识别surfactin作为anti-severe发烧与血小板减少症病毒多目标化合物从文化肉汤中提取海洋微生物

1介绍

严重发热与血小板减少症综合征(sft)于2011年在中国被发现,据报道在一些东亚国家包括日本、韩国、台湾和越南(1- - - - - -6)。sft sft病毒所造成的是一个新兴传染病(SFTSV, sft沙,或Huaiyangshan banyangvirus)。SFTSV是一种蜱传播的病毒属机密Banyangvirus的Phenuiviridae家庭和Bunyavirales秩序(7)。系统相关的其他沙SFTSV腹地和Malsoor病毒,分离出密苏里州,美国和印度西部,分别为(8,9)。此外,新型病毒密切相关SFTSV腹地病毒已被确定在中国(10)。目前,没有确立了sft的预防或治疗。说明病毒复制的机制可以帮助确定适当的预防和治疗策略。小的化合物库与已知的结构和功能被用来识别小说anti-SFTSV化合物。尽管缺乏建立治疗对sft,几个化合物,包括食品和药物管理局(FDA)批准的药物,抑制SFTSV复制已报告在活的有机体内和在体外(11,12)。除了这个策略,利用生物体产生大量的次生代谢物和天然分子几乎无限的结构多样性可能是另一种方法来识别小说anti-SFTSV代理,可以发展成新的anti-SFTSV药物。

海洋中存在大量的微生物,以及他们的生活依赖于他们的生活环境。众所周知,这些海洋微生物提供无限的生物资源生产治疗药物对疾病的治疗和控制,包括病毒感染(13,14)。此外,生态,如地区、条件、和/或环境的海洋微生物,影响他们的代谢物的生产。这意味着海洋微生物能产生独特的代谢产物,是特定于它们的栖息地地区和条件。天然抗病毒产品确认从海洋微生物中,生物碱类、醌类、多肽、聚酮,芘,固醇,和萜类化合物已被证明具有抗病毒效应对几个病毒,包括肠病毒71年,单纯疱疹病毒(HSV) 1、流感、人类免疫缺陷(HIV) 1型,丙型肝炎病毒和登革热病毒(13,14)。然而,这些化合物对其他病毒的抗病毒效果尚不清楚。因此,进一步的研究是需要检查确定化合物的抗病毒效应对其他病毒和继续识别新型抗病毒天然产物从海洋微生物作为潜在的治疗药物。

在这项研究中,我们试图识别和描述的影响anti-SFTSV化合物从文化中提取海洋微生物的培养基配方来自长崎海岸,日本。

2材料和方法

2.1文化准备汤提取海洋微生物

有效地收集海洋微生物,各种海洋动物沿着海岸的几个地区的长崎,日本,收集。海洋微生物主要是隔绝滋养运河如下。消化道样本飞跑到海洋琼脂板(Difco海洋琼脂2216;美国新泽西Beckton,迪金森& Co)和海水琼脂板包含8.0 g D(+)葡萄糖(和光化学物质,富士胶片kouichi日本大阪),4.0 g hipolypepton(和光)富士胶片kouichi 2.4 g Bacto酵母提取物(Beckton,迪金森& Co), 2.4 g KH₂阿宝₄(和光)富士胶片kouichi MgSO 0.8毫克₄h·7₂和光)O(富士胶片kouichi和Bacto-Agar (Beckton,迪金森& Co)每升海水自然与蒸馏水稀释到75%的初始浓度,这是孵化26°C 1至7天。孵化后,殖民地是孤立的基于形态学和色素沉着,和海洋微生物生长在200毫升或1.6 L海洋肉汤(Difco海洋肉汤2216;Beckton,迪金森& Co)或海水肉汤。这包含8.0 g D(+)葡萄糖,4.0 g hipolypepton, 2.4 g Bacto-yeast提取物、2.4 g KH₂阿宝₄和0.8毫克MgSO₄h·7₂O每升自然海水稀释到75%的初始浓度与蒸馏水,在500毫升或2 L厄伦美厄烧瓶,分别在26°C一到两周。三分之一的丙酮添加量对海洋微生物文化(肉汤和微生物)的混合物,用近5分钟。用样本,包括胞外和胞内物质,通过滤纸过滤,滤液受到真空蒸发除去丙酮。1/2体积的乙酸乙酯加入残渣和混合动摇了在分离用的漏斗3分钟。在水相干涸,有机相是收集并进行真空蒸发除去乙酸乙酯。二甲亚砜(DMSO)添加到提取物的浓度为100毫克/毫升,分发到cryovials和储存在-30°C。

2.2细胞,病毒,和化合物

人类肝细胞细胞系(Huh-7)和非洲绿猴肾细胞系(维罗76)细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(富士胶片,044 - 29765)含10%胎牛血清的边后卫,100国际单位/毫升青霉素和链霉素100μg /毫升。SFTSV用于本研究的起源已经先前描述(15)。钠表面活性剂是购买富士胶片(194 - 12691)。

2.3高效液相色谱法,液相色谱量化飞行时间质谱,串联质谱分析

高效液相色谱法进行了使用pegasil ODS SP 100列(4.6身份证x 250毫米,Senshu科学有限公司,东京,日本)与线性梯度从5% CH₃CN水溶液CH的100%₃CH CN为30分钟,其次是100%₃CN 10分钟1毫升/分钟的流量,并使用光电二极管阵列检测器检测。分析的样本LC-Q-TOF-MS和数据获得使用AB Sciex三重TOF™5600⁺液相色谱仪(LC)质谱(MS) / MS系统(美国AB Sciex弗雷明汉,MA)的反相高效液相色谱柱,Capcell核心C₁₈3.0(2.7µm,身份证x 100毫米,大阪汽水有限公司,大阪,日本),用一个线性梯度从5%甲醇水溶液含有0.1%甲酸100%甲醇含0.1%甲酸0.5毫升/分钟的流量13分钟。液体chromatography-high-resolution电喷雾电离质谱(质)光谱测量使用AB Sciex TripleTOF 5600 +系统(美国AB Sciex弗雷明汉,MA)。所有分析都在正离子模式下进行的。女士的详细情况分析如下:离子源gas1 20 psi;离子源gas2 15 psi、窗帘气体25 psi,温度0°C, ionspray浮动电压5500 V, 100 V declustering潜力,碰撞能量45 V,碰撞能量分散0 V,离子释放延迟67μs,离子释放延迟25μs宽度。分析了LC / MS数据使用分析软件(AB Sciex,版本1.7.1上)。

2.4病毒滴定

使用免疫荧光试验SFTSV效价的测定。维罗76细胞(3×10⁴细胞/)被播种在96孔板一天之前感染。细胞被感染了1:10系列稀释的病毒和孵化16 h公司37°C的5%₂。这些细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA) 30分钟在15 - 25°C,然后孵化PBS中含0.1%渐变^®20 - 5%的边后卫1 h在15 - 25°C。SFTSV N蛋白检测使用一个主anti-SFTSV N抗体(12,15),其次是一个次要anti-rabbit IgG-FITC抗体(ab6009 Abcam,剑桥,英国)。SFTSV N-positive细胞数在一个包含10 - 100 SFTSV N-positive细胞和表达为荧光重点单位(洁净/毫升)后适当的计算。当计数N-positive细胞,数量低于检测极限(L.O.D.)被认为是零。每个病毒效价、平均和标准偏差被绘制在图。

2.5病毒感染实验

筛选,每个提取(图1)或分数(图2一个)混合SFTSV(感染复数(moi) = 0.1),然后Huh-7感染细胞,于96年被播种-好的盘子一天之前感染。提取的筛查(图1),感染细胞固定和染色anti-SFTSV N抗体,如2.4节所述。的数量SFTSV N-positive细胞和DAPI-positive细胞自动计算使用Cytation 5 (BioTek)。测量的SFTSV效价NUHE-1很多1 - 3 (图3一)和筛选的分数(图2一个),提取/分数被应用在潜伏期。文化的上层清液感染和治疗细胞收集,病毒效价检测,如2.4节所述。检查anti-SFTSV surfactin对病毒传播的影响在Huh-7或76维罗细胞(图4),两个细胞系都感染了SFTSV莫伊0.1 1 h,在96孔板的化合物。1 h孵化后,培养基是包含DMSO溶液或surfactin替换为新的媒体。在感染后48 h (h p。),文化上层清液收集和病毒滴度测定(图4)。同样的步骤之后检查surfactin在事后报关步骤的影响,除了固定和上层清液的收集时间的影响单轮感染(图5 a - c)。评估的翘尾因素的surfactin病毒滴定,surfactin应用病毒吸收后,孵化16 h,然后用新鲜的培养基是取代了媒体,不含有一种物质,进一步孵化6 h,然后收集病毒滴定法(图5 d, E)。SFTSV感染细胞密度较低,Huh-7 (4×10³)用24孔板细胞被播种,感染与莫伊SFTSV = 1对1 h,然后处理或DMSO surfactin一起NH 20毫米₄Cl 15 h,然后固定SFTSV N抗体和DAPI染色。的数量SFTSV N-positive细胞自动计算使用BZ-X800(日本基恩士)(图6)。

2.6细胞生存能力分析

Huh-7和维罗76细胞的生存能力surfactin治疗后评估使用CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析(Promega),确定可行的细胞的数量在一个文化基于ATP水平。Huh-7和维罗76个细胞(2×10⁴在96孔板的细胞/)被播种形成单层。播种后,细胞治疗surfactin(100μM)或DMSO溶液(1%)作为对照。在48小时后处理,浮在表面的文化被移除,CellTiter-Glo试剂是补充道。执行的分析是根据制造商的建议使用SpectraMAX iD5标仪(美国加利福尼亚州圣何塞分子器件、)。DMSO-treated控制细胞的生存能力被设置为1.0。

2.7治疗的病毒粒子和电子显微镜分析

文化媒体含有传染性病毒粒子(2×10⁶洁净与DMSO溶液混合,surfactin(最终100μM),或Triton x - 100(最后0.01%)为30分钟37°C (16)。然后,样本固定2%戊二醛(Nacalai Tesque,京都,日本)在0.1包含1毫米CaCl钠甲次砷酸盐缓冲₂和1毫米MgCl₂(甲次砷酸盐缓冲,pH值7.4)在4°C 60分钟。每个样本加载在200 -铜网的网格与碳涂层塑料薄膜(安全卫生EM、东京、日本)后立即辉光放电和负染色醋酸双氧铀溶液(1%,w / v) 15 s。每个样本的形态学观察使用jem - 1400 flash (JEOL、东京、日本)的加速电压80 kV。

2.8合胞体形成分析

合胞体形成是引起SFTSV感染的细胞在低pH值(17)。Huh-7细胞感染SFTSV 1 h的莫伊1,然后DMSO -或surfactin-containing媒体所取代。在感染后24 h,文化上层清液收集测量病毒效价。细胞与PBS清洗一次(-)然后孵化citrate-phosphate缓冲区(柠檬酸0.1米和0.2米正磷酸盐)二氢钠pH值调整到5.0或7.0 3分钟。citrate-phosphate缓冲区被替换为培养基,在单层膜和细胞融合后相差显微镜下观察4 - 6 h。

2.9分类研究

确定应变ν- 595生产一种anti-SFTSV化合物16 s rRNA基因测序进行如下所述。DNA的DNA提取使用MightyPrep试剂(9182年,豆类)根据制造商的协议。16 s rRNA基因使用Q5高保真放大DNA聚合酶(M0491A,新英格兰生物学实验室)和引物(11 f: AGTTTGATCATGGCTCAG 520 f: CAGCAGCCGCGGTAATAC, 925 r: CGTCAATTCATTTGAGTT, 1540 r: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)。放大进行9700年GeneAmp PCR系统(热费希尔科学)与一个初始孵化1分钟在94°C,紧随其后的是35周期20年代在94°C, 30年代在50°C,和1分钟72°C,其次是2分钟最终在72°C扩展。PCR产物纯化使用NucleoSpin凝胶和PCR清理(U0609A,豆类)。序列分析使用DNA测序仪(3730 xi DNA分析仪,热费希尔科学)使用BigDye终结者v3.1循环测序工具包(热费希尔科学)。受到爆炸序列搜索使用EzBioCloud服务器(https://www.ezbiocloud.net/)。系统发育分析,应变ν- 595的顺序与序列相关的物种使用CLUSTAL W (18),并使用neighbor-joining的系统发育树构建方法(19在大型X ()20.)。

2.10免疫印迹

检测和分析的表达SFTSV N在受感染的细胞,细胞溶解产物制备与裂解缓冲(NP-40 1%, 50 mM Tris-HCl pH值8.0,62.5毫米EDTA,和0.4%钠脱氧胆酸盐),和韦斯(ProteinSimple、东京、日本)是用于检测SFTSV N Ez标准包1 (PS-ST01EZ-8 ProteinSimple) anti-rabbit化学发光检测模块(dm - 001, ProteinSimple),连同anti-SFTSV N抗体如上所述(2.4节)(12,15)。

2.11 RNA量化

量化SFTSV年代段RNA在细胞中,从感染细胞总RNA收集使用RNeasy迷你包(74106年,试剂盒)。反转录进行使用等量的RNA获得cDNA引物(5 ' - AGCTGAAGGAGACAGGTGGA 3 ')和PrimeScript™II 1^圣链cDNA合成装备(6210 a,豆类)。然后,量化的互补脱氧核糖核酸被用作模板与引物组(5“-GCTGAAGGAGACAGGTGGAG-3”和5 ' -GCAACCCTCACAGGAGTGAT-3 '),结核绿色预混料交货Taq II (Tli RNaseH +) (RR820A、豆类)和StepOnePlus™实时PCR系统(热费希尔科学)。一个质粒,其中包含整个SFTSV年代段稀释和用于获得一个标准曲线。

2.12统计分析

统计上显著的差异组由学生决定t量测试用Excel软件(微软)。定量数据提出了均值±SD从至少三个独立的实验。所有的计算,p< 0.05 (*),p< 0.01 (* *),p< 0.001(* * *)被认为是重要的,使用星号来表示。

3的结果

3.1识别和评估anti-SFTSV从海洋微生物中提取

确定化合物表现出anti-SFTSV从80年文化影响汤提取海洋微生物,每个提取与SFTSV混合,随后应用Huh-7细胞,在材料和方法部分描述。在感染后的48小时(h p。),受感染的细胞被固定和染色anti-SFTSV N抗体和DAPI监控病毒传播和细胞数量。的相对数量SFTSV N-positive细胞(SFTSV N-positive细胞/ DAPI阳性细胞规范化DMSO-treated 1.0)所示图1。Manidipine, l型钙通道抑制剂(12,21)是作为一个积极的控制。在80提取物在这个实验中,测试的相对数量SFTSV N-positive从两个细胞/ DAPI-positive细胞提取物(C5和H3)小于0.5,分别为红色和橙色所示(图1)。尽管提取物降低SFTSV N-positive细胞数量类似的区段,H3细胞毒性表现出高于C5,表明潜在的细胞毒性效应。基于这个结果,我们决定专注于C5提取、展品anti-SFTSV活动较低的细胞毒性,并更名为长崎大学达到提取(NUHE) 1。

3.2描述的不同很多NUHE-1

检查的再现性anti-SFTSV NUHE-1的影响,微生物菌株ν- 595 (NUHE-1准备)又培养了在200毫升和1.6 L媒体,和不同的大量的提取,很多2和3,分别从文化准备汤(图3一)。许多的文化条件2是一样的,很多1,用于初步筛选。许多文化量表3是基于复合负责施加的后续净化anti-SFTSV提取的效果。很多1和2等效anti-SFTSV展出活动(减少4-logs DMSO溶液治疗相比)。在很多的情况下3中,它只减少到2-logs DMSO相比治疗。虽然anti-SFTSV的功效很多3相比减少很多的1和2,我们得出的结论是,这足以减少隔离NUHE-1的负责任的化合物。anti-SFTSV 50%抑制浓度(IC₅₀)NUHE-1很多3计算83.1 ug /毫升(图3 b)。

3.3 Surfactin被认定为主要anti-SFTSV NUHE-1化合物

NUHE-1很多3使用高效液相色谱法分离每分钟40分钟,和anti-SFTSV效果评估分数来确定分数,表现出最强的anti-SFTSV效果(图2一个)。分数35-39显著抑制SFTSV生产。分类研究应变ν- 595也进行了。应变的16 s rRNA序列ν- 595(基因库加入号码:OP810502)显示最高的相似度(99.93%)的价值芽孢杆菌safensis无性系种群。safensisFO-36b^T和b . safensis无性系种群。osmophilusBC09^T。系统发育分析表明,应变ν- 595集群芽孢杆菌物种(图2 b)。因此,应变ν- 595被认定为属于属芽孢杆菌。Surfactin是一种抗病毒因子由属的成员芽孢杆菌(16,22,23)。基于这些知识,分数35图2一个分析了使用LC-Q-TOF-MS确定surfactin在这个分数的存在。正如所料,surfactin分数35的主要成分(图2 c)。MS / MS分析证实,部分包含surfactin 35 C₁分子量为1036,surfactin同类(图2 d)。分析分数》通过MS / MS透露,这些分数还包含其他surfactin同系物分子量为1050,1064,1078 (补充图1)。

3.4 Surfactin治疗部分影响了SFTSV病毒粒子的完整性

由于它能够破坏病毒脂质膜surfactin报道对包膜病毒拥有强有力的抗病毒活性,包括Semliki森林(SFV),单纯疱疹(1型单纯疱疹病毒,HSV-2), suid疱疹(SHV-1),水泡性口炎(除),猴免疫缺陷(SIV) (22)、流感、埃博拉,Zika病毒,尼帕基孔肯雅热,Una, Mayaro Dugbe和克里米亚-刚果出血热病毒(23),以及严重急性呼吸系统综合症(冠),和中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)。检查是否surfactin影响病毒粒子完整性报告与其他包膜病毒,传染性SFTSV DMSO溶液或surfactin处理。病毒治疗与崔x - 100是一个积极的控制。电子显微镜观察到治疗病毒粒子。病毒粒子处理DMSO多形性,但大多是圆形的(n = 11)。相比之下,所有的病毒粒子的完整性处理Triton x - 100 (n = 20)的影响。大约30%的病毒粒子的完整性受到影响时对待surfactin (n = 18) (图4)。

3.5 Surfactin抑制SFTSV传播和合胞体形成在低ph值

检查anti-SFTSV surfactin的效果,两个细胞系,Huh-7 (图7维罗(76)和图7 b),感染了SFTSV感染复数(moi) 0.1,和对待surfactin 48 h。在48 h p。,文化上层清液收集和病毒效价测定。生产SFTSV Huh-7和维罗76个细胞减少到低于检测极限(L.O.D.)。surfactin治疗后细胞生存能力也被评估。虽然surfactin治疗Huh-7细胞活细胞数量减少到60% DMSO相比治疗(图4一、右)相同的治疗州立76个细胞没有明显影响细胞的生存能力比DMSO治疗(图7 b,对吧)。除了它能够破坏病毒脂质膜,surfactin据报道,减少病毒的传染性,包括猪流行性腹泻和传染性胃肠炎病毒(16),通过抑制病毒envelope-cell膜融合事件。根据这些报告,同样的抑制作用surfactin合胞体形成在低pH值由于virion-cell SFTSV引起的膜融合糖蛋白在Huh-7检查细胞(图8维罗76)和细胞(补充图2)。维罗76细胞被感染SFTSV Huh-7和莫伊= 1.0和surfactin对待。在24 h p。,infected cells were treated with citrate-phosphate buffers (pH 7.0 or 5.0) for 3 min and then the buffer was replaced with fresh media, followed by a 4 h incubation period. The cells were fixed and stained with an anti-SFTSV N antibody and DAPI. When cells were treated with DMSO and citrate-phosphate buffers at pH 5.0, syncytium formation was observed, as indicated by the white dotted lines (图8Huh-7细胞和补充图2维罗76细胞)。SFTSV N-positive细胞融合细胞也被观察到。这些影响中,并未观察到细胞治疗DMSO-citrate-phosphate缓冲区(pH值7.0)。受感染的细胞surfactin处理时,要么治疗pH值7.0和5.0,表现出合胞体形成。

3.6 Surfactin抑制病毒复制和生产

探索surfactin病毒复制和生产的影响,除了细胞入境手续,时间进程Huh-7 SFTSV复制的细胞检查。Huh-7细胞感染SFTSV (moi = 1),和病毒粒子的生产文化上层清液和SFTSV N蛋白的表达在不同的时间点(0,6、8、10、12、16、24 h p。)(检查补充图3)。传染性病毒粒子的生产检测在12 h p。,the expression of SFTSV N was detected at 16 h p.i. Based on these results, 16 h p.i. was considered to reflect a single round of infection. Next, the cells were infected with SFTSV without treatment for 1 h, the media was replaced with fresh media containing either DMSO or surfactin, and incubated for 15 h (图5一个)。总RNA是孤立的1 h pi和16 h p。(+ / - surfactin治疗)。逆转录(RT)其次是定量PCR (qPCR)进行量化SFTSV RNA(段)复制的细胞。没有surfactin治疗,SFTSV RNA数量增加大约15倍的1 h pi 16 h p。当被感染的细胞被对待surfactin感染后,大约6.8倍减少SFTSV年代段观察相比,DMSO控制治疗(图5 b)。因此,SFTSV N表达细胞减少(减少5倍)surfactin感染后治疗(图5 c)。感染细胞也被固定和沾anti-SFTSV N计算SFTSV N-positive细胞。SFTSV N-positive细胞显著减少surfactin治疗相比,控制DMSO(减少2倍,图5 d)。排除这种可能性,我们的结论surfactin抑制事后报关步骤和病毒粒子的生产并不是由于结转的surfactin上层清液收集在滴定实验,进行了以下实验。在病毒感染和DMSO溶液或surfactin治疗和孵化16 h,培养基被替换为新的媒体没有复合,孵化6小时没有任何化合物,和病毒效价浮在表面的检查(图5 d)。因此,病毒生产后媒体替代降低了1 - 2日志surfactin治疗相比,DMSO (图5 e)。此外,排除可能的细胞间传播SFTSV,细胞被播种在低密度,感染SFTSV (moi = 1) 1 h,然后中包含20毫米NH替换为新的媒体₄Cl防止再次感染和DMSO溶液或surfactin和孵化15 h。16 h p。,the infected cells were fixed and stained with an anti-SFTSV N antibody to count the SFTSV N-positive cells (图6)。SFTSV N阳性细胞数量减少到57% DMSO溶液治疗(图6 b)。

4讨论

虽然取得了重大努力,开发有效的抗病毒制剂对多种病毒,只有少数被批准临床使用。很难预测是否一个特定的化合物有很强的抗病毒效应在筛查点没有明显的副作用。因此,重要的是要找出尽可能多的候选化合物来评估他们的抗病毒效果和安全。

在这项研究中,考虑到没有批准疫苗和抗病毒药物治疗sft病人,我们试图确定anti-SFTSV化合物从文化肉汤中提取海洋微生物。一个小图书馆80年海洋微生物从海洋微生物的培养基中提取准备收集从长崎海岸地区,日本,用于筛选。两个提取物被选为提取物,和其中一个(NUHE-1)是本研究中使用,因为它比另一个更高的细胞毒性。

虽然体积相同的文化ν- 595(200毫升很多1和2)表现出类似anti-SFTSV活动,3,这是准备从1.6 L文化规模所需的后续的高效液相色谱分析,显示anti-SFTSV活动减少。在某些情况下,改变培养条件,包括体积,增加微生物文化的最终成分提取的影响。如上所述,可能1.6 L文化并不是最好的条件提取冲击化合物相比,规模较小的文化卷NUHE-1。尽管如此,我们认为anti-SFTSV效应由NUHE-1很多3足以隔离复合和选择负责进一步检查。

减少所需要的步骤数确定负责anti-SFTSV复合提取物,NUHE-1 3使用高效液相色谱法分离每一分钟,每个分数的anti-SFTSV效果检查(图2一个)。Surfactin和其他Surfactin副产品被确定为主要的化合物表现出显著的分数35-39 anti-SFTSV活动(图2 a, B,补充图1)。这些结果提供一个清晰的概念,从微生物提取物抗病毒化合物的识别。

Surfactins与两亲性环lipopeptides属性。Surfactin是革兰氏阳性endospore-forming细菌产生的枯草芽孢杆菌(24),以及b .纳豆,b、,slichenifomis。Surfactin副产品也被隔绝枯草芽孢杆菌(25)。此外,据报道,surfactin副产品与不同的氨基酸排列方式产生不同的菌株枯草芽孢杆菌因为灵活性高nonribosomal肽合成酶(26)。自从第一个识别和表征surfactin (27),一系列的研究报道surfactin的功能,包括抗菌、抗病毒、抗真菌、antimycoplasma和溶血性活动(28)。到目前为止,surfactin的抗病毒效应被认为是基于洗涤剂的效果,导致脂质膜的破坏病毒粒子(29日)以及一个抑制作用viral-host在病毒膜融合进入步骤(16)。surfactin的抗病毒效果,包膜病毒,在引言部分上市以及非包膜病毒如猫杯状病毒(Caliciviridae)和小鼠脑心肌炎病毒(引起)(22)已被证明是影响Surfactin治疗。包膜病毒的失活是更有效的比非包膜病毒(22)。值得注意的是,对Semliki surfactin森林病毒的抗病毒效果(Togaviridae)明显低于其他包膜病毒,几乎等于无包膜病毒(22),暗示的抗病毒效果surfactin包膜病毒是不常见的。因此,重要的是要检查的影响surfactin对所有感兴趣的病毒。

在最近的研究中,观察surfactin anti-SFTSV效果显著的两个细胞系:Huh-7和维罗76。据我们所知,surfactin的抗病毒效果依赖于表面活性剂的效果,从而影响病毒粒子膜,抑制宿主细胞膜融合活动,如上所述。前者的影响已经在广泛的观察到信封病毒(16,22)。的影响因此,surfactin SFTSV信封上使用电子显微镜检查。我们的研究结果表明,surfactin部分影响SFTSV信封(图7)。接下来,检查surfactin virion-membrane融合事件的影响,细胞诱导的合胞体形成SFTSV G是检查。正如所料,surfactin治疗抑制合胞体形成两个细胞系(图8),强烈建议其anti-SFTSV行动之一是抑制SFTSV G-mediated膜融合事件的条目的步骤。这些结果表明,surfactin影响病毒粒子信封和virion-host膜融合事件,已报道的行动的机制surfactin对其他病毒。

进一步调查Surfactin是否会影响其他病毒生命周期步骤比病毒粒子本身和/或进入一步,Surfactin应用病毒内化进入细胞后(图5)。细胞数量的减少SFTSV N-positive 16 h p。,which was considered to reflect a single round of infection based on our results shown in补充图3影响,建议surfactin SFTSV基因组复制,直到病毒蛋白(N)的翻译。排除的可能性减少病毒效价不是由于surfactin结转,培养基被替换为新的媒体,并不包含surfactin和孵化一个附加的6 h。然后,病毒效价之间的文化的上层清液比DMSO和surfactin-treated(之前媒体替代)细胞。结果表明多个日志减少16 h surfactin治疗后病毒效价比控制DMSO-treated细胞(图5 e)。这个结果也表明surfactin减少病毒生产从17到23 h p。然而,减少病毒的生产在这一点上可能部分由于降低病毒复制,如N表达水平,而不是装配和/或出芽的过程。

抑制NF-κB信号通过surfactin可能的机制之一anti-SFTSV函数(30.),因为报道NF-kB抑制剂减少SFTSV复制(31日)。然而,其他人已经报道,surfactin激活NF-κB巨噬细胞(32)。是很重要的,揭示了surfactin anti-SFTSV活动的分子机制,包括其影响NF-κB细胞株用于这项研究。

这里,surfactin显示目标超过两个步骤,膜融合在入口和事后报关步骤,在SFTSV感染,并直接影响病毒粒子信封,使surfactin-resistant突变病毒的出现困难。surfactin可能也可能表现出添加剂和/或协同作用的anti-SFTSV影响较低的数量比在这项研究中所使用的应用与其他anti-SFTSV化合物。在这项研究中,很明显,从文化中提取化合物肉汤的海洋生物可以作为潜在的抗病毒药物,如surfactin。我们还表明,利用战略获得高效液相色谱在大规模种植是一种有效的方法来确定目标化合物。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

苏和KT设计项目。苏、JT, YW, MS和彝语进行了实验。苏、y和KT分析结果。苏和KT的草稿准备手稿,JT, YW, MS, y,咦,MI,客户至上,欧美,KT支持项目的初稿和修改手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

本研究部分支持的平台项目支持药物发现和生命科学研究(支持创新药物研究和生命科学研究的基础(绑定))日本医学研究和开发署(艾湄湾)授予数字JP21am0101088和JP21am0101096。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fviro.2022.1064265/full补充材料

补充图1 |MS / MS分析分数36(一)37岁的(B)38岁(C),39(D)。分析表明,surfactin同系物是包含在分数。

补充图2 |信息膜在低pH州立76细胞融合。实验以同样的方式执行至于Huh-7细胞()。

补充图3 |SFTSV N表达和病毒生产的起始。Huh-7细胞感染SFTSV在0、6、8、10、12、16、24 h p。文化上层清液收集测量病毒效价和细胞溶解产物收集检测SFTSV N和肌动蛋白sds - page及免疫印迹分析。低收入和高强度的小组准备相同的结果。

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