hiv - 1感染的主要目标UV-induced完全丧失:单链RNA包膜病毒的模型研究

介绍

在各种环境中病原微生物的消毒对公共卫生是至关重要的。不仅是至关重要的在这个特定COVID-19大流行期间还在其他时间一般和高效anti-infectious疾病的策略。的几个常用的消毒剂,包括热量和酒精,深紫外线(UV)是一个节省时间的和有效的手段/消毒灭活微生物如细菌和病毒(1- - - - - -3)。我们和其他人已经表明,紫外线是有效的灭活的病毒包括SARS-CoV-2 (4- - - - - -8)。紫外辐照灭活微生物可以应用于不同的环境,如公共空间和水,通过使用不同种类的光源与不同的能源与代理光敏剂或结合。

基于波长,紫外线是分为a(315 - 400海里),UV - b (280 - 315 nm), UV-C(200 - 280海里)。对紫外线a灭活微生物的光化学代理如二氧化钛和amotosalen盐酸。这可能是由于诱导氧化应激通过活性氧的生产(9- - - - - -11)。uv - b和UV-C接近吸附核酸的峰值在265海里,可以吸收病毒基因组(DNA或RNA)。完善,紫外线损害RNA通过光化学修饰等核苷酸嘧啶二聚体的形成,并通过交联RNA-RNA和RNA蛋白质(12- - - - - -18;审核,请参阅19,20.)。UV-C低波长的254和222海里也表现出抗菌活动(21,22;审核,请参阅19,20.)。UV-C也一直报道降解的主要外部病毒蛋白质衣壳噬菌体一份(非包膜病毒RNA),猫杯状病毒(非包膜病毒RNA),和鼠标诺瓦克病毒(非包膜病毒RNA)的氧化,而人类腺病毒(非包膜病毒DNA)的蛋白质,杜兰病毒(非包膜病毒RNA)和轮状病毒(非包膜病毒RNA)不是UV-C辐照影响(23- - - - - -27)。SARS-CoV-2(包膜RNA病毒),而病毒粒子形态暴露于紫外线似乎是不变,紫外线是否会影响病毒蛋白和N尚未得出结论(28,29日)。此外,信封的完整性丙型肝炎病毒包膜RNA病毒)不受紫外线照射,而紫外线可以作用于脂质构成的信封单纯疱疹病毒(包膜病毒DNA) (30.,31日)。研究迄今为止广泛研究了紫外线的影响明显变化,完整性丧失,或者减少水平的病毒粒子组件。然而,即使病毒蛋白和信封不是显然受到紫外线,紫外线可能会影响病毒粒子的活动和功能组件病毒复制所必需的。在这方面,目标直接相关的损失由紫外线需要确定病毒的传染性。

我们报道的定量评价SARS-CoV-2失活的三波长的紫外线(265、280和300海里)通过计算剂量的紫外线能量辐射病毒本身通过文化传媒(8)。在我们之前的研究中,我们绝对显示紫外线辐照时间的长度,波长,所需剂量的紫外线是什么SARS-CoV-2失活。我们独特的和有用的紫外辐照设备使我们能够定量评估病毒性传染性减少。如上所述,紫外线照射会影响蛋白质,脂类和核酸。当然,大量紫外光照射诱发病毒性传染性的损失和负面影响蛋白质,脂类和核酸。对于包膜病毒hiv - 1和SARS-CoV-2,如果紫外线有害地和决定性影响脂质和信封(Env)蛋白质,主要组件的病毒信封,条目的过程也将受到限制。在这项研究中我们的目的是澄清哪个组件受紫外线影响的病毒粒子明显与病毒性传染性的损失,这将提供病毒失活的一个重要方面。为此,我们利用单链RNA包膜病毒hiv - 1作为一个模型。hiv - 1逆转录酶可衡量的(RT)和p24蛋白在病毒粒子,和各种实验系统精确地分析每个病毒复制步骤已经完善了hiv - 1 (图1)。照射后细胞游离病毒粒子,我们可以研究紫外线的直接影响在病毒粒子组件包括信封、酶活性和RNA基因组(图1)。通过病毒学分析,我们证明紫外线可以影响酶活性的病毒蛋白,但不输入过程,这病毒传染性的损失主要是源于UV-induced基因组损伤。

材料和方法

细胞

单层细胞系HEK293T(写明ATCC crl - 1573)和HeLa-derived记者TZM-bl (32)培养和维护在鹰的最小基本培养基含有10% heat-inactivated胎牛血清(的边后卫)如前所述33)。淋巴细胞行M8166培养和维护在RPMI 1640中包含10% heat-inactivated的边后卫。

病毒的准备工作

hiv - 1病毒克隆pNL4-3 (34)和pNL-Kp(一个env缺乏克隆)(35)被用于这项研究。前病毒的克隆被磷酸钙转染到HEK293T细胞共同沉淀方法如前所述(34,36)。病毒含量测定virion-associated RT化验如前所述(36,37)。量化的Gag-CA (p24)水平,一个hiv - 1 p24抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(ZeptoMetrix公司)根据制造商的协议。必要时,hiv - 1病毒股重组DNase对待我(RNase-free)(豆类生物INC .)去除转染质粒DNA的污染。热处理病毒股由孵化15分钟的65°C。

紫外线照射

与三个不同的波长紫外辐照装置(265 nm、280 nm和300 nm),之前我们做了(8),被用于这项研究。我们的辐照设备携带紫外线发光二极管(LED)。UV-LED芯片病毒剂的距离约为30毫米。的紫外线UV-LED平行的反射和辐射。UV-LED辐照区域是大到足以获得均匀辐照。这些设备使我们能够估计剂量辐照的病毒本身计算透射系数通过培养基(8)。确保重复和复制UV-LED光辐照,病毒解决方案是放置在一个定义的一个96孔板室,并设置直属UV-LED辐照。紫外线照射前,包含2%的病毒和PBS个股适当稀释的边后卫(10⁴RT单位/ 100μL)。稀释样品暴露在紫外线辐照功率密度不同的每个波长适当的时间(8)。

病毒的传染性试验

TZM-bl细胞(5×10³/)被播种到96孔板和培养过夜。紫外线照射过的病毒样本接种的细胞。病毒样本没有任何与热处理被用作治疗和控制。感染后第2天,细胞溶解产物准备荧光素酶化验(Promega)如前所述33)。hiv - 1传染性计算作为一个相对光单元(RLU)紫外线或热处理的病毒样本相对于没有任何治疗。

进入试验

从转染HEK293T细胞病毒股准备,稀释(10⁵RT单位/ 100μL PBS中含2%的边后卫),然后使用紫外线照射。热处理病毒股票也以同样的方式稀释。条目分析进行了类似于前面描述的(38- - - - - -40)。简而言之,200μL每个样本接种成M8166细胞(2×10⁶),细胞培养2 h在4°C,广泛地洗,收集病毒绑定分数。测量大量的病毒进入,孵化后在4°C以上,细胞使胰蛋白酶化的5分钟37°C,广泛地洗,孵化2 h在37°C收集病毒条目分数。细胞收集绑定和条目分数是p24 ELISA细胞溶解。每个样本的输入效率计算的p24级别条目分数/ p24绑定的一部分。NL-Kp(δEnv)和热处理病毒被用作控制。

半定量rt - pcr分析

评估基因组由紫外线伤害,半定量rt - pcr分析类似于前面描述的(33,41)。简而言之,DNase我对待病毒股稀释并受紫外线照射。热处理病毒样本被用作控制。病毒基因组被隔离的样本使用QIAamp病毒RNA迷你包(试剂盒GmbH)和反向转录通过使用混合引物(益生元(dT)和随机六聚体)和上标三世第一链合成系统(生命技术公司)。引物对用于半定量rt - pcr分析如下:底漆设置(向前)(GGCCTGAAAATCCATACAAT)和(反向)(TCTAAAAGGCTCTAAGATTTTTGTCAT);引物组B(向前)(CTTGGCACTAGCAGCATTA)和(反向)(CTGGATGCTTCCAGGGCTCT);引物组C(向前)(GGAATAACATGACCTGGATG)和(反向)(CGCAGATCGTCCCAGATAAGTG);引物组D(向前)(GAGGATTGTGGAACTTCT)和(反向)(CTAGGTCTCGAGATACTGCTC)。获得PCR产品放大在线性范围内,仔细PCR反应的周期数是决定使用一个控制样本没有紫外线辐射(33,41)。负控制半定量rt - pcr是由逆转录紫外线照射过的或热处理的样品没有任何底漆。PCR扩增子分离比喻2%琼脂糖凝胶(Lonza有限公司),并与溴化乙锭染色。PCR扩增子的信号强度量化使用Amersham成像仪600仪器(英国通用电气医疗集团有限公司)。病毒RNA样品没有辐照和热处理,PCR产品的信号强度的计算是通过减去每一个负面的信号强度控制每个样本的。

结果

试验大纲

检查紫外线的直接影响组件的hiv - 1病毒粒子,游离病毒粒子被暴露于紫外线使用辐照设备(图1)。首先,我们定量地评估能量剂量的uv和三个波长(265 nm、280 nm和300 nm)减少所需的病毒传染性。uv辐照条件下,给一个大约一半减少病毒传染性的病毒传染性或完全丧失,下定了决心。然后,我们检查病毒组件上的uv /函数的影响(virion-associated RT活动和p24完整性和输入能力)辐照条件下我们决定。最后,UV-induced基因组损伤调查使用互补脱氧核糖核酸合成半定量rt - pcr分离到的病毒RNA病毒粒子游离暴露于紫外线在确定条件下。

定量评价hiv - 1失活的紫外线照射

研究病毒组件负责减少紫外线的传染性,我们使用hiv - 1的实验系统分析其复制步骤建立了。我们第一次定量评估剂量依赖性降低病毒传染性使用我们UV-LED辐照设备主要波长(265、280和300海里)。为什么我们选择这三个波长在这项研究如下:265纳米是一个吸收峰波长的rna,失活的影响必须UV-C地区最大。280纳米是一个吸收峰波长的蛋白质,在280 nm和rna也有适度的吸收。此外,LED在280 nm力量和生命周期在商业产品的优良特性。300海里远rna和蛋白质的吸收峰,这可以作为控制。病毒是准备从HEK293T细胞转染前病毒的克隆。病毒的传染性暴露于紫外线测量使用HeLa-derived TZM-bl细胞系。TZM-bl细胞表达CD4和coreceptors艾滋病毒受体CCR5 / CXCR4和携带终端repeat-driven荧光素酶基因(32)。在感染,HIV-coded答蛋白质trans-activates TZM-bl细胞荧光素酶的表达情况,从而可以测量传染性在荧光素酶的活动。热处理的病毒,它有不同的失活过程从紫外线,被用作控制(29日)。三波长的紫外线的功率密度是由初步实验给类似的荧光素酶活性水平相同的辐照期间(0.47 mW /厘米²265海里,0.73 mW /厘米²280海里,1.50 mW /厘米²300海里)。的左面板所示图2,与紫外线辐照样品20秒在每个波长,病毒传染性降低20 ~ 40%相对于没有辐射。延长辐照期进一步减少病毒的传染性。没有检测到病毒感染暴露于紫外线三波长为160秒或加热处理。符合我们之前的结果SARS-CoV-2失活(8),病毒性传染性同样减少了紫外线的能量剂量为265 nm和280 nm),而高剂量需要完全丧失的病毒性传染性在300 nm (图2右面板)。

紫外线照射可以降低hiv - 1逆转录酶的酶活性(RT),但这并不能解释传染性的损失减少

hiv - 1病毒粒子的核心是由Gag-p24蛋白在病毒复制扮演重要角色,也包含两个单链RNA基因组的副本和两种酶,RT和整合酶,对于早期复制阶段(42)(图1)。紫外线的抑制性影响活动/ RT或Gag-p24功能,如果有的话,很可能会削弱hiv - 1复制。检查紫外线如何影响病毒的RT活动和p24水平,准备从病毒转染HEK293T细胞暴露在紫外线20和160秒以固定每个波长的功率密度,导致减少到20 ~ 40%和传染性的完全丧失,分别为(图2)。我们第一次监控Gag-p24水平的病毒样本所示图3。热处理病毒Gag-p24水平明显下降。紫外线照射过的样品测试表现出类似Gag-p24水平,没有辐射,虽然Gag-p24水平略微降低了样品暴露在280 nm和300 nm紫外线为160秒(图3)。一方面,在热处理undectable病毒RT活动如预期的那样,和一个更长的三个波长的紫外线照射时间导致RT活动下降,尤其是对160秒的UV射线280 nm和300 nm (图3)。RT活动相比,适度降低到60%左右,没有辐射。这里的结果表明可能有紫外线对病毒蛋白的影响在一个波长,剂量依赖性的方式。据报道,一些hiv - 1 RT突变体活动相对于野生型病毒可以适度一半在淋巴细胞细胞复制(主细胞和MT-2) (43)。综上所述,这些结果表明,紫外线可以诱导酶活性下降和/或病毒蛋白质的变性,这些病毒蛋白的变化并不直接导致病毒性传染性的完全丧失。

紫外线照射不影响hiv - 1输入过程

自一个hiv - 1病毒粒子组成的一个信封大量脂质双分子层和病毒信封Env蛋白质、病毒进入过程预计将阻碍如果紫外线不利影响这些组件。据报道,没有紫外线照射对病毒结合细胞的影响是无包膜杜兰观察病毒和轮状病毒和流感病毒包膜(27,44)。功能性hiv - 1 Env的三聚物组成的异质二聚体Env-gp120 Env-gp41,由解理的前体Env-gp160 furin或furin-like蛋白酶在高尔基体(42)。hiv - 1 Env-gp160已被证明有CD4绑定功能但不入口能力(45,46)。因此,有必要检查条目潜力Env的功能。确定病毒Env暴露于紫外线功能,条目进行了分析。自从Gag-p24水平没有明显改变紫外线照射后(图3),输入效率计算通过测量大量的病毒结合使用Gag-p24 ELISA和入口。Env-deleted或热处理病毒样本作为消极的控制。病毒样本被暴露于紫外线三波长与一个固定的功率密度为160秒,导致传染性的完全丧失(图2)。所示图4、热处理病毒binding-incompetent,从而效率没有检测到。Env-deficient病毒样本的输入效率大幅减少。值得注意的是,病毒暴露于紫外线仍然显示类似的条目效率水平,没有辐射,即病毒Env全功能甚至在紫外线照射在致命的水平。重要的是,这里的结果表明,hiv - 1感染的完全丧失的障碍不是解释Env函数通过紫外线的不利影响Env蛋白质和/或脂质影响。

病毒基因组受到紫外线照射,导致病毒传染性的损失

迄今为止在这个研究结果表明,紫外线可以适度RT活动,影响hiv - 1病毒核心和信封仍然是功能正常后足够的紫外线照射引起传染性的完全丧失(图1- - - - - -4)。众所周知,紫外线损害RNA等通过光化学修改病毒基因组核苷酸嘧啶二聚体的形成,并通过交联RNA-RNA和RNA蛋白质(12- - - - - -18;审核,请参阅19,20.)。分析基因组由紫外线损伤,据报道,传统RT-qPCR放大128 bp的PCR产物NSARS-CoV-2基因组的基因区域,未能检测病毒基因组损伤(28)。这是因为PCR产物的长度太短,检测基因组损伤(28)。因此,调查之间的相关性降低病毒传染性和基因组损伤,进行了半定量rt - pcr分析。底漆集用于分析旨在扩大四个不同区域长度(~ 0.4 kb),并使我们能够检查是否位置的差异和/或基因组的序列影响UV-induced损坏(图5和补充图1)。病毒暴露在紫外线与一个固定的功率密度20和160秒,这导致减少60 - 80%,完全失去传染性,分别为(图2)。热处理病毒被用作控制。与以前的报告(一致29日在致命的级别),热处理没有强烈诱导基因组损伤(图5和补充图1)。较长的三个波长的紫外光照射有关PCR产品的信号强度较低,这表明基因组损伤与减少传染性。这可能是由于低效使用UV-damaged互补脱氧核糖核酸合成RNA基因组(修改核苷酸和交联)作为一个模板。众所周知,RNA质量影响互补脱氧核糖核酸合成了RT的效率和质量,和随后的PCR反应也受到影响。这种自卑UV-damaged的互补脱氧核糖核酸合成RNA可能负责抑制/失败之后的PCR扩增。所有病毒样本暴露在300 nm紫外线相比相对较高的信号强度在265和280 nm紫外线辐照,暗示疲软伤害在300 nm紫外线辐照和基因组的不同疗效紫外线波长的影响。这个结果可以解释为什么一个更高层次的能量所需剂量的紫外线在300 nm hiv - 1失活。总之,结果表明,UV-induced基因组损伤主要负责传染性的损失。

讨论

由紫外线对病毒失活,其影响病毒成分包括基因组损伤和蛋白质降解已报告(审查,请参阅19,20.)。然而,是否不利影响紫外线对病毒的活动和功能组件可导致病毒性传染性的损失已经糟糕的记录。为了解决这个问题,我们调查的主要目标由紫外线使用hiv - 1病毒失活模型单链RNA包膜病毒。减少hiv - 1传染性是定量评估使用我们UV-LED辐照设备有三个波长(265、280和300海里)。这些设备的功率密度是固定的给减少60 - 80%左右,无法检测到的水平辐射紫外线的传染性病毒20和160秒,分别。在这种情况下,Gag-p24水平没有显著影响,而RT活动逐渐减少病毒样本暴露于紫外线,特别是在280年和300海里。这种减毒RT活动没有解释传染性的完全丧失,因为它已被证明是仍然能够支持细胞中病毒复制(43)。意外,我们进入化验表明,即使对病毒粒子暴露于紫外线在致命的层面,进入流程正常进行,表明没有明显的紫外线对病毒的功能Env蛋白质和脂类组成。与这些病毒成分,病毒基因组损伤由紫外线照射是传染性的损失明显相关。此外,能量更高剂量的要求在300纳米的紫外线病毒失活可能与实力较弱的病毒基因组损伤相比,那些在265年和280海里。在hiv - 1生命周期方面,紫外线照射游离病毒粒子可以直接损伤tRNA底漆和病毒基因组RNA病毒粒子。这些受损的RNA将不是一个好模板/引物互补脱氧核糖核酸合成与RT和tRNA底漆在hiv - 1感染的细胞。因此,紫外线照射过的传染性病毒粒子损失很可能由于抑制逆转录过程通过UV-induced损害RNA病毒基因组和tRNA等。总之,我们清楚地展示在这里,病毒基因组损伤是一个主要的目标UV-induced hiv - 1感染的完全丧失。

尽管紫外线可以攻击病毒蛋白质和脂质,这是信封的组件,我们进入试验表明紫外线不会影响hiv - 1进入细胞。一个噬菌体一暴露在紫外线已被证明附件能力但减少进入细菌基因组渗透能力(47)。这可能是由于不同的方法用于分析条目的过程。在我们的分析中,病毒是通过测量评估Gag-p24水平不受到紫外线的影响,而对于一份,基因组渗透检测定量PCR进行监控。或者,它可能是由于入口过程之间的差异为hiv - 1和噬菌体基因组渗透膜融合。病毒蛋白的破坏程度可能不同的光敏感蛋白本身和剂量的紫外线波长和能量。事实上,RT活动倾向于减少hiv - 1病毒粒子暴露紫外线,特别是在280年和300海里,有更高的能量剂量相对于265海里。这意味着紫外线可以影响酶活性的病毒蛋白质在波长和能量摄入量有关,虽然它不直接与传染性的丧失有关。

hiv - 1基因损伤的程度由紫外线相关传染性的损失。在我们的半定量的分析(图5),为引物PCR产品组D还检测到的病毒样本暴露于紫外线三波长为160秒。PCR扩增的效率是不同的引物之间集C和D,被设计在病毒基因组上的位置。这表明,基因组可能不同的损害程度的放大区域的基因组序列。在这方面,我们设计了引物的原因在病毒基因组相邻位置的比率连续嘧啶核苷酸(UU)两个区域是不同的(8.2% C和D组为4.3%)。考虑到形成嘧啶二聚体的紫外线,较高的UU序列可能导致大量的PCR产物的减少。的确,UU区域内设置D序列的比例(4.3%)低于内设置一个(7.4%)和B (5.7%)。有一些报告的预测基于核苷酸序列(紫外敏感性20.)。这种预测方法的建立将有助于开发更有效的和有效的紫外线灭活技术。还需要进一步的研究来检验是否更高比例的UU基因组序列与较高的伤害。基因组损伤通过紫外线已经报道了各种病毒(审查,请参阅19,20.)。我们在SARS-CoV-2基因组损伤很感兴趣,因为我们有报道的定量评价SARS-CoV-2失活三个波长的紫外线(8)。在前面的研究中,我们表明,探测不到SARS-CoV-2传染性由空斑实验是通过不同的紫外线能量剂量在不同波长(3 mJ /厘米²265海里,5 mJ /厘米²280海里,30 mJ /厘米²300海里)。这些紫外线能量所需剂量SARS-CoV-2失活在7到10倍低于hiv - 1 (50 mJ /厘米²265和280 nm和200 mJ /厘米²300海里)(图2)。数据不一定意味着SARS-CoV-2更易受紫外线照射而hiv - 1。尽管两种截然不同的敏感性分析方法使用不同的病毒/细胞是绝对比不上,所需的紫外线能量剂量的差异对hiv - 1和SARS-CoV-2失活可以占传染性的敏感性分析使用(荧光素酶的表达与斑块的形成,分别)。基因组损伤SARS-CoV-2在我们实验室进行半定量rt - pcr分析使用每个条件下样品暴露于紫外线灭活SARS-CoV-2和hiv - 1 (补充图2)。两个区域,orf1b和核衣壳,针对SARS-CoV-2基因组PCR扩增。所有PCR产品放大还检测到病毒样本暴露在紫外线能量剂量导致的损失SARS-CoV-2传染性(3 mJ /厘米²265海里,5 mJ /厘米²280海里,30 mJ /厘米²300海里),虽然PCR产品减少的信号强度比那些没有辐射。正如所料,PCR产品检测不到病毒或略可检测样品与紫外线辐照致命水平的能量剂量对hiv - 1 (50 mJ /厘米²265和280海里,200 mJ /厘米²300海里)。再一次,这些结果强调我们的结论基因组紫外线是病毒失活的主要决定因素的损害,因为在一个致命的病毒粒子暴露于紫外线水平hiv - 1仍然保留Gag-p24水平和能力进入细胞(图3和4)。RT - PCR分析,RT PCR酶可用于核酸扩增实验是强大的工具。由紫外线的病毒失活,我们可能需要谨慎考虑是否严重的基因组损伤,不能放大了rt - pcr病毒消毒/失活是必要的。避免过量的紫外线灭活病毒会导致减少紫外线对环境的影响和光源和电力的浪费。

在这项研究中,我们表明,hiv - 1是灭活的,即使没有明显的破坏蛋白质和脂类组成病毒粒子通过紫外线照射。之间的关系来确定病毒失活和剂量的紫外线能量,我们有适当的量化紫外线辐照病毒本身的实际剂量辐照功率密度-通过测量值的光文化传媒(本研究和吸光度8)。然而,紫外线照射在病毒失活的功效会受到环境/条件的影响周围的病毒粒子,例如病毒粒子在空气中,液滴,或血液。还需要进一步的研究来解决这个问题,考虑环境因素的影响紫外线对病毒失活。紫外线是一种高度有效的消毒/灭活病原微生物,如hiv - 1和SARS-CoV-2,基因组损伤。实际上,有商用与紫外线血液光化学处理系统,减少血液病原体(48)。我们的设备和数据将有助于确定能源所需剂量的紫外线消毒/失活的病原体。未来问题UV-based失活将包括什么样的灯用在什么情况下使用它,考虑到波长和功率,光源、性能、成本和对人体的影响。有必要考虑如何有效且高效地用于紫外线公共空间和临床网站。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步调查可以直接到相应的作者。

作者的贡献

TM和MN促成了实验设计。TK、ND和锰进行了实验。KN,泰,TM促成了紫外线辐照装置。AA、TM和MN最初写的手稿。TK, ND,泰,肯塔基州,AA, TM和锰进行了数据分析。所有作者导致编辑的手稿。

资金

这项工作的支持如下:日本医学研究和开发署(艾湄湾)艾滋病研究项目(21443907和21443907);医学研究从武田科学基金会资助;项目在促进地区产业和大学,内阁办公室,日本(行业推广的计划和年轻人的就业由下一代的创建和应用光子学德岛县);德岛县Industry-Academia-Government协作研发费用补贴,对新型冠状病毒对策,从德岛县等政府、日本;JST适应性和无缝技术转让项目通过目标导向的研发(一步)从日本科学技术振兴机构(JST),日本(批准号:JPMJTM20Y8)。

确认

我们感谢弥生Shono实验援助。我们也感谢乾佑哉吉田合子和恭子编辑援助。我们感谢支持中心先进的医学科学,生物医学科学研究所,德岛大学研究生院的实验设施和技术援助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fviro.2022.994842/full补充材料

引用