孕激素对先天免疫和细胞死亡的影响经过2009年甲型流感病毒H1N1感染的肺部和胎盘细胞在体外

简短的传记——“女性在平移病毒学”专题

米兰达李女士毕业于哥伦比亚大学纽约的哥伦比亚大学生物科学学士学位在2022年。她现在是一年级医学生华盛顿大学医学院的西雅图,华盛顿。她的研究经验,华盛顿大学的博士的指导下克里斯蒂娜·亚当斯华德福已经睁开眼睛迷人的平移病毒学领域,特别是对孕妇的脆弱性传染病。她花了几个夏天,部分COVID-19流行远程上课而在亚当斯华德福实验室工作。

亚当斯博士华尔道夫酒店是一个妇产科教授和兼职教授在华盛顿大学全球健康。她在病毒学研究经验开始作为一个本科。虽然她去医学院和训练作为一名妇产科医生,病原体和宿主反应有浓厚兴趣的人从未离开她。在过去的20年里,她建立了一个程序在怀孕研究传染病的发病机理,以及治疗的有效性和安全性设计保护母亲和胎儿。研究传染病如何利用母源性免疫乳素变化,使胎儿生长,避免总是会拒绝她的研究项目的核心。作为一个导师,她努力满足学员的水平,降低“冒名顶替者综合症”的感觉,让他们为科学的奇妙世界,可以奖励。她的目标是要培养韧性在她的学员,这样他们就可以坚持面对挑战和失望在板凳上经常出现在学术界。看到一个实习生成功事业最有益的方面之一。

介绍

甲型流感病毒感染在怀孕与加剧了孕产妇肺部疾病和不良胎儿结局的光谱(1)。孕产妇死亡的风险增加,住院、早产、围产儿死亡率,和死胎IAV感染在怀孕后已经被记载在许多研究从高收入和中等收入国家(2- - - - - -6)。孕产妇死亡率从IAV可以显著,1918年IAV大流行(约为27%3)。大约一半的死亡病例在生殖期的女性在1957年IAV H2N2大流行是怀孕的人(7)。最近,从2009年甲型H1N1流感大流行病例分析,22%的孕妇IAV感染住院需要重症监护,8%死亡(8)。死产和围产期死亡率也增加IAV感染后,展示在英国国家的孕妇住院2009年甲型H1N1流感大流行期间(2)。机械化,加剧了孕产妇肺部疾病的发病机制和死胎知之甚少,部分由于怀孕的复杂的生理变化,改变免疫生物学。

肺是IAV的主要靶器官。人类肺腺癌细胞系Calu-3已被用来作为特征模型的近端气道上皮细胞的先天免疫反应评估肺呼吸道病毒(9,10)。在初选IAV-infected肺上皮细胞,I型干扰素激活了NRLP3 inflammasome (11)。在几项研究,怀孕的老鼠显示更高水平的炎性细胞因子在肺,更严重的疾病,死亡率和肺部病理比没有怀孕小鼠(12- - - - - -14)。在考虑怀孕病毒感染的发病机理,研究胎盘也是至关重要的。胎盘是一个复杂而immune-rich机关代表胎儿和母亲之间的网关。有几个胎盘细胞系IAV感染的易感性和娇宠地在体外。在妊娠前三个月人类滋养层细胞系HTR-8 / SVneo和Swan71 H1N1/09感染,最小的病毒释放指出,但IAV病毒蛋白质和RNA检测到免疫荧光试验和PCR (15)。H3N2感染相同的细胞系诱导快速凋亡和病毒复制,表明胎盘细胞系特异性差异对IAV-induced CPE (16)。这些证据表明胎盘可能扮演至关重要,以前被忽视的角色在孕产妇流感感染。

激素被认为扮演一个关键的角色在损害产妇适应性和先天免疫,这有助于保护胎儿免受排斥(17)。怀孕期间荷尔蒙的变化是否会影响抗病毒先天免疫反应IAV的肺癌和胎盘是未知的。黄体酮是一个关键immunomodulating激素在妊娠和达到水平在怀孕后期10-30-fold高于成年人没有怀孕。虽然孕酮能表达下调,天然免疫与适应性免疫的程度调节免疫后IAV感染孕产妇肺或胎盘知之甚少(17,18)。孕激素调制的影响在NLRP3 inflammasome激活IAV先天免疫反应的是一个重要的组成部分和过程pro-caspase 1, pro-IL-1β,pro-IL-18进他们的活动形式和涉及IAV infection-mediated死胎,胎儿损伤(19- - - - - -21)。孕激素调制的影响在NLRP3 inflammasome IAV但尚未研究过是观察到的表达减少inflammasome组件在一个短暂的焦大鼠缺血神经元模型(22)。IAV迟钝的先天免疫反应在怀孕可能会导致延迟诱导适应性免疫,并可能增加对严重的肺病IAV后感染的易感性。

这项研究的目的是确定在怀孕孕酮IAV目标的影响,即肺和胎盘,建模的细胞系(Calu-3 ACH-3P)。调查孕激素的作用在怀孕期间感染IAV的先天免疫反应是关键更完全理解为什么孕妇更容易发展严重肺部疾病和死亡以更高的利率比怀孕妇女从流感感染(3,6,7)。本研究提供了洞察这些反应在孕产妇疾病的发病机理中的作用和不良围产期结果。

方法

细胞培养

Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)(写明ATCC) Calu-3细胞(写明ATCC)和ACH-3P在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,消息灵通的25毫米,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升。所有的细胞系在37°C和5%孵化有限公司₂和确认自由支原体MycoAlert™支原体检测设备(Lonza lt07 - 318)。

病毒扩增

甲型流感H1N1病毒(CA / 09)从富勒获得实验室(23)。Sub-confluent层的MDCK细胞T150烧瓶用PBS和感染0.5莫伊(5毫升血清MEM) 37°C和5%的公司₂。1小时后,媒体被移除,细胞被洗1 x PBS和媒体所取代。媒体在36小时收获,离心机在室温下清除细胞碎片(1800 rpm 5分钟然后在3000 rpm 10分钟)。病毒股票冻结在-80°C 1毫升整除。病毒效价的每个股票被TCID50量化测定红血球凝聚读出(下面描述)和转换为空斑形成单位/毫升。将TCID50 /毫升到空斑形成单位/毫升,我们TCID50 /毫升乘以0.7。细胞培养和病毒扩增过程都是根据生物安全二级协议执行。

H1N1感染的靶细胞

Calu-3 ACH-3P细胞(1 x 10⁶细胞/在6-well板块)被播种在一夜之间生长培养基和孵化37°C和5%的公司₂。这些细胞被洗1 xpbs然后感染H1N1在莫伊= 0,0.5,1小时或3。的病毒培养液包括Opti-MEM TPCK-treated胰蛋白酶(0.5μg /毫升,σ)。进行滴定曲线以确定病毒的最优TPCK-trypsin浓度最大可容许性和最小细胞单层。接种后,细胞用1 xpbs洗净,然后用无血清培养基补充(Opti-MEM)补充TPCK-treated胰蛋白酶(0.5μg /毫升,σ)。样品被允许孵化为0 - 24和48小时感染后。孕酮治疗组,细胞治疗与100 nM P4 (24)24小时pre-infection和0 - 24和48小时感染后。上层清液样本离心机、整除、储存在-80°C和未来分析4°C。细胞颗粒悬浮在500μL QIAzol裂解试剂(猫# 79306、试剂盒、希尔登,德国)或500μL 0.1% Triton-X 100(猫# AC215682500,费舍尔科学、沃尔瑟姆,MA)和存储在-80°C。

红细胞凝集试验

每个浮层的病毒载量样本被log10 TCID量化₅₀红细胞凝集试验宣读。总之,75μl 0.33%土耳其红细胞(猫# TBA030,止血剂,迪克逊,CA),孵化了25μl样本在不同稀释1小时在4°C。积极的阅读是由分散的悬浮红细胞的定义。TCID₅₀宣读计算根据咀嚼方法(25)。Log10 TCID₅₀值被转换成空斑形成单位/毫升感染乘以0.7 (26)。

LDH测定

病毒感染细胞死亡的评估与乳酸脱氢酶(LDH)测定(猫# MK401,豆类生物美国圣何塞,CA)根据制造商的协议。上层清液样本存储在4°C之前不超过24小时后收集分析。样本稀释(30:70)与一盘Opti-MEM和分析读者在492 nm和560 nm(吸光度)。样品的吸光度值规范化标准的吸光度值的完整的细胞死亡,屈服值,代表着每个细胞死亡比例。

本研究中使用的LDH测定量化细胞死亡通过比较总坏死细胞LDH释放由于感染(通过0.5和3)与未感染的总LDH释放自发相比,正常细胞无血清培养系统(MOI 0)的文化条件。公式用来计算细胞毒性是如下:细胞毒性(%)=(实验值-低控制)/(高控制——低控制)* 100。低控制被定义为细胞与莫伊0,高控制被定义为最大LDH释放细胞(细胞是治疗细胞媒体Triton-X 2%溶解所有的细胞)。实验值被感染细胞LDH释放(通过0.5和3)。

上面的公式用来计算细胞毒性治疗(孕激素)和永存的(控制)的实验。这些数字在相互比较分析了上述公式,数据和报告。性质的计算,LDH释放未经处理的未感染的细胞被用来计算H1N1感染的细胞毒性治疗(控制)条件的“低控制”变量。同样,LDH释放(孕激素)治疗,未感染的细胞被用来计算H1N1感染的细胞毒性治疗条件的“低控制”变量。

基因表达的定量实时PCR (RT-qPCR)

细胞颗粒细胞溶解和Qiazol提取之前储存在-80°C。总信使RNA提取的从每个样本与试剂盒miRNeasy微工具包(猫# 217084,费舍尔科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的总RNA隔离协议。用随机引物互补脱氧核糖核酸合成使用iScript™选择互补脱氧核糖核酸合成装备(猫# 1708897包,Bio-Rad大力神,CA)根据制造商的协议。基因表达的IFIT1,MXA,IFNB测量与SYBR绿色化学(引物序列,表1)。基因表达的白细胞介素6(猫#:Hs00174131_m1,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA),IL1B(猫#:Hs01555410_m1热费希尔科学),和NLRP3(猫#:Hs00918082_m1热费希尔科学)与TaqMan测量^®化学(热费希尔科学)。qPCR是运行在一个QuantStudio3(生命技术)根据制造商的指示。叠化测量引用未经处理的样品和规范化的Ct(循环阈值)的值RPL13A(综合DNA技术检测ID: Hs.PT.58.47294843 SYBR绿色,红木市,CA)GAPDH(TaqMan^®基因表达分析Hs02758991_g1热费希尔科学)。

Caspase-1化验

细胞溶解产物暂停500μL 0.1% Triton-X 100和储存在-80°C。Caspase-1的活动在每个样品测定Caspase-1 /冰荧光测定试剂盒(猫# K110-25, BioVision,苗必达,CA)根据制造商的指示。

Luminex化验

浮在表面的如上所述样本收集和评估一个定制的人类ProcartaPlex Mix&Match 6-plex工具包(猫# PPX-06-MX2W9XZ热费希尔科学)测量水平的6细胞因子(IL-1βIFN-β,il - 6,引发,il - 10,地震)。样本分析根据制造商的协议,使用MAGPIX。每个样本中总蛋白质含量与皮尔斯决心^®BCA蛋白质分析工具包(猫# 23250,热科学)和比色检测(吸收波长为562 nm)和一盘读者。

统计分析

克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较influenza-infected孕激素治疗和治疗组。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

孕酮加剧了IAV的细胞毒性感染H1N1 pdm / 09年Calu-3,肺癌细胞系

确认是否Calu-3宽容的病毒复制,病毒载量的上层清液样品收集在24 - 48小时后感染使用TCID50效价与红细胞凝集试验(HA)读出,和值被转换为空斑形成单位/毫升。活病毒从每个受感染的上层清液恢复Calu-3样本,确认的可容许性和infectability H1N1 pdm / 09年的肺癌细胞系(图1一个)。预处理与孕酮不影响病毒载量在任何我的计算或测量。然而,LDH释放显著增加(细胞毒性的测定)观察Calu-3用孕激素治疗的24小时在0.5和3月未感染的细胞相比,在同一时间点(p < 0.05)。孕激素暴露在LDH释放显著增加H1N1感染后24小时相比,治疗感染细胞(图1 b和3月0.5,p < 0.05)。通过光学显微镜观察细胞病变效应(CPE)在感染细胞包括细胞四舍五入,提升和差距在单层和在这些主观更严重的表型与孕激素治疗相比,细胞无毒性(图1 c-j)。

发散抗病毒先天免疫反应的基因和蛋白质表达由于Calu-3细胞孕激素治疗后IAV H1N1感染pdm / 09年

生物标记的基因和蛋白质表达的干扰素(干扰素;如β干扰素,IFN-β),IFN-stimulated基因(isg;如IFIT1, MxA)和细胞因子(例如,il - 6)是由RT-qPCR评估(细胞颗粒)和Luminex细胞因子分析(上层清液)来确定孕激素的影响在抗病毒先天免疫反应。孕激素治疗Calu-3细胞感染H1N1 pdm / 09年的重要upregulation白细胞介素6,但不IFNB,IFIT1或MXA(图2模拟和3月0.5,p < 0.05)。与基因表达的结果,孕激素治疗在蛋白表达显著增加IFN-β(图2 e;和3月0.5,p < 0.05)。il - 6蛋白的表达增加(图2 g,我3,p < 0.05)与增加细胞死亡是一致的(图1 b在感染后48小时)。有趣的是,蛋白质的表达引发孕激素治疗后明显降低感染后48小时(图2 f,我3,p < 0.05)。总之,孕激素治疗肺细胞与IFN-β和il - 6蛋白表达增加H1N1感染pdm / 09年之后,并没有反映在专门为基因表达的变化IFNB。

颞caspase-1活动的变化,一个标记的NLRP3 inflammasome激活,与孕激素治疗并没有完全反映在活跃的il - 1β和地震Calu-3细胞

基因表达、蛋白表达、酶活性的生物标志物的NLRP3 inflammasome激活通路被RT-qPCR测量,Luminex细胞因子测定,caspase-1活动分析Calu-3细胞系(图3)。基因表达的NLRP3和IL1B没有显著改变Calu-3孕激素治疗的细胞感染H1N1病毒(图3 a, B,p < 0.05)。虽然孕酮治疗没有改变基因的表达NLRP3,有一个时间的变化caspase-1活动,产品的NLRP3 inflammasome激活,与孕激素治疗有关。孕激素治疗与显著减少caspase-1活动感染后24小时(MOI 0.5),并显著增加caspase-1活动在48 h p。(通过0.5和3)(图3 c,p < 0.05)。Caspase-1劈开pro-IL-1β和pro-IL-18活动形式。然而,在48 h.p.i. caspase-1活动的变化并不完全反映在蛋白质含量IL-1β和地震。IL-1β水平没有显著影响孕激素治疗的计算,但地震孕激素治疗后显著增加在时间点和通过测量(图3 d, E,p < 0.05)。总的来说,孕激素治疗与时间差异caspase-1 Calu-3细胞活动反映在地震的增加,但不是IL-1β,在48 h.p.i蛋白表达。

孕激素变弱的细胞毒性IAV H1N1 pdm / 09 ACH-3P感染,胎盘细胞线

确定胎盘滋养层细胞,ACH-3P,宽容的病毒复制,病毒载量的上层清液样品收集在24和48 h.p.i. TCID测量₅₀分析与HA读出并转换为空斑形成单位/毫升。传染性病毒从每个受感染的上层清液样本,确认的可容许性和传染性胎盘细胞行H1N1 pdm / 09年(图4一)。作为Calu-3观察,孕激素治疗并不是与病毒载量显著差异在任何相关的计算或莫伊测量。然而,ACH-3P传染性病毒载量显著低于Calu-3在多个时间点和通过孕激素和控制(MOI 0.5 24在24 h.p.i h.p.i.和莫伊3。,p < 0.05)。孕激素治疗感染H1N1 pdm / 09年ACH-3P细胞通过0.5和3与显著减少LDH释放在48 h.p.i。(图4 b,p < 0.05)。像Calu-3, CPE ACH-3P最早是由光学显微镜观察24 h.p.i.在这两个月。在Calu-3对比观测,孕激素治疗与那么严重IAV-associated细胞损伤概要文件比未感染细胞(图4 c-j)。

孕激素治疗对先天免疫反应的影响ACH-3P IAV感染H1N1 pdm / 09年

确定孕激素的影响在ACH-3P抗病毒先天免疫反应,我们测量的基因和蛋白质表达的先天免疫生物标志物。孕激素治疗与基因表达明显下降IFNB在48 h.p.i。(图5一个,p < 0.05),显著增加蛋白质的表达IFN-β24和48 h.p.i。(图5 e,p < 0.05)。孕激素治疗也与基因表达明显下降白细胞介素6在48 h.p.i。(图5 d,p < 0.05),显著增加蛋白质的表达il - 6在24小时和48 h.p.i。(图5克,p < 0.05)。isg的基因表达,IFIT1和MXA没有显著影响孕激素治疗(图5 b, C)。此外,蛋白质的表达引发24和48 h.p.i.孕激素治疗后明显下降(图5 f,p < 0.05)。总之,孕激素治疗ACH-3P细胞感染H1N1在蛋白表达显著增加IFN-β和il - 6,并没有反映在基因表达的变化IFNB和白细胞介素6。

孕激素治疗效果的激活NLRP3 inflammasome ACH-3P IAV感染H1N1 pdm / 09年

基因表达、蛋白表达和蛋白质生物标记活动测量NLRP3 inflammasome活动如上所述。孕激素治疗并没有显著改变基因的表达NLRP3(图6 b)。然而,孕激素治疗与基因表达明显下降IL1B(图6,p < 0.05),但显著增加蛋白质的表达IL-1β48 h.p.i。(图6 d,p < 0.05)。孕激素治疗也与蛋白表达显著增加有关的地震(图6 e,p < 0.05)。此外,孕激素治疗与24 h.p.i caspase-1活动的显著下降。,但显著增加caspase-1活动由48 h.p.i。(图6 c(p < 0.05);我0.5)。总之,孕激素治疗相关的重要upregulation IL-1β地震-蛋白表达,并没有反映IL1B基因的表达。孕酮也有时间影响caspase-1活动ACH-3P Calu-3镜像观察,但只在一个较低的莫伊。

讨论

孕酮是一种生殖生物学和主监管机构在维护人类妊娠有重要作用(17,24,27)。孕激素的影响,在先天免疫和细胞损伤在肺癌和胎盘IAV感染是特别感兴趣的增强肺部疾病和更高的死产的风险中观察到感染的孕妇。更高水平的孕激素是否会削弱或增强抗病毒先天免疫反应在怀孕IAV肺或胎盘是未知的。本研究调查了孕酮对细胞死亡的影响,先天免疫和NLRP3 Calu-3 inflammasome活动,肺癌细胞系,和胎盘ACH-3P细胞系。虽然两种细胞系都允许IAV H1N1 pdm / 2009,孕激素暴露微分影响肺癌和胎盘细胞系细胞死亡。孕激素暴露与Calu-3显著增加细胞死亡,但有相反的效果在ACH-3P减少细胞死亡。抗病毒先天免疫反应的分析在这两种细胞系常常显露出不同的表达基因及其蛋白质表明孕激素信号诱导non-genomic和特异性反应。例如,孕激素治疗与减少有关白细胞介素6基因表达但在ACH-3P il - 6蛋白浓度的增加。你这个观察可能是由于孕激素作用等细胞因子il - 6,可能增加perdurance细胞因子表达。总的来说,孕激素调制的影响IAV H1N1 pdm / 2009年肺癌和胎盘感染不同细胞系传授基因组,non-genomic和特异性对基因表达的影响。

性类固醇可以通过绑定到对非生殖组织施加影响性激素结合球蛋白(SHBG) (28)。孕酮水平高在月经周期的黄体期,在几项研究与肺功能的恶化后月经周期的一半。例如,孕激素治疗与一个恶化的肺损伤小鼠模型,由博来霉素引起系统性硬化症(29日)。此外,在一个队列,横跨美国22个州和加拿大的两个省,急诊急性哮喘的峰值在月经周期的黄体期(30.)。此外,几项研究,测量了性激素对呼出一氧化氮浓度的影响孕妇表明孕激素可能放大气道炎症(31日)。综上所述,有证据表明,性类固醇像孕激素可能通过促炎加重肺损伤的影响。

怀孕孕激素浓度的差异个人和整个流感感染时间进程可能会影响肺和胎盘可以减轻病毒损伤。孕激素影响IAV pdm / 2009 H1N1病毒载量和先天免疫之前评估在几个怀孕小鼠模型(18,32- - - - - -34)。两种小鼠模型表示之间的负相关血清孕激素水平和肺病毒载量,表明较高的系统性孕酮与更好的病毒控制在肺。虽然我们只测试一个孕激素剂量,较高的细胞死亡中观察到progesterone-treated肺细胞可能采取行动消除感染细胞并限制病毒复制。这可能会增加炎症。天然孕酮的浓度会增加4倍,从第一到第三阶段(35)。即使在怀孕的人同时在怀孕,孕酮浓度可以相差很大。首次在女性怀孕,孕酮水平高出30 - 100%孕妇怀孕之前的历史(35)。此外,IAV感染本身可以改变孕激素水平降低5倍怀孕小鼠的血清孕酮4一般。我(33)。低水平的孕激素可能对怀孕的宿主产生不利的影响。IAV-induced减少系统性的孕激素将预期pro-abortive影响怀孕小鼠妊娠孕激素的支持维护和子宫静止。虽然孕酮可能敏锐地保护从IAV-associated胎盘细胞损伤,如图所示,我们发现,滋养层细胞可能会变得更容易IAV随着时间的推移,如果当地孕酮浓度降低。在怀孕时孕酮的浓度不同,个人怀孕和感染时间进程可能会影响流感疾病。

孕酮是一个关键immunomodulating怀孕期间激素,可能nongenomic对信号通路的影响重要IAV等先天免疫防御病原体。在生殖系统,孕激素触发细胞受体的转译后的修改,转录因子,导致持久的代数余子式,下游特定细胞类型的后果。我们的研究结果不一致的基因和蛋白质表达的IFN-βCalu-3和ACH-3P和il - 6与孕激素治疗符合ACH-3P nongenomic典型的性类固醇的影响。这些nongenomic效应所带来的影响已经可以理解上下文中的病毒感染和先天免疫。在我们的研究中,孕激素治疗肺和滋养层细胞系在蛋白表达显著增加IFN-β和il - 6在24和48 h.p.i. IAV H1N1 pdm / 2009。这是意想不到的孕激素通常抑制先天免疫反应,可以抑制活化的巨噬细胞和树突细胞(36- - - - - -40)。尽管IFN-β和il - 6都可以引发细胞凋亡程序,增加细胞死亡只是观察肺癌细胞系(41,42)。孕激素的影响在先天免疫,细胞死亡和感染IAV Calu-3 ACH-3P特异性和从其他模型系统与预期相反。

本研究的力量在于它是第一个直接评估孕激素的影响在人类肺癌和滋养层细胞的敏感性线IAV-induced先天免疫活化和细胞死亡。ACH-3P尤其适用的细胞系,因为它表达了滋养层标记和一个相似的转录组主滋养层(43)。然而,重要的是要注意,细胞系不精确模型的器官,可能有不同的表达水平的病毒进入受体或其他重要的先天免疫细胞受体激活。也有重要的方法论的缺陷研究快速反映基因组和生物事件non-genomic效应引起的性类固醇。值得注意的是,我们的实验进行没有胎牛血清,可抑制流感病毒复制(44)和各种生长激素的浓度不同,引入变异的细胞培养实验环境(45)。

IAV感染的结果很复杂,影响一个人的年龄、性别、怀孕状态和其他共存疾病创建一个复杂的信号环境,可以改变性类固醇,如孕酮(17,46- - - - - -48)。我们的数据表明孕激素带来复杂的基因组和non-genomic影响先天免疫在肺癌和滋养层细胞。总体而言,在这两个细胞系结果相似,但显著的区别的孕酮治疗细胞死亡的影响。在Calu-3,细胞死亡是加剧了孕激素治疗,相比在ACH-3P孕激素治疗的减毒作用。未来的研究需要调查下游孕酮,以更好地阐明细胞信号通路的关键IAV的先天免疫反应和其他病毒感染在怀孕期间。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充文件,可以针对相应的作者进一步询问。

作者的贡献

在乌鸦的研究设计构思,毫升,HH。赠款资金被乌鸦的采购。手稿的作者是ML,艾尔和乌鸦。实验由ML, HH和艾尔。DF和AO提供的材料。统计分析是由JM。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由美国国立卫生研究院资助拨款R01AI164588乌鸦。

确认

我们感谢杰西布朗和Mindi耙所的援助与平面设计的数字。我们感谢小迈克尔·盖尔博士Calu-3细胞系。

的利益冲突

作者在乌鸦是受雇于该公司,葛兰素史克公司担任顾问。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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