唾液COVID-19测试:简单但无用的或被低估的资源呢?

介绍

自第一SARS-CoV-2感染的报道在2019年末,有一个新兴的接受需要共存与病毒在我们的社区。疫情控制至关重要,需要大规模的测试在可预见的未来,远远超出大规模疫苗接种计划。一般人群感染率监测提供了有价值的实时数据,传播和人口统计(1)。监控新变异的重要性、流行和逃避免疫能力突出了三角洲和γ变异(2),现在δ+。2021年8月,30亿年70%的疫苗生产是在10个国家比1%在发展中国家。新变种会从世界卫生组织称为“双层大流行”,因此保持再感染的周期¹。

SARS-CoV-2检测、公共测试方案通常依赖于鼻咽拭子侧流或聚合酶链反应测试(分别为肝功能或PCR)。高特异性和敏感性(大约在95 - 99%),PCR方法的支柱COVID-19测试,采用提取的RNA逆转录酶定量PCR (RT-qPCR)或环介导等温扩增(灯)。肝功能检测抗原表位在病毒蛋白,给予5%−70%的敏感性相对于RT-qPCR SARS-CoV-2基因组的检测(3,4)。肝功能检测极限大约在100病毒复制/μl (5),10 - 100倍比PCR方法不敏感。

继续讨论每种方法的优劣有关成本、劳动力、部署、路线和结果好转。然而,一个常见的问题是使用鼻咽拭子(6)。一个普遍的错误存在于未能达成正确的鼻咽目标站点,即使由训练有素的医学专家(7,8)。缺乏经验或自行运营商融通的子- 50%的敏感性,不确定性在多大程度上“向上”或“返回”拭子应该或者什么“角”和“多久”。在最好的情况下,这将导致不适,因为拖把挤在中间鼻甲(7),阻止定期重复测试。在最坏的情况下,假阴性结果导致轻松放大病毒传播的行为。事实上,许多人公开COVID-19症状报告说他们检测均为阴性通过多个连续的肝功能在天但RT-qPCR积极方法。

忽视对SARS-COV-2唾液检测的好处

这个角度看的目的是促使唾液直接讨论和亮点RT-qPCR SARS-CoV-2检测作为一个替代方法,迄今为止被忽视的主流测试。唾液样本避免入侵的问题,定性鼻咽拭子的简单规定,更少的可变性和更多的可靠性,因为100年卷μl是可以接受的。据坊间传言,早上在吃食物之前提供的样品,刷牙,或者使用口腔卫生产品,如漱口水,提供高质量的样品。我们的无症状的测试服务²。(大学伦理委员会批准批准fmh 96 - 0920)目前正在评估如果简化收集路线敏感的社区受益,如特殊教育、老年痴呆症患者,无家可归的旅馆,或者性虐待的受害者,任何认为渗透是不受欢迎的。

直接唾液RT-qPCR检测的其他好处如下:(i)减少感染的风险,员工进行抽样,因为self-harvesting很容易。(2)样品的稳定性;至少20天没有病毒传输介质(见4°C图1)。(3)没有RNA-extraction步骤,减少测试时间和成本。(iv)样品池的可能性增加吞吐量和降低成本。(v)不与其他诊断方案,因此制造商增加产能没有额外的需求。(vi)更少的组件,减少供应链问题,在世界范围内被高亮显示的重要性缺乏鼻咽拭子(9)。(七)比较敏感的高特异性/鼻咽swab-based检测(3,6,10- - - - - -12)。

强调这些好处,从2020年11月到2021年2月,诺丁汉大学提供免费的本科生(通常18-22-year-olds)肝功能使用鼻咽拭子(由英国政府提供的)和RT-qPCR测试使用唾液收集艾滋病(由我们提供服务)。大约在20000测试完成,证据为由,可靠性和信心的结果为什么偏好对唾液测试(13)。

唾液是未得到充分利用的原因还不清楚,但可能是由于历史原因,缺乏文献数据的准确性。事实上,近一年进入大流行(2020年底),美国传染病学会指南称,“唾液作为唯一样本来源COVID-19诊断不能推荐由于缺乏研究”(14)。然而,其他研究显示使用唾液SARS-CoV-2检测灵敏度高,其中有一个更高的相关性小心worker-collected鼻咽拭子比self-sampled前鼻拭子(15- - - - - -17)。另一个因素是小样本大小和不清楚唾液取样方法,毫无疑问是一个冲突的根本原因与鼻咽拭子的水平相关³。

在我们自己的服务,与唾液作为诊断样本相关的问题是相对温和的好处。例如,当我们克服潜在的背景荧光问题通过使用double-quenched IDT(内部调查的禅宗冷却器碱基对从5 ' 9点结束;IowaBlack冷却器在3 '末端),水平之间的互补性N1和E底漆/探针集(和/或扩增子)引起的异常扩增曲线,这只能是克服转向N2和E .我们也发现的病毒基因组测序的唾液可以是一个挑战,可能由于分散的病毒RNA。

唾液内的杂质和抑制剂可能有问题,但可以克服如果处理结合兼容RT-qPCR反应混合,如下解释。池确实提出了最大的挑战敏感性由于倾斜杂质与病毒基因组单位体积的比例。当我们发现单唾液样本的检测极限是< 1病毒基因组/μl,八个样本结合双向池的最大灵敏度降低到4病毒基因组/μl。影响样本的样本与介质低病毒载量可以忽略不计,但当Ct值超过30,混合样品的检测错误率降低精度小于99%。虽然这个水平是必需的,英国监管机构诊断SARS-CoV-2,唾液样本是一个有吸引力的,尤其是当需要质量监控在宽松的社会距离和旅行禁令。

的循证管道SARS-COV-2使用唾液检测

简单的,流线型的我们使用的管道图1一个,而图1中显示生成的数据2020年9月至2021年7月从常规测试在诺丁汉大学工作人员,学生,和支持服务。写作时(2021年10月),大约在从23740年96317年样本处理独特的捐助者,收益率465年积极的测试结果。关键方面如下。

收获

捐助者提供密封塑胶袋中包含集合管(双线性和QR条形码;布鲁克斯有限公司产品(65 - 7643)),组织,纸草(切~ 5厘米的长度;购买通过亚马逊从IntrinsicPaperStraws.com,项黑色6×140毫米),和逐步指南⁴。为了避免外源性污染物,捐助者要求提供唾液样本在早上在吃之前,刷牙,或者使用口腔卫生产品,符合指南从欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)(见注释3)。

失活

唾液样本是烘焙的目标温度为95°C / 5分钟灭活和裂解病毒,因此简化安全程序和绕过需要有毒化学物质和/或RNA提取。同时,至少在我们的经验中,加热使棉签和/或病毒变得更加粘稠的传输媒介,与唾液,效果是增加样本流动性。这是至关重要的,然而经常被忽视,因为兼容下游液体处理流程。

池,然后RT-qPCR

当感染的患病率较低(< 6%),样品配置到双向的六到八个样品池每池一步RT-qPCR与疾病控制中心(CDC) primer-probes N和/或E基因。关键点如下:(i) Quantabio UltraPlex互译ToughMix RT-qPCR试剂,用于使用样本含有高水平的潜在的抑制因素。(2)积极汇集deconvoluted和确认样品通过单身,未共享测试。如果普遍超过6%,反褶积的复杂性变得高昂和管道违约过程单一,non-pooled测试。

支持唾液SARS-CoV-2感染的监测和诊断,我们提供直观的数据来自诺丁汉大学的无症状的测试服务。图1 b表明样品确认为积极的在我们的分析,94%的协议相关(95% CI 87.2 - -100.8)存在hospital-accredited swab-based qPCR服务。6%的差异可能是由于唾液更一致的样本收获,如上探索。同时,1 - 5天消耗之间积极的唾液结果和拭子条款;因此,病毒载量可能减少。

唾液测试后显示intra-assay精度高的重复测试相同的阳性样品14天之间的四个不同的运营商和四种不同qPCR机(图1 c)。满足监管机构和实现所需的高一致性认证(见下文)表明,热失活对灵敏度和很少或没有负面影响,有趣的是,在某些情况下可能会增加灵敏度。这可能是因为没有病毒RNA,时发生不同程度使用提取过程。在图1 d, E数量的增加,样本测试从校园人同事减少患病率在员工和学生(1 d)和10 - 100倍诺丁汉感染率低于周围的地理区域(1 e,来自英国政府的数据)。这些数据表明,早期发现是打破传播链,即使在高人口区域,如学生宿舍。

讨论

结合文献中的一些数据,我们的工作在SARS-CoV-2 RT-qPCR探测点唾液被低估的资源。通过这个角度看,我们寻求促进讨论潜在的一个错过的机会实现COVID-19监测和疫情控制。认为唾液是可以克服困难与简单的修改,如通过加热和使用一步inhibitor-resistant RT-qPCR。协助适当收集方法,欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)最近发表的(17)技术报告”注意事项使用唾液样本材料COVID-19测试”。虽然认为唾液样本集合很容易,非侵入式的、接受的重复测试,并且可以由non-healthcare专业人士,ECDC RT-qPCR测试不同的报道指出,性能高和低敏感性与鼻咽拭子相比唾液样本。在某种程度上,异质性可能反映不同的抽样技术,采样时间,和人口正在测试的类型,ECDC技术报告探讨了(17)。

在ECDC的指导是需要提供一个样本为“收集容器,醒来后,刷牙和吃”。我们得出相同的结论在时续订的早期测试服务,因为唾液样本各种一致性和粘度减慢测试和处理时间。样本提供在吃之前可能是一个因素在精度高、敏感性,和一致性时续订内观察到的测试服务和其他实验室,有报道称,唾液提供敏感性大于鼻咽拭子对诊断无症状和轻微COVID-19感染(11)。回顾性研究提供了类似的结果。Guillaume和他的同事们(12)调查了385名引用了16个独特的研究,确定了定量合成。八同行评议的研究和八预印本包括荟萃分析(5922独特的患者),结论,诊断准确性的唾液是类似于鼻咽拭子。

其他好处包括易于捐赠,最小的侵袭性、高灵敏度测试,和准确的报告。唾液作为材料来源的稳定性也很高(图1 f),在常规分析通过RT-qPCR N1、N2、E和/或RNAseP相同的样本存储在4°C长达20天显示标准差(SD)≤1.1,变异系数(x) < 5%。这些属性意味着唾液样本优先于鼻咽拭子在我们的同伴,我们预计同样适用于社区特殊注意事项;因此,分析将增加包容性。

2021年7月,英国诺丁汉大学成为第一个大学和第一个机构在英国获得认证状态的监督机构,UKAS(英国认证服务)。这允许的结果从我们的测试服务报告直接向政府组织,英国公共卫生,从而要求捐助者阳性SARS-CoV-2遵守国家法律。在写作的时候(2021年10月),所有形式的数据集研究和协议手稿正在准备给三缸的使用测试的详细信息通过疾控中心引物N2和E以及RNAseP的内部控制,在SARS-CoV-2检测唾液后直接热失活。在这些文章中,我们将利用证据大约在100000个样本测试。这将包括UKAS认证所需的数据显示400年和谐> 99%样品积极(250 - 150),其中大多数是成双成对的拭子和唾液样本医院。我们将提供证据分析特异性、灵敏度分析(检测极限),量化的限制,诊断特异性,诊断的灵敏度、精度、样品稳定性、重复性、再现性、范围/线性/准确性、鲁棒性(控制已知的干扰),和较低的变异系数≤5.3%,即使在最粘稠的唾液样本。

收到UKAS认证意味着我们可以协助其他机构获得这种荣誉和加速和扩大自己的测试程序。同时,美国食品和药物管理局(FDA)批准紧急使用授权(欧洲大学协会)“SalivaDirect™”(18)。各种唾液RT-qPCR在开发或测试过程中监管部门批准通过FDA欧洲大学协会过程或欧盟CE标记过程,包括罗格斯大学,OraSure技术/ DNA Genotek,伊利诺伊大学香槟,和其他人。在社区监测实例池需要大量样本(每个池10个或更多),粘度有潜在的可能导致移液错误或减少SARS-CoV-2检测的敏感性,尤其是当使用直接RT-qPCR方法与低病毒载量(样本17)。这些问题是可以克服的,提取病毒RNA前池和分析但可能不需要监管机构的差异造成的。在英国,规定只允许最多4个样品池为SARS-CoV-2诊断。

唾液可能不是一个放之四海而皆准的解决方案。虽然各公司现在提供唾液抗原或抗体测试,ECDC表明当前有限的证据不支持使用这个样本材料以这种方式和需要进一步的临床验证的研究在不同的可用测试(17)。然而,即使这一立场不会改变蛋白质测试、可接受性和易用性的捐赠者的唾液样本加上审批作为诊断SARS-CoV-2基因组由多个监管机构,包括FDA, ECDC,和UKAS,是积极的。这可能是协助长期持续定期重复检测,将检测的关键新变体的出现在这两层大流行。因此,最后,唾液是作为一个合适的一线诊断测试人群中感染率调查和控制更有效、微创的方式,补充其他测试策略和提高我们的能力来控制传染性事件在未来。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

道德声明

综述了研究涉及人类参与者和诺丁汉大学伦理委员会批准,参考号码fmh 96 - 0920。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

CD是铅的计划和SP-G铅数据收集和初稿的手稿。所有作者都参与写作和导致了手稿,并运行无症状的测试服务。

资金

这项工作是由诺丁汉大学支持COVID-19无症状的测试服务和医学研究理事会紧急奖MC_PC_20027“COVID-19大学设置”。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

脚注

引用