的免疫细胞和生产有浓度过敏原特异性IgE,过敏反应阶段的关键。在再次接触过敏原,交联的IgE抗体表面束缚效应细胞,特别是肥大细胞,诱发细胞脱颗粒,释放促炎介质引发过敏症状(5,38,39)。

在这项研究中,我们调查了TLR4激活主要的桦树花粉过敏原Bet v 1和主要草花粉过敏原Phl p 5,都是关键的机载过敏原在中欧,之前和之后与ONOO化学改性^{- - - - - -}。被暴露于不同数量的ONOO的蛋白质^{- - - - - -}水相,和修改(酪氨酸硝化,寡聚化)分析液相色谱法(rp - C18)和sds - page。TLR4活化和细胞生存能力同时测定记者稳定细胞系和生物荧光检测。抑制实验与TLR4在THP-1-Lucia拮抗剂tak - 242进行^TMNF -$\kappa$B细胞。

2。材料和方法

2.1。蛋白和血清样本

重组从桦树花粉过敏原(桦木属翻车机)和盖草(Phleum pratense)花粉过敏原Bet v 1.0101和5.0101 Phl p,称为Bet v 1和Phl p 5以后,得到从Biomay AG(奥地利维也纳)。卵清蛋白(OVA)从InvivoGen购买(图卢兹,法国)和治疗一样的过敏原作为负控制细胞培养实验下面描述。蛋白质(1毫克mL股票的解决方案⁻¹)化学改性与纯水中描述准备回et al。(24)。

2.2。蛋白质改性与过氧亚硝基

碳酸氢铵($\ge$98%,博士欧元。,BP, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) was dissolved in pure water to yield a final buffer concentration of 2 M, and the pH was adjusted to 7.8 by the addition of 1 M hydrochloric acid (37% stock solution, Merck Millipore, Darmstadt, Germany). For each reaction, 300 or$\mathrm{500年}\mu$L的蛋白质溶液转移到一个棕色反应管(埃普多夫,汉堡,德国)和7.7或$\mathrm{12。8}\mu$L碳酸氢铵缓冲区(2米)添加到收益率最终缓冲50 mM的浓度。冰融化后,钠过氧亚硝基(160 - 200毫米,默克密理博)添加到蛋白质的解决方案。ONOO收益率摩尔比率^{- - - - - -}酪氨酸残基(ONOO^{- - - - - -}/酪氨酸)1/1、3/1或5/1,0.6,1.8,或$3\mu$L ONOO^{- - - - - -}被添加到$\mathrm{300年}\mu$L Bet v 1的样本和Phl p 5,$4.9\mu$L ONOO^{- - - - - -}来$\mathrm{300年}\mu$L卵子的样本(5/1),1,3,或$5\mu$L ONOO^{- - - - - -}来$\mathrm{500年}\mu$L Bet v 1和Phl p 5的样品。110分钟的反应是在冰上进行。之后,样品是用移液器吸取到一个10 kDa离心过滤器(Amicon®,默克密理博)和离心机在14 000$\times$g 2分钟(5427 R,埃普多夫)。样品被五次$\mathrm{200年}\mu$L PBS和离心在14 000$\times$g为2分钟。对于样品恢复,过滤器是天翻地覆,转移到一个干净的微型离心管,离心1 000$\times$g为2分钟。恢复可能样品残留,过滤器清洗了$\mathrm{200年}\mu$L纯水和离心机颠倒1 000$\times$g 2分钟到浓缩蛋白样品。2 - 6不同ONOO独立蛋白质样本的准备^{- - - - - -}/酪氨酸比率。模拟控制的过敏原(称为mock-treated Bet v 1和mock-treated Phl p 5以后),蛋白质与所有缓冲区但没有ONOO解决方案治疗^{- - - - - -}纯化,如上所述。

2.3。HPLC-DAD分析

总酪氨酸硝化程度(ND)修改后的样本和控制是由HPLC-DAD分析中描述Selzle et al。(40)。简单地说,一个HPLC-DAD系统(安捷伦科技1260无穷系列、Waldbronn、德国)配有monomerically绑定C18柱(Vydac 238 tp,$\mathrm{250年}\mathrm{毫米}\times 2.1\mathrm{毫米}$d。$5\mu$m, Hichrom,伯克希尔哈撒韦公司、英国)是用于色谱分离。进行梯度洗脱流速为0.2毫升分钟⁻¹有0.1% ($v$/$v$)三氟乙酸(VWR国际GmbH,达姆施塔特,德国)水和乙腈(卡尔罗斯)和吸光度测量波长220 nm, 280 nm和357 nm。进样体积$10\mu$L,每个色谱运行进行了一式三份或重复。系统控制和数据分析,ChemStation使用软件(启C.01.07,安捷伦)。ND被定义为硝基酪氨酸的浓度除以硝基酪氨酸和酪氨酸(浓度之和40)。样品的蛋白浓度测定并联在同一色谱运行使用lc - 220方法中描述Reinmuth-Selzle et al。(41)。

2.4。sds - page和银染色

蛋白质寡聚化被silver-stained sds - page可视化和量化。蛋白质样本混合同等体积的2×Laemmli缓冲区,包含65.8毫米Tris-HCl (pH值6.8,卡尔罗斯)、26.3%甘油($v$/$v$卡尔•罗斯),2.1% SDS(卡尔罗斯)和0.01%溴酚蓝(Sigma-Aldrich)和加热在95${}^{\circ }$C为5分钟。样品(75 ng Bet v 1和50 ng Phl 5页)被加载到一个Mini-PROTEAN®TGX™预制蛋白质凝胶(4 - 20%,Bio-Rad,慕尼黑,德国)与60 ng颜色Prestained蛋白质标准,广泛(11 - 245 kDa或10 - 250 kDa,新英格兰生物学实验室,法兰克福,德国)。电泳运行条件恒定电压200 V的40分钟。电泳后,凝胶银染沾了皮尔斯工具包(热费希尔科学)后,制造商的协议。图像采集和量化蛋白质单体、二聚体,和低聚物,ChemiDoc系统(Bio-Rad)和图像实验室软件6.1 (Bio-Rad)使用。两到三个独立进行了sds - page分析蛋白质样品准备。

2.5。内毒素定量

内毒素的含量在本机和ONOO^{- - - - - -}修改Bet v 1和Phl p 5样本量化稀释后的样品的浓度$1\mu$克毫升⁻¹endotoxin-free水使用皮尔斯™LAL生色内毒素定量工具(热费希尔科学)根据制造商的协议。所有样本显示欧盟每小于0.25$\mu$克蛋白质。

2.6。海拉细胞TLR4 dual-luciferase记者

TLR4活动和生存能力的同时测定,采用行之有效的海拉细胞TLR4 dual-luciferase记者一行(31日)。在这个细胞株,Renilla荧光素酶表达的控制下引发催化剂作为衡量TLR4活动,而连续表达萤火虫荧光素酶作为代理标记细胞生存能力。细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM热费希尔科学)包含25毫米葡萄糖,和1毫米丙酮酸钠补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS,很多# 0973 f, Biochrom,柏林,德国),1%青霉素和链霉素(热费希尔科学)$\mathrm{140年}\mu$克毫升⁻¹潮霉素B (InvivoGen)在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37${}^{\circ }$c .对于每一个实验,000每口井的海拉细胞TLR4双重记者被播种$\mathrm{One\; hundred.}\mu$L完成DMEM平底96孔板(格林尼,Frickenhausen,德国)。第二天,细胞治疗与本地或修改过敏原的最终浓度的解决方案$30.\mu$克毫升⁻¹。的样本稀释培养基添加相同量的细胞。中、mock-treated过敏原和卵子作为消极的控制,和有限合伙人大肠杆菌(ng LPS-EB 25毫升⁻¹,InvivoGen)作为积极的控制。7 h孵化后,细胞被洗$\mathrm{200年}\mu$L温暖杜尔贝科的PBS含有钙和镁(热费希尔科学),其次是溶解细胞使用1$\times$被动裂解缓冲(组件Dual-Luciferase®记者试验系统,Promega,曼海姆,德国)和冻结$-\mathrm{80年}{}^{\circ }$C在一夜之间。的Dual-Luciferase®记者化验分析Renilla和萤火虫荧光素酶记者活动执行后,制造商的协议(Promega)。发光信号测量在一个协同Neo板读者(Biotek,坏Friedrichshall,德国)。计算归一化TLR4活动,TLR4-driven Renilla荧光素酶(TLR4)信号除以萤火虫荧光素酶信号,代孕标记细胞的生存能力。产生的值被规范化的价值LPS-treated细胞,设置为100%。计算的可行性,萤火虫荧光素酶(可行性)信号除以萤火虫荧光素酶治疗细胞和乘以100的信号。两个独立的实验进行了一式三份。TLR4激活的剂量反应关系Phl p 5了额外的实验最终浓度为0.25,0.5,1、2.5、5、15、30日和$\mathrm{One\; hundred.}\mu$克毫升⁻¹本机Phl p 5。

2.7。THP-1-Lucia^TMNF -$\kappa$B细胞和TLR4受体拮抗剂tak - 242

TLR4与THP-1-Lucia抑制实验^TMNF -$\kappa$B细胞(InvivoGen)。这永生的修改THP-1细胞系允许NF -的决心$\kappa$B激活通过测量荧光素酶分泌的活性。细胞生长在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中包含25毫米(热费希尔科学)葡萄糖和1毫米丙酮酸钠和10% heat-inactivated的边后卫,$\mathrm{One\; hundred.}\mu$克毫升⁻¹Zeocin™(InvivoGen), 1%的青霉素和链霉素在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37${}^{\circ }$c .对于每一个实验,每被播种在100000细胞$50\mu$L在乘96孔板中。抑制TLR4信号,细胞在重复pre-incubated 500海里的TLR4拮抗剂tak - 242(25毫米二甲亚砜(DMSO),默克密理博,稀释介质)4 h。介质和介质和DMSO ($4.4\mu$克毫升⁻¹,Sigma-Aldrich)作为消极的控制。ng LPS-EB超纯(25毫升⁻¹InvivoGen)作为一个积极的控制。随后,细胞被孵化$30.\mu$克毫升⁻¹Phl 24 h p 5或控制样品。NF -活动$\kappa$B被QUANTI-Luc测量^TM试剂(InvivoGen)根据制造商的指示。简单地说,$10\mu$L(细胞培养上清液转移到一个白色板(LUMITRAC^TM,他一一)和混合$50\mu$L (QUANTI-Luc^TM试剂。协同Neo的发光检测板的读者。对于每一个实验,LPS-treated细胞作为积极控制和算术平均设置为100%。这个值被用于标准化的测量结果Phl 5 p和媒介控制。算术平均值和标准偏差计算归一化值的三个独立的实验中执行一式三份(样品没有tak - 242)或副本(样本tak - 242)。评估细胞的生存能力都使用了alamarBlue™细胞生存能力试剂(热费希尔科学)根据制造商的协议。激励是在560 nm,排放测量在590 nm协同Neo板读者。细胞对DMSO中没有显示NF -$\kappa$激活或毒性作用。

2.8。统计分析

GraphPad棱镜版本9.0.1(美国GraphPad,圣地亚哥,CA)是用于统计分析。未配对t进行观察本机和ONOO之间的差异^{- - - - - -}修改后的蛋白质。

3所示。结果

3.1。硝化和低聚

两个主要的过敏原Bet v 1和5暴露在ONOO Phl p^{- - - - - -}在水相。分析了蛋白质硝化反相色谱,凝胶电泳和蛋白质齐聚反应进行了分析。蛋白质硝化在本机和修改样品的蛋白质,和酪氨酸硝化度量化进行了总结表1。酪氨酸硝化程度(ND)被定义为硝基酪氨酸的浓度除以酪氨酸和硝基酪氨酸(浓度之和40)。本机Bet v 1和Phl p 5样品有较低的平均NDs的< 0.5%。修改后的样本不纠正这些值。修改后的样品,NDs随着ONOO摩尔比例的增加而增加^{- - - - - -}酪氨酸残基(1/1,3/1,5/1),达到最大的二重唱的$\sim$(Bet v 1)和27%$\sim$24% (Phl 5页)。观察到的NDs是在良好的协议与以前的研究(23,24)。

蛋白二聚体和更高的寡聚物改性样品的观察过敏原(表1,图S1)。本机蛋白质不包含二聚体或低聚物。的ONOO^{- - - - - -}修改Bet v 1样本,更高的二聚体和低聚物分数被发现的样本修改ONOO摩尔量较低^{- - - - - -}酪氨酸(1/1、3/1),这可能是模仿人体中更现实的场景。Phl p 5、二聚体和低聚物ONOO后分数^{- - - - - -}修改表现出同样高的值,并同意与回et al。(24凝胶排阻层析法),用于蛋白质的测定低聚物质量分数的修改Phl p 5。

除了硝化、二聚和寡聚化,蛋白质与氧化剂的反应也会导致氧化产品和蛋白质降解。保留时间的变化和扩大ONOO后反相色谱峰宽度的^{- - - - - -}修改显示疏水性的变化、变性,部分展开,形成复杂的反应产品包括骨料和片段(图S2)。

3.2。TLR4激活

TLR4激活本地和修改过敏原测定海拉TLR4 dual-luciferase记者稳定细胞系细胞生存能力的同时测定。图1显示本地和ONOO^{- - - - - -}修改不激活TLR4 Bet v 1。本机Phl p 5表明TLR4激活,并与不同数量的ONOO化学改性^{- - - - - -}(1/1,3/1,5/1)增加了TLR4激活Phl p 5的因素$\sim$1.5 (1/1),$\sim$1.7 (3/1),$\sim$2.1(5/1)指示ONOO相关受体蛋白质相互作用的变化^{- - - - - -}修改。所有样本包含小于0.25欧盟内毒素$\mu$克的蛋白质,由于有限合伙人内容可以排除假阳性结果。的mock-treated Phl p 5表明TLR4的激活增加的一个因素$\sim$1.1,表明样品处理诱导蛋白质的变化影响与TLR4的交互。媒介的负面控制以及本地ONOO^{- - - - - -}修改卵白蛋白(OVA)表现出没有实质性的TLR4激活和应用蛋白质浓度并不影响细胞的生存能力图S3)。额外的实验用不同剂量的原生Phl p 5显示增加剂量依赖的TLR4激活(图2),没有应用蛋白质浓度对细胞生存能力的影响图S4)。Phl p的TLR4激活5在最高浓度($\sim$46%$\mathrm{One\; hundred.}\mu$克毫升⁻¹)和5/1 ONOO^{- - - - - -}修改Phl p 5 ($\sim$43%$30.\mu$克毫升⁻¹)也同样高(图1和2)。抑制TLR4的拮抗剂THP-1-Lucia tak - 242^TMNF -$\kappa$NF - B细胞减少$\kappa$B反应77% (图3)确认NF -$\kappa$B激活引起Phl p 5 TLR4介导的。

4所示。讨论

TLR4在炎症过程中起着核心作用,认识到广泛的病原体——和有关分子包括细菌脂多糖(LPS)导致促炎介质的释放。大量研究表明TLR4在过敏性疾病的发病机理的作用(32,35,42- - - - - -46)。直接激活TLR4通过为屋尘螨过敏原报道蛋白质Der p 2和Der 38 (47- - - - - -49),小麦淀粉酶胰蛋白酶抑制剂(ATI,贝克的哮喘)(50金属镍)和(51)。我们发现TLR4激活的草花粉过敏原Phl p 5,但不是桦树花粉过敏原Bet v 1。过氧亚硝基改性增强Phl p的TLR4激活5,这是与以前的研究结果相一致,表明,ONOO^{- - - - - -}修改会导致增加TLR4 TLR4刺激蛋白质ATI的激活,$\alpha$-核蛋白,热休克蛋白60岁,高机动组框1蛋白(9,31日)。Phl 5 p可能充当多价TLR4配体由于其两个域结构,因此可能会有效地促进TLR4二聚作用和激活。增强TLR4的激活mock-treated Phl p 5可以表明,折叠或蛋白质变性导致更好的TLR4交互变化随着mock-treated Phl p 5展出一个ND类似低至本机Phl p 5和行为作为一个单体非还sds - page (表1,图S1)。TLR4的增加激活与增加ONOO Phl 5页修改^{- - - - - -}酪氨酸比率可能会从增强与ONOO相关蛋白质降解^{- - - - - -}浓度(23,40,52)。二聚体和寡聚物将发挥作用增强的TLR4激活二聚体和低聚物分数表现出同样高的值由三个不同的ONOO Phl 5页修改^{- - - - - -}酪氨酸的比率(表1)。TLR4的同时增加激活和硝化程度ONOO越来越多的应用^{- - - - - -}(图1,表1),然而,表明除了退化和构象变化,还酪氨酸硝化可能发挥作用在增强TLR4 ONOO激活^{- - - - - -}修改Phl p 5。比酪氨酸硝基酪氨酸是酸性更强,化学和生理属性等蛋白质的等电点和绑定在硝化(受体和配体可以改变25,27,30.,31日,53)。需要进一步调查以确定以及硝基酪氨酸对TLR4激活的增强Phl p 5。

结果表明,草花粉过敏原Phl p 5直接激活TLR4和ONOO化学改性^{- - - - - -}增强了TLR4激活,因此潜在的炎症Phl p 5。直接由Phl TLR4激活p 5可能发挥作用在敏化对草花粉变应原和氧化应激和炎症期间变得尤为重要。如果Phl p 5是化学改性ROS / RNS形成氧化应激期间,先天免疫反应可以通过正反馈循环增强通过TLR4信号(9,54)。这种放大的先天免疫反应可能导致增加草花粉变应原致敏。还需要进一步的研究来更好地理解和识别早期的和最重要的交互修改过敏原与广泛的模式识别受体可能导致敏感的上皮细胞。此外,它也是很有必要分析IgE抗体的绑定和过敏反应是如何调制化学改性的过敏原。了解环境的风险因素如空气污染,直接或间接通过氧化应激,影响蛋白质的过敏可能是至关重要的保护公共卫生在人类世,即当前的全球时代地球上无处不在的人为影响,因此,在整个人类环境(5,55,56)。此外,深入理解了过敏原的化学修饰和相关的免疫反应也可以帮助治疗发展的免疫疗法。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:本研究的数据集可以在Edmond-the开放存取数据存储库马普学会的https://doi.org/10.17617/3.98W1BB(57)。

作者的贡献

KR-S、KL, JF-N设计实验。KR-S,所有,作为、NB和KZ进行了实验。KR-S、IB、MW、KL, JF-N分析和解释数据。KR-S写了初稿,JF-N写了最终版本的手稿。所有作者都参与稿件的编辑和校对。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作由马克斯·普朗克的社会。支持的IB是德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)授予4504/3-3。

确认

作者承认帮助与美因茨的成员讨论项目化学变态反应学(MPCA)由c . s . Krevert和N.-M和技术支持。Kropf。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

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引用