胞质尼帕病毒包涵体蛋白质不使用规范Aggresome途径招人

介绍

尼帕病毒是生物安全水平的实验室4 (BSL-4)分类副粘病毒引起严重呼吸道或脑炎的疾病在猪和人类(1)。和合是东南亚的自然宿主果蝠,零星的病毒传染给人类,通过直接溢出(NiV-Bangladesh)或通过猪作为中间宿主(NiV-Malaysia) (1- - - - - -4)。和合是上市蓝图的优先级列表病原体由世界卫生组织,因为人畜共患感染导致高度致命的人类疾病,也可以在人与人之间传播,而没有批准治疗治疗(5)。

你们的一员henipavirus属在家庭中副黏液病毒科与单链消极意义上讲,是一种包膜病毒RNA基因组编码的六个结构蛋白。两个和合表面糖蛋白受体结合G蛋白融合蛋白(F),所需的病毒进入细胞和支持和合在感染细胞的扩散和信息融合或合胞体形成(6)。在病毒颗粒或感染细胞,病毒RNA被核衣壳蛋白(N)使壳体化,磷酸化蛋白(P),和大病毒聚合酶(L)一起构成所谓的核糖核蛋白复合体(RNP)。和合基质蛋白(M)位于内部的病毒信封和相关联的内在传单感染细胞的质膜(7)。M蛋白链接RNP和合表面糖蛋白,是绝对必要的装配和释放的传染性和合粒子(8- - - - - -10)。

与一个不分节段RNA病毒基因组,和合属于订单Mononegavirales(MNV),其成员具有诱导胞质包涵体的形成(IBs)在感染细胞。这些肠易激综合症通常被称为病毒工厂,集中所有病毒核衣壳组件和已被证明是病毒信使rna合成的主要网站和基因组复制在许多MNV感染(11)。除了病毒蛋白,IBs含有多种宿主细胞直接或间接结合的蛋白质病毒组件。然而,对于大多数这些宿主蛋白质,在IBs的功能作用是未知的(11)。

当前蛋白质的的概念,描述了MNV感染肠易激综合症membrane-less隔间,共同属性与液体细胞器或生物分子冷凝物。,IBs表示动态和移动结构规范的液-液分离阶段,可以融合和隔离(11,12)。也类似于液体细胞细胞器隔间,肠易激综合症通常是异构在大小和集中特定病毒和细胞蛋白质,而另一些则被排除在外。在感染细胞,MNV IBs包含病毒rna的蛋白质。cotransfection系统,它可以概括IBs在感染细胞形成的基本性质,细胞rna在肠易激综合症。和合,最小要求形成的胞质IBs的coexpression两核衣壳蛋白;核蛋白(N)和磷蛋白质(和合P),形成小RNP-like结构与细胞rna (13,14)。

尽管和合形成典型的胞质肠易激综合症,它不同于其他MNVs另外形成一个第二,独立IB人口紧密结合与质膜(14)。这些所谓IB-PM可能代表和合装配平台,依靠功能和合基质蛋白在质膜上。如果16 M是完全缺乏或装配缺陷,只有胞质IBs和没有IB-PM形成。因此,和合粒子形成和释放是大大受损,尽管细胞内病毒在感染细胞RNA和蛋白质合成正在进行(14,15)。因此,IB-PM大大不同于胞质IBs的严格与质膜,重要的是,通过含有病毒M蛋白,形成既不需要也不存在于胞质和合IBs (14)(图1)。

病毒感染宿主细胞始终是一个压力源,和大规模生产过剩的病毒蛋白质的因素之一。快速生产所需的高水平的病毒蛋白质、病毒劫持细胞机制和潜在的饱和成熟(所需的特定的折叠途径16)。因此,感染可以导致大分子拥挤和proteotoxic压力可以压倒细胞蛋白质重折叠的能力陪伴和ubiquitin-proteasome退化系统(17- - - - - -19)。因此,采用非病毒或细胞蛋白质错误折叠构象可以形成微团聚体在细胞质中,如果不是退化或隔离,可细胞毒性和干扰生产病毒复制。Proteotoxic压力可以通过形成限制juxtanuclear aggresomes在微管组织中心(MTOC)。Polyubiquitinated蛋白质与组蛋白脱乙酰酶6 (HDAC6),港口一个泛素和动力蛋白绑定域名,和作为一个适配器逆行运输ubiquitinated错误折叠蛋白沿着微管(MTs) (20.)。微团聚体中形成细胞质外围也可以积极运往juxtanuclear aggresomes通过ubiquitin-independent途径。这是由co-chaperone Bcl-2-associated athanogene 3 (BAG3),可以直接传输错误折叠蛋白基质绑定到热休克蛋白70 (Hsp70)太电机动力蛋白(21)。Aggresomes因此作为细胞质招聘中心沉积蛋白质错误折叠或过表达。如果proteotoxic压力继续和蛋白质总量隔离aggresomes不能复合隔离或退化的蛋白酶体组件,aggresomes终于通过自噬过程。

虽然aggresomes诱导甚至采用复制一些,主要是DNA病毒(22- - - - - -24中描述),aggresome形成不是MNV感染,表明这些进化其他机制干扰或限制proteotoxic aggresome形成压力。这些机制之一可能是胞质IBs的形成,除了积累的大量表达病毒复制所需的病毒蛋白,可以另外削减非必需的蛋白质,从而发挥一些aggresome-like函数。这个想法是基于我们之前的观察,胞质和合IBs相关MTOC和aggresomeγ-tubulin标志,并不仅浓缩病毒核衣壳蛋白还隔离无关的胞质蛋白如mCherry (图2)(14)。除了不相关的蛋白质,一些缺陷和合蛋白质也可以隔离胞质和合肠易激综合症。例如,和合基质蛋白突变后,积累大量的核(M_NESmut)被发现在胞质肠易激综合症,限制核积累的非功能性M蛋白在感染细胞(15)。针对他们的隔离能力潜在proteotoxic蛋白质,胞质和合肠易激综合症被认为与细胞aggresomes分享一些功能性质。然而,目前还不清楚,规范细胞aggresome通路是否参与。为了解决这个问题,本研究旨在确定胞质NiV-IBs劫持aggresome组件和在多大程度上aggresome形成机械需要形成肠易激综合症或削减不必要的过多的蛋白质的胞质边缘。

结果

Aggresome NiV-Infected细胞形成

首先澄清是否病毒蛋白质的快速和高表达在和合感染触发aggresome形成,我们Vero76感染细胞与和合感染复数(MOI) 0.05 24 h。探测aggresomes p62细胞被染色,这是一种支架蛋白质和细胞的典型标记aggresomes (补充图1)。疣状NiV-infected和合N蛋白的细胞用于可视化和合肠易激综合症。正如所料,和合感染导致大型多核体的形成,在多个IBs在细胞核周围的和周边地区被发现(图3一)。感染显然没有触发aggresome形成,p62只发现分散在细胞质中,不与IBs与积累在细胞核周围的地区,独立aggresome形成通常观察到的地方。在这么晚没有aggresomes NiV-infected细胞感染时间点支持,和合发展替代机制来限制proteotoxic压力或抑制aggresome通路,从而积极预防aggresome形成。测试后,我们治疗感染细胞的蛋白酶体抑制剂bortezomib, fda批准的药物用于治疗多发性骨髓瘤(25),诱导aggresome形成。所示图3 b,bortezomib引起的形成juxtanuclear aggresomes与特征p62同样在未感染和感染的细胞免疫反应性(图3 b)。在NiV-positive细胞,aggresomes与与肠易激综合症和阻塞IB形成本身,证明这两个结构可以形成独立同时位于相同的单元中(盒装的地区图3 b, C)。由于aggresomes只在感染细胞形成人为地抑制蛋白酶体时,proteotoxic压力似乎是有限的,尽管强大的病毒蛋白的表达。这符合肠易激综合症可以接管一些aggresomal函数隔绝大部分的胞质和合蛋白质。

Aggresomal标记蛋白质和合夹杂物

aggresomal脚手架蛋白p62只是aggresomes但不是在IBs中发现,这提高了问题在多大程度上肠易激综合症和aggresomes有不同的蛋白质组成。因此我们colocalization执行不同的标记蛋白的研究中发现细胞aggresomes (补充图1)和胞质IBs NiV-infected或16 N和P coexpressing细胞,即最小和胞质IB形成足够的要求(14)。

在N / P-coexpressing IBs NiV-infected细胞和细胞包含p62 (图4 a, B前面板)。我们发现无论是26 s蛋白酶体亚基还是poly-ubiquitin,表明proteasome-ubiquitin机械不是招募肠易激综合症。按照我们以前的报告(14),肠易激综合症没有波形蛋白笼。因此,肠易激综合症的蛋白质成分明显不同于细胞aggresomes (补充图1)。然而,我们发现的重要aggresomal标记蛋白质,HDAC6和Hsp70 / BAG3 (图4 c, D)。HDAC6和Hsp70 / BAG3参与MT-driven ubiquitin-dependent和ubiquitin-independent aggresomal运输途径,连同我们的观察,和合IBs包含MTOCγ-tubulin标志(14),可能表明有aggresomal运输通道的功能角色IB的形成。

HDAC6和太抑制剂对IB形成和和合复制

检测HDAC6和BAG3提出质疑和合利用aggresomal通路形成肠易激综合症,或支持功能的病毒复制。为了解决这个问题,我们首先测试tubacin的影响,高度有效的和cell-permeable HDAC6抑制剂,最近显示影响复制的RNA病毒(26,27)。Tubacin块HDAC6的主要酶的功能,这是不同的脱乙酰作用细胞蛋白质,包括α-tubulin从而调节太稳定和MT-dependent胞内贩卖。所示的免疫染色和免疫印迹分析图5 a, B清楚地表明,tubacin Vero76细胞治疗24小时增加乙酰化微管蛋白的细胞内容HDAC6抑制的结果。也在NiV-infected细胞培养,actetylated tubacin-treated细胞微管蛋白增加相比DMSO-treated细胞(图5 c)。然而,病毒复制不受影响(图5 d)。尽管tubacin后直接添加到感染细胞的病毒吸附,因此目前从最早的复制步骤,许多IBs的形成和传播感染通过信息融合和合胞体形成是安静的,表明生产病毒蛋白质合成(图5 c)。符合,病毒滴度tubacin-treated上层清液的细胞没有显著降低(图5 d)。因此可以得出结论,HDAC6既不是所需的酶功能IB形成和和合复制。然而,这并不排除这种可能性,HDAC6需要作为一个适配器蛋白质提供IB组件。HDAC6, Hsp70沿着MTs / BAG3-mediated主动运输过程,提供蛋白质aggresomes诺考达唑是可以预防的,MT-interrupting抑制剂(20.)。解决这样的活动是否MT-dependent运输过程可能需要IB形成或病毒复制,NiV-infected细胞处理250海里诺考达唑,浓度,摧毁了MTs Vero76细胞(图6)和预防MT-dependent细胞aggresome形成以最小的细胞毒性(补充图2)。尽管NiV-infected太破坏细胞,病毒复制基本未受影响。肠易激综合症(形成图6 b在上层清液)和病毒滴度没有显著减少(图6 c)。这使我们得出结论,尽管IBs包含HDAC6和Hsp70 / BAG3,抑制的MT-dependent aggresome通路没有对IB形成或病毒复制的影响。

肠易激综合症和Aggresomes封存过表达的蛋白质

尽管标记蛋白质成分的差异,肠易激综合症和aggresomes既能削减过表达的蛋白质可能积累广泛分布在胞质。评估肠易激综合症的相同点或不同点和aggresomes关于招募从胞质蛋白的能力,我们比较他们的隔离能力中胞质蛋白使用三个模型“guest”蛋白质。我们分析可溶性mCherry,我们已经知道是招募IBs和两个功能缺陷和合M蛋白,它尚未检测肠易激综合症的招聘。其中一个是mCherry-tagged和合M (mCh-NiV米),这是装配缺陷,因为它不能与和合N蛋白和核衣壳,但经历了一个核运输,然后运送到质膜像野生型和合米(14)。第二个M蛋白是5米_NLSmut核进口,它有一个缺陷信号和无法接受核运输(8)。米_NLSmut因此在细胞质中积累没有到达等离子体膜。

所示图7、可溶性mCherry但不是mCherry-tagged和合M积存在肠易激综合症。亦然,mCh-NiV M但不是mCherry隔离aggresomes (图7 b)。米_NLSmut被发现在肠易激综合症和aggresomes (图7 a, B底部面板)。因此,只有一个蛋白质的三个模型结构隔离。

确定招聘的两个“客人”蛋白质IBs取决于HDAC6——或者BAG3-dependent运输途径,我们评估了封存mCherry和M_NLSmutIBs在tubacin或诺考达唑。所示图8,没有一个抑制剂影响IBs的封存。这些研究结果清楚地表明,肠易激综合症不仅不同结构从aggresomes只包含一些主要aggresomal标记蛋白质,但也有不同的“客人”蛋白质特异性和招募那些没有使用活跃MT-dependent传输通路。

讨论

大量的蛋白质已确定的病毒IBs MNV-infected细胞(11)。然而,这些联系的确切作用以及底层隔离机制知之甚少,最有可能的特定个人病毒MNV秩序。在这里,我们表明,胞质和合IBs和细胞aggresomes分享相似的细胞内的位置(细胞核周围的),一些组件(γ-tubulin、HDAC6 BAG3)可以部分隔离相同的胞质,潜在proteotoxic蛋白质,如transport-defective和合M_NLSmut。虽然这表明功能相似性、和合IBs和aggresomes在许多重要特征不同。抑制水解酶和HDAC6抑制剂,也不破坏MTs的正面或负面的影响IB形成或封存的蛋白质为肠易激综合症。因此,规范运输途径aggresomes (MT-dependent HDAC6和BAG3通路)不需要和合IBs的蛋白质积累。符合他们的差异和蛋白质形成隔离通道,肠易激综合症不集中polyubiquitinated蛋白质和不包含的aggresomal标记蛋白proteasome-ubiquitin机械、p62或26。

肠易激综合症Aggresomes采用功能性质

支持的想法,肠易激综合症和aggresomes可能不同但互补的隔间,aggresomes引起bortezomib和合感染细胞的治疗可以形成,但没有colocalize IB形成以任何方式与肠易激综合症或影响。进一步发现aggresomes,尽管它们可以人为诱导,并不形成任何时候和合感染期间支持的想法proteotoxic造成过多的压力新创病毒蛋白合成的胞质是阻止这些蛋白质的浓度在肠易激综合症。上集中和合复制所需病毒核衣壳蛋白,IBs可能有助于限制隔离过表达细胞应激反应(客人)从细胞质蛋白,功能不需要IBs(这里显示mCherry和transport-defective和合M_NLSmut)。我们假设和合感染不会受益于额外的aggresome形成,因为这种细胞应激反应可能引发进一步的过程,最终抵消生产复制。尽管aggresomes应该减少proteotoxic压力,仍然,尽管如此,细胞毒性。例如,泛素的封存aggresomes泛素可能导致饥饿,这可能导致DNA损伤反应不足自组蛋白的泛素化是一个重要因素进行DNA蛋白定位和修复(28)。Aggresomes也削减其他关键部件包括监护人或水解酶,可能引发积极的反馈循环增加蛋白质错误折叠(29日)。形成的aggresomes MTOC也一直与中心体的毁灭,这对纤毛的形成至关重要(30.)。此外,aggresome的细胞核周围的定位应该是导致核膜的扭曲,这可能会影响核质传输过程(31日)。aggresome形成的所有这些后果会严重影响感染细胞的细胞体内平衡,肠易激综合症的aggresome-like能力收集过表达蛋白可能是一种限制可能干扰病毒复制的细胞毒性效应,cell-cell-spread,和合装配和释放。

Aggresomal通路参与IB的形成和在“客人”蛋白质封存

发现无论是蛋白酶体抑制(bortezomib),也不是HDAC6抑制(tubacin)也太破坏(诺考达唑)影响IB形成或蛋白质封存表明主动运输流程和规范aggresome运输途径无关。关于IB的形成,这是符合肠易激综合症的概念,类似于生物分子冷凝物,液-液分相形成。基于其内在属性,和合N和P蛋白触发他们的优惠分区在密集的阶段,与他们的内在无序蛋白质域作为一个至关重要的分母驱动胞质IB形成液相分离(11,12)。符合这个模型中,无论是HDAC6抑制(tubacin)还是太破坏(诺考达唑)影响IB形成N / P-coexpressing或NiV-infected细胞。尽管大型IBs的数量nocodazole-treated NiV-infected细胞略增加(补充图3),没有一个抑制剂对和合浓度有重大的负面影响。这表明,无论是HDAC6还是MTs和合复制中起着重要的作用,蛋白质运输和组装,这与狂犬病或麻疹病毒的发现,在诺考达唑功能受损的IB形成和复制(32,33)。

有趣的是,似乎是一个高效液相分离过程不仅和合IBs的形成,也为胞质蛋白的浓缩病毒复制不需要在IBs (mCherry, M_NLSmut)。以来所有的抑制剂防止封存的“客人”蛋白质,它可以假定他们不积极运往肠易激综合症,而是其内在生物物理特性引起的优惠分布密集阶段和封存在肠易激综合症。促进相分离蛋白质特性例如内在障碍,动态构象,多义性,核酸绑定或低聚物的性质(34)。正如上面提到的,病毒核衣壳蛋白如和合N和P驱动相分离所需的属性没有其他组件在达到一个阈值浓度(11,12)。我们假设,描述等细胞冷凝压力颗粒或P的身体(35),胞质和合IBs作为支架或种子肠易激综合症,然后招募其他蛋白质,不能自发地形成生物分子冷凝物。招聘“客人”的蛋白质可能取决于一般的静电性能与芳香残留视为“贴”和极地半个“逆电流器”(36)。一边,封存的“客人”蛋白质可能需要一些分子拥挤导致蛋白质凝结,这增强了分区的密集的液相的种子IBs (37)。支持了这个观点的描述通常大约三分之一的细胞是由大分子和净蛋白质-表面电荷之间的排斥力可能阻止蛋白质聚合。蛋白质浓度的增加可以扰乱平衡,允许蛋白质进行冷凝饱和浓度(37,38)。符合这个概念,只有“guest”蛋白质,实际上在细胞质中积累隔离肠易激综合症。一方面,transport-defective和合M_NLSmut,不能接受核运输所需向前传输到质膜(8),因此在细胞质中积累。另一方面可溶性mCherry。尽管胞质积累更为有限,因为中相当大一部分mCherry驻留在细胞核,胞质阈值所需的分区IBs是不过了。形成鲜明对比的“客人”两个蛋白质浓缩在肠易激综合症,mCherry-labeled和合M文件不存在。mCherry-NiV M的最有可能的原因是,像野生型和合M,迅速有效地输送到质膜(8,14),不积累足够在细胞质中隔离肠易激综合症。

结论

肠易激综合症病毒已知在病毒生命周期的重要功能。许多病毒这些“病毒工厂”代表复制的网站积累所有病毒组件必不可少的这个过程,也保护病毒RNA从胞质识别传感器(11)。因为和合IBs不仅积累病毒蛋白质还没收过表达胞质蛋白,他们可能会提供一个额外的功能限制proteotoxic压力期间感染。尽管典型aggresomal标记蛋白质如γ-tubulin HDAC6, BAG3存在于胞质肠易激综合症,和合核衣壳蛋白和蛋白质浓缩在IBs运输“客人”通过HDAC6——或者MT-dependent通路。这种独立性在主动运输机制符合和合IBs是生物分子冷凝物的概念,本质上引起的液-液分相形成无序区域的病毒核衣壳蛋白。不需要额外的细胞因子。然而,一旦形成,肠易激综合症可以招募“guest”蛋白由于其生物物理属性。通过分离不仅复制所需的病毒蛋白,也非功能性中蛋白质从细胞溶质,IBs可能减少感染细胞proteostasis的影响,从而提高细胞健康和防止细胞应激反应,这可能会抵消病毒复制或感染细胞的生存。

材料和方法

病毒感染

所有感染实验进行了生物安全四级(BSL-4)条件下的病毒学研究所,菲利普斯马尔堡大学。

的和合_马来西亚(5)隔离使用之前在这项研究中被描述(39)。Vero76细胞(写明ATCC crl - 1587)被种植在杜尔贝科修改鹰的介质(与10%胎牛血清的DMEM Gibco) (FCS), 100 U青霉素毫升⁻¹,0.1毫克链霉素毫升⁻¹谷酰胺和4毫米。支流Vero76细胞感染和合的莫伊0.05或1对1 h在37°C。病毒吸附后,细胞被洗五次DMEM 2% FCS然后在DMEM培养2% FCS在37°C。感染细胞抑制剂研究孵化了介质包含250海里诺考达唑(Selleck化学物质),10μM tubacin (Selleck化学物质),50 nM bortezomib (Selleck化学物质)或DMSO (Wak-Chemie)。

上层清液的感染细胞的病毒滴度量化了连续稀释Vero76细胞组织培养感染剂量确定50% (TCID₅₀/毫升)。病毒滴度的三个个人实验提出了均值±SD和统计比较了使用一个未配对t以及。

质粒,转染

pCG和pCAGGS-vector表达质粒编码5 M,和合N和和合PeGFP, mCherry和mCherry-NiV M前面描述的(14)。生成pCG-NiV-M_NLSmutQ5定点诱变工具包(内)被用来替代四精氨酸由两部分构成的核本地化的信号和合M地位244年和245年以及256年和257年由标明丙(8)。所有转染实验进行使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的协议。四个小时后转染(僵化)中被交换。抑制剂研究转染细胞与孵化中包含250海里诺考达唑10μM tubacin或DMSO溶液。

共聚焦免疫荧光分析

转染细胞组织化学染色,Vero76细胞生长在玻璃盖玻片和4%多聚甲醛固定在24 h p在DMEM (PFA,默克公司)。PFA就熄了0.1米甘氨酸与MgCl PBS补充₂和CaCl₂(PBS^{+ +})。然后,细胞permeabilized 0.1% Triton x - 100(默克公司)在PBS^{+ +}或冰冷的甲醇/丙酮(1:1)和治疗blocking-buffer含有2% BSA(美国赛瓦)、5%甘油(罗斯),0.2% Tween20(σ),0.05%的南₃(默克公司)。主要抗体稀释在blocking-buffer和添加1 h与适当的Alexa其次是孵化Fluor-conjugated二级抗体45分钟。列表中提供了不同的抗体及其稀释补充表1。在感染细胞,内源性细胞蛋白的免疫染色是在18 - 24 h内pi BSL4实验室如上所述使用Alexa萤石568 -共轭二次抗体。内源性蛋白质的染色后,感染细胞灭活与4% PFA 48 h和从BSL4实验室中删除。PFA被0.1甘氨酸在PBS再次熄灭^{+ +}。可视化病毒肠易激综合症,和合N是沾豚鼠和合抗血清(GP3)和Alexa萤石488 -共轭二次抗体。与5%阻塞后兔血清,和合M检测与一只兔子和合M-specific抗血清(IG1321)贴上Zenon Alexa萤石647兔免疫球蛋白标记工具(ThermoFisher)如前所述14)。细胞核与4’,6-diamidino-2-phenylindole复染色(DAPI)。然后,盖玻片与mowiol安装(Calbiochem)和分析使用共焦激光扫描显微镜(徕卡TCS SP5 II)。

sds - page及免疫印迹

确定乙酰化的总表达α-tubulinβ-actin,细胞细胞溶解样品缓冲中含40%甘油(罗斯),0.1%溴酚蓝(默克公司),200毫米三pH值6.8(罗斯),8% SDS(罗斯)H₂O, 4%β-mercaptoethanol(σ)补充道。减少条件下的蛋白质10% sds - page分离和转移到硝化纤维膜。阻塞与脱脂奶粉5%解决方案后,蛋白质与特定的染色主要抗体,生物素化的二次抗体和peroxidase-conjugated链霉亲和素和探测到增强化学发光(SuperSignal西硬脑膜衬底,ThermoFisher)。抗体和稀释中列出补充表1。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

注和研究设计和构思,写了这篇文章,和分析数据。NB和啊进行实验。所有作者同意手稿的最终稿,促成了这篇文章,并批准提交的版本。

资金

这项工作由德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、德国研究基金会)(Projektnummer 197785619 - SFB 1021)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

确认

所有感染研究进行了生物安全四级(BSL-4)条件下的病毒学研究所,菲利普斯马尔堡大学。我们感谢所有BSL-4员工的支持。我们感激地承认亨氏Feldmann提供豚鼠anti-NiV抗体。我们也感谢实验室所有成员的关键和支持评论这项工作。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fviro.2021.821004/full补充材料

补充图1。细胞标记蛋白质bortezomib-induced aggresomes。50 nM bortezomib Vero76细胞治疗(一)24 h诱导aggresome形成或DMSO溶液(B)作为一个控制。细胞被固定为4% PFA和permeabilized甲醇/丙酮或特里同x - 100。细胞蛋白与特定的抗体标记(红色)。核与DAPI复染色(蓝色)。图像记录与徕卡SP5共焦激光扫描显微镜。Aggresomes盒装领域内所示更高的放大倍数。规模的酒吧、10μm。

补充图2。诺考达唑预防MT-dependent aggresome形成。(一)Vero76细胞治疗与不同浓度的诺考达唑(noco)或DMSO溶液。18 h后细胞生存能力评估与“准备探测细胞生存能力成像工具”(表达载体)。确定死细胞的百分比,10个随机选择的图像从两个独立实验量化为每个诺考达唑浓度(> 10.000)细胞。误差线表示标准偏差。统计分析了棱镜用单向方差分析与Dunnett多个比较测试。^{* * * *}p< 0.0001;n。,not significant.(B)Vero76细胞治疗50 nM bortezomib (BZ)或50 nM BZ连同250海里诺考达唑24 h。细胞被固定为4% PFA和permeabilized Triton x - 100。aggresomal标记蛋白p62标签与一个特定的抗体(绿色)。核与DAPI复染色(蓝色)。图像记录与徕卡SP5共焦激光扫描显微镜。规模的酒吧、10μm。

补充图3。抑制剂治疗对IB NiV-infected细胞大小的影响。Vero76细胞感染和合的莫伊0.05和处理10μM tubacin 24 h(一)或250海里诺考达唑18 h(B)。细胞被固定为4% PFA 48 h和应用15 N抗血清可视化肠易激综合症。比较IB大小分布在DMSO和inhibitor-treated细胞,肠易激综合症的数字和地区至少5个不同的合胞体在ImageJ用粒子分析仪测量功能。统计分析与使用Holm-Sidak棱镜t以及多个比较。误差线表示标准偏差(SD);^*p< 0.05;n。,not significant.

补充表1。抗体和稀释列表用于免疫染色和西方的屁股。

引用