引起的保护效果艾美球虫属最大值rhomboid-like蛋白质1对同源感染

1。介绍

鸡球虫病是一种细胞内的寄生原生动物疾病所致艾美球虫属coccidia并导致全球毁灭性的经济损失(1)。布莱克et al。(2)最近估计鸡球虫病造成的经济损失为£104亿2016年全球。在美国,鸡球虫病(尤其是e .最大值)是排名第一在烤焙用具行业的重大疾病相关问题在2019年和2020年的调查由美国动物卫生协会(3)。在英国,鸡球虫病是排名在前三个主要禽流感疾病,鉴于其经济意义(2)。在中国,鸡球虫病最近被列为3班动物疾病,根据农业部和农村事务管理局(4)。鸡球虫病的病原体是属于七apicomplexan物种艾美球虫属属(5)。在所有的鸡艾美球虫属物种,e .最大值是一种集约化养鸡场的主要病原物种(6)。例如,感染率e .最大值据报道73%的流行病学调查艾美球虫属物种由威廉姆斯等人在法国(7)。Thebo等人报道的感染率e .最大值最高的七个艾美球虫属在瑞典物种,达到63.4% (8)。McDougald et al。(9)发现的感染率为42%e .最大值,接近大肠tenella在阿根廷的流行病学调查。Bachaya等人研究了球虫病的患病率在旁遮普南部,巴基斯坦。他们发现鸡coccidia的发生率为65%,其中的感染率e .最大值为31.38%,略低于大肠tenella(10)。局域网等人取样5浙江省大型养鸡场,中国,发现的感染率e .最大值排名第三(21.1%)在其他吗艾美球虫属spp。(11)。因此,及时预防和控制e .最大值至关重要的是家禽产业的可持续发展。

目前,鸡球虫病的控制主要取决于anticoccidial药物和疫苗的使用(12)。世界卫生组织的越来越多的关注食品安全和健康,药物的频繁使用会导致物种的阻力,和动物食品的安全问题引起的药物残留的弱点也将鸡球虫病的预防和控制(13)。免疫预防是一种很有前途的方法来减少或取代anticoccidial药物的使用。目前,可用商业anticoccidial疫苗主要是活疫苗包括致命的疫苗(CocciVac-B、CocciVacD Immucox,等等)和减毒疫苗(Paracox Livacox等。)(12)。然而,使用活疫苗生产过程复杂,生产费用高,和coccidian隔代遗传的可能性,这表明替代方法研究的重要性。第一个商业化的亚单位疫苗CoxAbic球虫病,这是由蛋白质纯化本机孤立的配子体e .最大值。疫苗是通过母体免疫策略,提供预防球虫病的后代蛋鸡鸡通过接种疫苗(13,14)。然而,它的应用程序是有限的由于与抗原生产相关的困难和复杂的免疫程序(12)。

最近,有人建议,下一代anticoccidial重组疫苗是控制球虫病的新方法,因为其独特的优势,如安全、低成本、便捷的批量生产,并鼓励保护功效。几个潜在的疫苗抗原已确定开发新一代疫苗。这些候选人,在形式的质粒DNA,重组蛋白,或live-vectored配方,展出承诺保护对球虫病在减少卵囊输出和体重损失和减轻肠道病变(5,15,16)。rhomboid-like蛋白(rom)已报告在多个生物扮演各种重要角色。例如,他们参与脱落的表面丰富的薮猫apicomplexan原生动物在入侵宿主细胞(17- - - - - -19)。rom的invasion-related角色表明他们可以作为开发新型疫苗候选抗原控制禽球虫病(20.- - - - - -23)。在目前的研究中,我们评估了免疫反应和保护效果e .最大值感染诱导的挑战EmROM1在其形式的质粒DNA (pEmROM1)和重组蛋白(rEmROM1)。这项研究提供了一个有希望的候选抗原开发下一代重组禽球虫病疫苗。

2。材料和方法

2.1。寄生虫、鸡和向量

e .最大值分离、纯化和保存在我们的实验室。新鲜形成孢子卵囊是由传播通过鸡前七天挑战实验。刚孵出小鸡(Hy-Line)生长在金属笼中,提供足够的饲料和水没有anticoccidial药物。SD大鼠(Sprague-Dawley)是从Qinglongshan动物饲养农场在南京买的。大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21买来Vazyme(中国南京)。的原核表达载体pET-32a(+)是从Novagen(达姆施塔特,德国)和pVAX1.0的真核表达载体表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

2.2。EmROM1基因的克隆、表达和质粒结构

微玻璃珠(0.1 - -0.2毫米;ωBio-Tek,正在美国)被用来打破卵囊,和形成孢子卵囊的破坏率高达80% (24)。形成孢子的总RNAe .最大值卵囊被E.Z.N.A. TM总RNA提取的装备我(ωBio-Tek,正在美国)。然后反向转录分析产生互补脱氧核糖核酸的寄生虫进行总RNA作为模板使用逆转录工具包(Vazyme,南京,中国)。随后,进行PCR鉴定生成EmROM1段pET-32a-EmROM1建设和pVAX1.0-EmROM1重组向量。特定的引物# 1,即BamH我锚定引物(5′-CGGATCCATGCCTGTCTGCACACT-3′)欣三维固定反向引物(5′-CCAAGCTTTTATG CACTGCATCCCCTAT-3′)被用于构建pET-32a-EmROM1。特定的引物# 2,即BamH我锚定引物(5′-CGCGGATCCATGCCTGTCTGCACACT-3′)生态R我锚定反向引物(5′-CCGGAATT CTTATGCACTGCATCCCCTAT-3′),被用来构造pVAX1.0-EmROM1。PCR程序设置如下,一个初始变性5分钟在94°C,紧随其后的是35周期在94°C 30年代,30年代60°C, 72°C的52。最后,PCR产物的结扎了pET-32a(+)和pVAX1.0生产重组pET-32a-EmROM1和pVAX1.0-EmROM1向量,然后转换成大肠杆菌BL21 DH5α,分别。核酸内切酶消化和新重组质粒测序分析进行了验证。

2.3。纯化的重组蛋白EmROM1 (rEmROM1)和对rEmROM1制备多克隆抗体

获得rEmROM1, pET-32a-EmROM1转化细菌培养细菌溶液OD直到600年达到0.6 - -0.8的范围。然后IPTG诱导进行了推广的表达rEmROM1工作浓度的1毫米。他TrapTM FF原油工具包(5毫升;美国通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦)被用来净化rEmROM1。

准备多克隆抗体对rEmROM1 SD大鼠通过皮下注射免疫与250年在μg rEmROM1 +完全弗氏佐剂(FCA Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)。主要免疫两周后,老鼠免疫具有相同剂量的rEmROM1抗原在弗氏佐剂乳化不完全(联邦保险捐税法,Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)一周一次。第五次免疫后,从轨道获得血样静脉。进行间接ELISA检测抗血清效价和存储在−70°C。此外,天真和pET-32a标记蛋白的抗血清指的是通过上述方法,分别控制。

2.4。识别的rEmROM1反e .最大值鸡血清

的纯化rEmROM1从硝基的sds - page凝胶膜。转让后,薄膜被PBST (Tween-20磷酸缓冲盐含有0.05%)3次。洗后,膜被5% BSA在一夜之间在4°C。膜与反的主要抗体孵化e .最大值鸡血清(1:10 0稀释5% BSA) 4 h 25°C。与此同时,未受感染的鸡血清作为天真的控制。膜与PBST洗3次后主要抗体孵化。然后,膜在HRP-conjugated孵化山羊anti-chicken免疫球蛋白(1:4,500稀释5% BSA;Biodragon,北京)在37°C 1.5 h在黑暗中。俄罗斯网球洗涤后,结合抗体检测民建联工具包在黑暗中。

2.5。检测pEmROM1转录和表达的鸡

健康鸡随机分为两组。一组注射100μg pEmROM1通过腿部肌肉免疫和其他免疫与100μg pVAX1.0 -矢量控制。经过7天的免疫,肌肉得到与无菌剪刀剪成碎片从注射部位和non-injection网站,分别。随后,肌肉RNA提取了RNAiso +工具包(豆类,京都,日本)后产品指令。gDNA雨刷混合(Vazyme、南京、中国)被用来消除残余DNA或质粒。然后进行反转录产生互补。之后,与特定的引物PCR过程进行分析的转录EmROM1注射部位和non-injection网站。同时,肌肉细胞溶解2 h•瑞帕解决方案和离心得到的上层清液10000 g 10分钟与鼠免疫印迹分析anti-rEmROM1血清(1:10 0稀释5% BSA)作为主要抗体和HRP-conjugated山羊anti-chicken免疫球蛋白(1:4,500稀释5% BSA)作为第二抗体。未接受免疫接种的鼠血清作为天真的控制。

2.6。检测rEmROM1-induced免疫反应的鸡

2.6.1。动物免疫接种和样本集合

检测rEmROM1-induced免疫反应,14-day-old鸡被随机分为3组,每组30只鸡。实验组在接种200μg rEmROM1腿部肌肉的鸡。对照组与200μg pET-32a免疫标记蛋白质和200μL PBS,分别。岁的21天,升压注入了同样的协议的主要免疫。7天的主要免疫和加强免疫后,随机选择5只鸡隔离脾淋巴细胞分析T细胞和细胞因子表达子集。与此同时,鸡血清收集检测特定的抗体水平。

相同的实验政权是用来检测pEmROM1-induced免疫反应。实验组在接种100μg pEmROM1,和对照组免疫100μg pVAX1.0向量和100μL PBS,分别。

2.6.2。检测T淋巴细胞的流式细胞术从接种鸡子集

脾脏淋巴细胞分布与10 2管⁷在每个管淋巴细胞。一个是double-stained 2μL鼠标Anti-chicken CD3(美国南部生物技术协会、伯明翰)和2μL鼠标Anti-chicken CD4(生物技术协会南部、伯明翰、美国),和其他与2μL double-stained鼠标Anti-chicken CD3和2μL鼠标Anti-chicken CD8(生物技术协会南部、伯明翰、美国)。PBS对照组,淋巴细胞被分成不着色的,一个2μL CD3单染色,另2μL CD4和CD8单染色。都是在4°C的环境在黑暗中45分钟。之后,这些细胞被洗PBS和离心机在500克3分钟。淋巴细胞沉淀轻轻地吹PBS和转移到流管。淋巴细胞是通过流式细胞仪检测到石中剑流式细胞分析仪(Becton Dickinson,纽约,美国)。的PBS对照组淋巴细胞,包括不着色的CD4和CD8单染色,被用作模板管理。流式细胞仪数据处理和出口使用FlowJo V10 (Becton Dickinson,纽约,美国)。

2.6.3。检测的mRNA水平从接种鸡脾脏细胞因子定量实时PCR (qPCR)

NCBI和底漆问题工具(IDT;美国马里兰州Bethesd)是细胞因子设计引物用于qPCR (2、il - 4、il - 10、IL-17 IFN-γ,TGF-β,和TNF SF15), GAPDH作为内部控制。从孤立的RNA提取的RNA提取工具脾淋巴细胞和相对地转录成互补dna作为模板。反应包含2×10μL ChamQ SYBR qPCR大师混合(Vazyme,南京,中国),2μL cDNA、F 0.4μL底漆,底漆R, 0.4的0.4μLμL 50×火箭参考染料2 (Vazyme,南京,中国)和6.8μL RNase-Free水以一式三份。特定的引物扩增效率从90年的110%和ΔCq≧3被gradient-diluted cDNA筛选。细胞因子测定与特定的引物,mRNA水平的细胞因子被2计算^−ΔΔCt。qPCR的数据加工和出口使用7500软件v 2.3(美国应用生物系统公司,促进城市)。

2.6.4。检测抗体的免疫球蛋白水平的免疫鸡血清ELISA

血液收集免疫鸡主要免疫后,连续6年集合1周的时间间隔。血液样本被培养在37°C 1.5 h,然后把在4°C 8 h。血清得到检测免疫球蛋白抗体水平使离心后1000 g 8分钟。从鸡血清进行ELISA检测免疫球蛋白。短暂,96 -微量滴定板涂有rEmROM1或pET-32a标记蛋白质(每)1.5μg一夜之间在4°C。与PBST 5次洗涤后,盘子被封锁的4.5%脱脂奶25°C 5 h。俄罗斯洗涤后,鸡血清(1:10 0稀释)作为主要的抗体,并添加到培养板(每)100μL 25°C 3 h。与此同时,增加了负控制与外地稀释鸡血清(1:10 0稀释)和空白控制添加100μL PBS。与PBST 5次洗涤后,100μL山羊anti-chicken免疫球蛋白g(1: 4500稀释,Biodragon、北京、中国)添加二级抗体在25°C 2.5 h。俄罗斯洗涤后,板是孵化与三甲(3,3,5,5-tetramethylbenzidine) 25°C在黑暗中8分钟。最后,试验被终止,以450海里(OD_450年)通过分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,美国)。

2.7。评价EmROM1引起的保护效果e .最大值

2.7.1。动物分组和免疫

两个immunization-challenge试验进行评估疗效EmROM1引起的反对e .最大值感染。rEmROM1对抗引起的保护效果e .最大值试验1中被评估。Fourteen-day-old鸡被随机分成4组每组(30),包括实验组pET-32a标记蛋白质,挑战,和挑战。实验组有200μg rEmROM1两次的肌间的免疫每7天。pET-32a标记蛋白质组给予pET-32a标记蛋白质。质疑和挑战有无菌PBS组。

pEmROM1诱导的保护效果评价试验2对e .最大值。Fourteen-day-old鸡被随机分成4组每组(30),包括实验组pVAX1.0向量,挑战,挑战组。实验组给予100μg pEmROM1 rEmROM1免疫两次相同的方法。pVAX1.0矢量控制与pVAX1.0质粒免疫。挑战,挑战与无菌PBS对照组注射。

2.7.2。保护效果评价

七天的助推器免疫接种、鸡和1×10口头挑战⁵的e .最大值每个鸡除了挑战组形成孢子卵囊。六天的挑战感染,鸡被屠杀。EmROM1的保护效果评价记录体重增加,卵囊输出和肠道病变评分和计算anticoccidial指数(ACI) (25- - - - - -29日)。体重增加是用以下公式计算:体重在实验的挑战。存活率计算幸存的鸡的数量划分,最初的鸡。每克粪便的卵囊(功能)和肠道病变评分测定(27,30.)。ACI计算:(相对体重增加率+存活率)——(损伤指数+卵囊指数)(31日)。

2.8。统计分析

所有数据分析20 SPSS统计分析软件,并使用单向方差分析组间显著差异进行了分析。P设置为非重要> 0.05。P设置为< 0.05是非常重要的。

3所示。结果

3.1。EmROM1基因的克隆、表达和质粒结构

EmROM1基因被克隆e .最大值反转录PCR。琼脂糖凝胶电泳显示一群大约888个基点(图1),这是与EmROM1 ORF大小一致。的ORF EmROM1被构造成pET-32a pVAX 1.0,分别生成pET-32a-EmROM1 pVAX1.0-EmROM1重组质粒。大约888个基点的乐队是检查从消化pET-32a-EmROM1向量通过双酶消化(BamH我和欣d III)。同样,一群大约888英国石油公司检查从pVAX1.0-EmROM1消化BamH我和生态R i构建重组质粒测序进行进一步验证。结果表明,羊痘疮EmROM1 888个基点,共享一个相似的100%目标EmROM1序列在基因库(序列ID: XM_013479531.1)。

3.2。表达、纯化和免疫印迹分析rEmROM1

他的标签被诱导在rEmROM1大肠杆菌BL21 (DE3)和由Ni-NTA亲和色谱纯化。sds - page凝胶具有一群约50.56 kDa (图2一个),基本上是一致的总分子量rEmROM1(约32.5 kDa)和pET-32a标记蛋白质(约18 kDa)。免疫印迹确定rEmROM1被反e .最大值鸡血清(图2 b)。

3.3。注射部位的转录和表达的pEmROM1鸡

rt - pcr和免疫印迹检测用于检测的转录和表达pEmROM1注射部位,分别。同样大小的一个乐队EmROM1从肌肉组织免疫鸟类的rt - pcr检测,而对照组中没有观察乐队(non-injection网站和pVAX1.0免疫)(图3一)。免疫印迹结果表明一个乐队比预测分子量被鼠抗血清对rEmROM1 (图3 b)。然而,没有乐队被本地鼠血清。这些结果表明,pEmROM1注射部位在鸡转录和翻译的成功。

3.4。EmROM1-induced鸡的免疫反应

3.4.1。鸡EmROM1引发了一个重要的细胞免疫反应

CD4细胞的百分比⁺和CD8⁺T细胞在免疫鸡被流式细胞术检测(图4和表1)。结果表明,CD4细胞没有明显差异⁺和CD8⁺从控制T细胞比例(PBS、pET-32a标记蛋白质和pVAX1.0质粒组)主要和辅助免疫后7天(P> 0.05)。与对照组相比,CD4细胞的百分比⁺和CD8⁺T细胞在rEmROM1-immunized pEmROM1-immunized组显著增加主和加强免疫后7天(P< 0.05)。

的细胞因子转录水平由qPCR T淋巴细胞进行了分析。没有明显差异的控制(PBS和pET-32a标记蛋白质组)主要和辅助免疫后7天(P> 0.05;图5一个)。与对照组相比,细胞因子转录水平rEmROM1-immunized组显著提高的主要免疫后7天(P< 0.05)。然而,没有明显差异的转录水平IL-17 rEmROM1-immunized组与对照组(P> 0.05)。七天后助推器免疫,细胞因子转录水平除了IL-17 rEmROM1-immunized组比对照组显著增加(P< 0.05)。也观察到类似的结果pEmROM1-immunized组(图5 b),细胞因子转录水平显著增加了接种pEmROM1与控制主要和辅助免疫后7天(P< 0.05)。没有观察到显著差异的控制(PBS和pVAX1.0质粒组)的主要和辅助免疫后7天(P> 0.05)。

3.4.2。EmROM1引发了一个重要的在鸡血清抗体反应

ELISA用于检测EmROM1-induced特定免疫球蛋白水平鸡。结果表明,控制没有显著差异(PBS, pET-32a标记蛋白质,和pVAX1.0质粒组)(P> 0.05)。与控制相比,特定的免疫球蛋白水平rEmROM1-immunized pEmROM1-immunized组显著增加主和加强免疫后7天(P< 0.05)。免疫球蛋白水平明显由于升压免疫(图6)。

3.5。EmROM1引起的保护效果的评估

评估EmROM1的保护效果,两个动物试验是由免疫与rEmROM1或pEmROM1通过e .最大值挑战在鸡(表2)。试验1显示rEmROM1的保护效果。体重增加rEmROM-immunized组与对照组相比显著提高(挑战,pET-32a标记蛋白质组)(P< 0.05)。同时,免疫显著降低卵囊生产和减轻肠道病变与控制(P< 0.05)。因此,免疫rEmROM1导致了ACI为174.11,表明适度的保护e .最大值。的保护功效pEmROM1试验2中进行评估。免疫显著提高体重增加和肠损伤和减少卵囊的输出pEmROM1组与对照组相比(挑战,pVAX1.0质粒组)(P< 0.05)。免疫接种pEmROM1也产生了ACI的163.37,表明部分保护e .最大值。

4所示。讨论

rom被证明是至关重要的一些apicomplexan寄生虫入侵的由于他们的分裂能力丰富的寄生虫的表面,允许他们进入宿主细胞完全(32- - - - - -36)。例如,它已被证实,TgMIC2 TgMIC6, TgMIC12, TgAMA1被入侵期间rom水解弓形虫pfeba - 175, PfAMA1、PfRh1 PfRh4, PfTRAP被入侵期间rom水解疟原虫falciparu米(32)。在入侵大肠tenella,可以水解EtMIC4 EtROM3 (37)。因此,rom最近被视为潜在的候选疫苗对抗由apicomplexan寄生虫感染。例如,据报道,DNA疫苗接种与ROM1 ROM4, ROM5提供适当的保护效果弓形虫感染(38- - - - - -42)。在贝氏隐孢子虫,杨等人报道,DNA疫苗的免疫接种pEGFP-CbROM减少粪便卵囊(71.3%)鸡感染后的负担c . baileyi(43)。在艾美球虫属rom已经报道,提供部分同源感染防护形式的DNA疫苗、重组亚单位疫苗、重组BCG疫苗(22,39,43- - - - - -47)。这些研究与我们的研究结果一致。在目前的研究中,我们发现EmROM1引起部分保护e .最大值感染重组蛋白的形式或真核质粒。因此,我们的研究提供了一个有效的候选抗原,EmROM1,开发亚单位疫苗和DNA疫苗e .最大值。在某种程度上,它还表明EtROMs可能参与入侵过程的寄生虫,这需要进一步验证。

众所周知,细胞免疫反应起着至关重要的作用艾美球虫属感染(5)。在这项研究中,EmROM1免疫显著增加细胞因子转录水平和CD4的百分比⁺/ CD8⁺T细胞在接种组,这表明EmROM1接种诱导显著的细胞免疫反应。我们的结果与先前的报道是一致的(20.,22,43,47- - - - - -49)。李等人发现的细胞因子转录水平- 2和CD4 IFN-γ和百分比⁺/ CD8⁺T细胞在重组蛋白显著增加ETRHO1免疫组(20.)。刘等人的百分比显示,一些细胞因子,如- 2和IFN-γ,CD4细胞⁺/ CD8⁺淋巴细胞百分比显著增加DNA疫苗组免疫pVAX1.0-Rho向量(47)。Qi et al。(48)发现免疫EtMIC1可能增加的转录水平和IFN-γ挑战- 2鸟。体液免疫反应的作用对抗艾美球虫属感染是有争议的。早期的研究认为,抗体抵抗的能力艾美球虫属感染是由于观察到最小鸡bursectomized通过激素和化学手段抵抗艾美球虫属再感染(50)。相比之下,最近的研究表明,在保护性免疫抗体产生了显著影响艾美球虫属防止寄生虫入侵,因为他们的能力发展,传播和提供被动免疫系统抵抗感染和孕产妇(51)。在这项研究中,EmROM1小学和升压后显著增加特定的免疫球蛋白水平免疫接种鸡。这些结果可能会支持观点,抗体anticoccidial免疫反应中扮演重要角色。然而,它需要进一步的验证。

在这项研究中,肌内注射是用来评估的保护功效EmROM1由于其广泛的使用在接种疫苗。然而,农民不喜欢肌肉的路线,因为它是耗时且劳动密集型管理,它可以导致压力的动物,从而减少他们的表现。有些non-injection路线临床流行,如口服和喷雾。因此,non-injection路线可以用来评估EmROM1的保护效果,让它更有前途的临床应用(52,53)。从理论上讲,DNA疫苗免疫一次,生物体能够生产连续目标抗原(52)。然而,获得最好的疫苗免疫保护,两个单元和DNA疫苗免疫两次在这项研究。在临床中,一个单一免疫是欣然接受农民的成本和副作用免疫动物。因此,保护效果的一个免疫抗原可以评估在未来(54)。

5。结论

我们评估免疫反应和保护效力EmROM1诱导的形式的DNA和亚单位疫苗。我们发现EmROM1疫苗接种能引起显著的细胞和体液免疫反应,并提供部分保护e .最大值挑战感染。我们的研究结果表明,EmROM1是一种很有前途的候选抗原DNA疫苗的发展或亚单位疫苗禽球虫病。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

道德声明

综述了动物研究和实验动物福利与伦理委员会批准的南京农业大学。

作者的贡献

本研究x的构思和设计。DT进行实验。LX和ML分析数据。MW起草了手稿。XL和RY修改了手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号31972705和31972705),和重点实验室开放项目计划的预防和控制禽流感的家禽和其他主要的疾病,中国农业和农村事务部(没有。YDWS202207)。

确认

作者要感谢Jianhua刘,正为温榆Li Chuanxu Jing,宇陈样本收集和有价值的建议。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

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