胆固醇含量调节silica-induced溶酶体膜通透性
马修·j·Sydor
丽贝卡·l·肯德尔
Andrij Holian- 1环境健康科学中心的生物医学和制药科学、蒙大拿大学密苏拉,美国太
- 2生物分子结构和动力学中心蒙大拿大学密苏拉,太,美国
吸入石英已经有据可查的引起肺部炎症和矽肺等肺部疾病。能呼吸的二氧化硅粒子沉积在肺部和由肺泡巨噬细胞吞噬。随后,在溶酶体吞噬硅仍未经碰撞的溶酶体损害称为phagolysosomal膜透性(LMP)。LMP可以触发的会中NLRP3 inflammasome导致炎性细胞因子的释放,导致疾病。为了更好地理解机制的LMP本研究使用小鼠骨髓中巨噬细胞(BMdM)作为细胞模型研究silica-induced LMP的机制。减少在骨髓中巨噬细胞溶酶体的胆固醇18:1 phosphatidylglycerol (DOPG)脂质体治疗增加silica-induced LMP和il - 1β释放。相反,增加溶酶体和细胞胆固醇与U18666A降低il - 1β释放。Co-treatment骨髓中巨噬细胞和18:1 phosphatidylglycerol U18666A导致显著减少U18666A溶酶体的胆固醇的影响。磷脂酰胆碱100 -纳米脂质体模型系统被用来检查二氧化硅粒子对脂质膜的影响顺序。Di-4-ANEPPDHQ膜的时间分辨荧光各向异性探针,用于确定改变膜秩序。减毒的硅脂质增加订单包含胆固醇的磷脂酰胆碱脂质体。这些结果表明,增加胆固醇可以减弱silica-induced膜脂质体的变化和细胞模型,同时降低胆固醇加剧silica-induced膜的变化。溶酶体的胆固醇的选择性操作可能是一种衰减溶酶体的破坏和防止silica-induced慢性炎性疾病进展。
1介绍
吸入的结晶二氧化硅粒子被广为记载在肺纤维化疾病的发展,矽肺(戴维斯,1986;天玺et al ., 2017;霍伊和钱伯斯,2020年)。吸入,二氧化硅粒子在肺部沉积在不同地点,取决于它们的大小。一些规模较小的粒子(小于2µm大小)可以沉积在肺泡空间,在那里他们将由肺泡巨噬细胞吞噬导致炎症(汉密尔顿et al ., 2006;霍农et al ., 2008;Darquenne 2012)。吞噬石英报道激活NLRP3 inflammasome肺泡巨噬细胞(霍农et al ., 2008)。这激活NLRP3 inflammasome诱发caspase-1活动,炎性细胞因子pro-IL-1劈开β和pro-IL-18分泌活跃的形式(Dinarello 1998;霍农et al ., 2008)。
目前的研究提供更多细节的步骤导致silica-induced NLRP3 inflammasome激活。Phagolysosomal膜透性(LMP)和降解溶酶体组织蛋白酶等酶的释放机制提出粒子可以触发NLRP3 inflammasome大会Jessop et al ., 2017;贾et al ., 2019)。当二氧化硅粒子存在于吞噬溶酶体,它们不是退化,导致溶酶体的不稳定。细节的二氧化硅引起LMP尚不清楚。然而,有报道表明二氧化硅可以优先与磷脂组件交互的生物膜,导致膜的脂类订单增加渗透率变化(Kettiger et al ., 2016;王et al ., 2019;Sydor et al ., 2021;孔雀舞et al ., 2022)。关键表面组织称为几乎免费硅醇(NFS)一直在描述和存在的断裂表面结晶二氧化硅和其他类型的石英材料(Brinker et al ., 2020;孔雀舞et al ., 2020)。NFS的存在对粒子增加膜破坏和毒性颗粒相比较少或没有NFS (孔雀舞et al ., 2020;孔雀舞et al ., 2022)。
因为吸入石英仍然是许多人的职业危害,更好的理解机制silica-induced LMP应该帮助发展的潜在疗法silica-induced炎症。LMP是一个关键的步骤,这个炎症通路,调制的溶酶体脂质成分可能有助于更好的理解,最终预防慢性疾病。增加溶酶体与复合U18666A牵连降低胆固醇水平的LMP (Appelqvist et al ., 2011;reiner et al ., 2011;Appelqvist et al ., 2012)。相反,细胞可以治疗溶酶体减少胆固醇增加胆固醇贩运。治疗的细胞组成的脂质体phosphatidylglycerol (PG)、LBPA的前兆,已经证明增加LBPA水平细胞(McCauliff et al ., 2019)。治疗LBPA和PG已证明,它能减少细胞内胆固醇积累在Nieman-pick疾病模型(McCauliff et al ., 2019;Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)作为LBPA报道与NPC2蛋白质和增加其胆固醇贩卖函数(McCauliff et al ., 2019)。
当前工作检查如何调节溶酶体胆固醇含量影响结晶和LMP silica-induced膜的破坏。虽然以前的研究已经表明了监管的LMP胆固醇,我们已经检查了这个效应与相关粒子治疗。我们假设缺乏或减少膜会导致胆固醇的增加和LMP silica-induced膜的破坏。在这些研究中骨髓巨噬细胞(BMdM)作为派生而来在体外巨噬细胞模型来研究如何操纵溶酶体胆固醇LMP的影响,细胞毒性,il - 1β释放。BMdM服用18:1 phosphatidylglycerol组成的脂质体(DOPG)硅接触之前调查如何减少溶酶体胆固醇LMP的影响。最后,脂质体与100 nm直径被用作模型膜研究silica-induced改变膜秩序和胆固醇的存在如何影响这些变化。
2材料和方法
2.1材料和试剂
磷脂1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho - (1′-rac-glycerol)(18:1Δ9-cis) (DOPG)(项目编号840475)和1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 18:1(Δ9-cis) (DOPC)(项目编号850375)购买的氯仿两代情极性脂质,inc .(雪花石膏,半岛)。胆固醇粉(项目编号700000)也买了两代情极性脂质,inc .(雪花石膏,半岛)。荧光探针用于各向异性测量Di-4-ANEPPDHQ,这是购自ThermoFisher(沃尔瑟姆,MA)。U18666a(项目编号10009085)从开曼群岛获得化学(安阿伯市MI)。n -乙酰-荧光底物β-glucosaminidase 4-Methylumbelliferyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-Glucopyranoside(项目编号26953),并从开曼群岛购买化学(安阿伯市MI)。菲律宾菌素复杂(项目编号F9765),洋地黄皂苷(项目编号300410),和Pefabloc SC(项目编号11429868001)从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)。染色溶酶体,LysoView 633(项目编号70058)从Biotium购买,Inc . (Fremont, CA)。Cellview细胞培养皿中(项目编号627871)来自他一一Bio-One北美,Inc .(梦露,NC)。细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)测定CytoTox 96非放射性细胞毒性试验(项目编号麦迪逊G1780) Promega (WI)。石英(Min-u-sil-5)从宾夕法尼亚州玻璃砂获得公司(宾夕法尼亚州匹兹堡)。Min-u-sil-5圆平均直径相当于1.3µm和进一步在我们以前的工作特征(孔雀舞et al ., 2022)。
2.2的老鼠
C57BL / 6 j小鼠(杰克逊实验室)被安置在蒙大拿大学的specific-pathogen-free实验动物资源设施与环境条件控制和12 h光/暗周期。小鼠安乐死的过量戊巴比妥钠(Euthasol™)之前收集骨髓的腿。本研究中使用的动物程序批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)蒙大拿大学的。
2.3隔离和骨髓中巨噬细胞的文化
C57Bl / 6小鼠牺牲,骨髓隔离的后腿了。冲洗骨髓细胞收集的胫骨和股骨骨与完整的媒体(RPMI, 10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,1%丙酮酸钠,0.1%β-mercaptoethanol) 1/2“长27-gauge针。一夜之间,细胞被孵化(37°C;3.0×107细胞/ T75瓶)消除基质细胞粘附血压得到较好的控制。第二天,non-adherent细胞转移到新的T75烧瓶(1.5×10血压得到较好的控制7播种密度)与巨噬细胞集落刺激生长因子(csf) (20 ng / mL,研发系统)。细胞保持额外的csf (10 ng / mL)每3 - 4天。BMdM被胰蛋白酶和温柔刮和用于收集所有描述实验后9天。
2.4细胞毒性和细胞因子分析
BMdM的被试20 ng / mL脂多糖(σ)NLRP3 inflammasome激活和处理100 nm DOPG脂质体(50μM) 1 h在硅(50μg /毫升)应用程序。BMdM孵化(37°C;5%的公司2)在96年24小时板(100000个细胞/)RPMI 1640年完成媒体(10%胎牛血清,1%青霉素、链霉素)。细胞死亡在上层清液测定Promega CytoTox 96非放射性LDH测定。IL-1β释放在上层的量化研发系统IL-1β酶联免疫试剂盒。
2.5溶酶体膜透化作用分析
溶酶体膜透性的测定是改编自以前描述的方法(河中的小岛et al ., 2015;Jessop et al ., 2017)。BMdM镀在1×10的数量5每口井的细胞和治疗50μg /毫升硅和/或50µM DOPG脂质体。24小时后,上层清液被用于一个LDH测定。细胞被洗过两次的在100年之前PBSµL胞质提取缓冲了。胞液的成分提取缓冲是250毫米的蔗糖,20毫米玫瑰,MgCl氯化钾10毫米,1.5毫米2EGTA 1毫米EDTA 1毫米,0.5毫米pefabloc SC, 15μg /毫升洋地黄皂苷。提前进行洋地黄皂苷滴定法选择最佳工作浓度(15μg /毫升)的洋地黄皂苷需要完全permeabilize质膜,但对溶酶体的影响很小。板被放置在冰与摇摆15分钟。15分钟后,提取的从细胞和细胞溶质被放置在一个新的96板在冰上。n -乙酰-的活性β-glucosaminidase(唠叨)测量通过添加30µL提取细胞溶质100µL唠叨反应缓冲区(0.2 M柠檬酸钠pH值4.5,300μg /毫升4-Methylumbelliferyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-Glucopyranoside)。劈理的荧光唠叨衬底(4-Methylumbelliferyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-Glucopyranoside)测量时间间隔为20分钟45秒30°C分子设备(CA)圣何塞SpectraMax M4微型板块读者。在356 nm裂解底物很兴奋,和荧光排放检测在444 nm。测量活动规范化除以唠叨唠叨活动工作浓度的洋地黄皂苷(15μg /毫升)的活动从200年洋地黄皂苷的总溶解浓度μg /毫升。这样做是为每个条件。
2.6胆固醇流出
BMdM被添加到96孔板(100000个细胞)与TopFluor采用无血清胆固醇(5μg /毫升)媒体24小时(37°C),洗净,和孵化U18666A 24 h或DOPG 1 h完成媒体(RPMI 1640年,10%的边后卫),以类似的方式,之前描述(刘et al ., 2014)。上层清液分别转移到井96年黑色板和TopFluor由分子荧光测量设备(CA)圣何塞SpectraMax M4微型板块读者。射流BMdM治疗与控制流出。TopFluor很兴奋在488 nm,发现在525 nm。
2.7荧光成像技术
收集所有荧光图像蔡司880 LSM(卡尔蔡司显微镜,LLC,白色的德普,纽约)。目的用于收集的图片是1.4×63计划Apo NA油浸的目标。共焦孔1 AU是用于所有图像采集。胆固醇和溶酶体的成像过程类似于(Kummer领军et al ., 2022)使用。BMdM被播种前1.5×10天5细胞每在4他一一Cellview细胞培养皿。第二天,BMdM沾LysoView 633 1 h在完成媒体的浓度1 x /制造商的指示。细胞被洗两次与PBS之前被固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟。再一次,这些细胞被洗两次与PBS的菲律宾菌素染色在媒体完整解决方案。菲律宾菌素染色溶液是由稀释2.5毫克/毫升的菲律宾菌素在DMSO 1:2 2% BSA / PBS。BMdM然后在37°C在黑暗中孵化2小时。染色的解决方案被删除,取而代之的是酚红完成媒体自由。菲律宾菌素与405 nm激光很兴奋,和LysoView 633与633 nm激光很兴奋。激光功率和探测器获得选手举行在所有条件。至少6每个条件图像,每个实验。 Experiments were conducted over three separate days. The laser power and detector gain were held constant across all conditions. Fluorescence overlays were generated with Zeiss Zen 2.3 software.
2.8脂质体制备和时间分辨荧光各向异性
脂质都溶解在氯仿和允许下干燥的氮气流大约1 h。干油脂水化与杜尔贝科的PBS或三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS)(三)150毫米氯化钠,50 mM。脂质被用在水浴10分钟前通过一个两代情微型挤出机挤压与100 nm孔隙大小设置过滤器。在PBS DOPG脂质体用于治疗细胞,而DOPC脂质体在TBS孵化与二氧化硅粒子在37°C与下跌2 h。脂质在100 nm DOPC脂质体进行时间分辨荧光各向异性测量的亲脂性的调查,Di-4-ANEPPDHQ。荧光探针,Di-4-ANEPPDHQ就得以证实敏感探头周围的脂质环境的变化(欧文et al ., 2011;斯蒂尔et al ., 2019;Sydor et al ., 2020;Sydor et al ., 2021;孔雀舞et al ., 2022)。Di-4-ANEPPDHQ是溶解在光谱级二甲亚砜(DMSO)和使用400 nM的工作浓度与最后的DMSO浓度< 1%。Di-4-ANEPPDHQ添加15分钟前允许数据收集和孵化与脂质体样品在室温下,如前所述(斯蒂尔et al ., 2019)。内部建立荧光计与量子部分西北(自由湖,佤邦)被用来获取时间分辨各向异性测量之前报道(Minazzo et al ., 2009)。一个PicoQuant 470 nm脉冲二极管激光器(ldh - p - c - 470)被用来激发Di-4-ANEPPDHQ。荧光收集排放Chorma 500 nm longpass过滤器和爱丁堡仪器光电倍增管(H10720-01)。所有的数据收集从一个样品室在20°C±0.02°C。各向异性衰变曲线是适合使用PicoQuant FluoFit软件(V4.6.6)。运动Di-4-ANEPPDHQ的脂质膜的范围提出了wobble-in-a-cone-angle。这是计算从方程# 1,以前用来描述脂质膜订单(斯蒂尔et al ., 2019;Sydor et al ., 2020;孔雀舞et al ., 2022)。
2.9统计分析
被定义为统计意义p< 0.05。unpaired-student t是用来比较的统计差异两个意思。比较多的两个意思,一个或双向方差分析。Dunnett测试后被用来比较多种方式控制。所有组之间比较,图基HSD或Sidak-Holmes测试后使用。至少三个实验复制为每个数据集进行。所有统计测试和图形生成与棱镜9.0 GraphPad软件(CA)圣地亚哥。
3的结果
3.1 Silica-induced IL-1β释放BMdM被DOPG治疗减少了U18666A和增强
它曾被证明石英促进BMdM IL-1β释放增加,细胞死亡(霍农et al ., 2008)。因为NLRP3 inflammasome激活需要一个启动和激活信号,BMdM有限合伙人的被试(20 ng / mL)立即前孵化与硅(50μg /毫升)24 h。硅显著增加引起细胞死亡的LDH释放(图1一个未经处理的BMdM相比)。细胞毒性的增加伴随着显著增加IL-1β释放后硅接触(图1 b)。
图1。DOPG增加硅细胞毒性和IL-1β释放在BMdM U18666A产生相反的效果。LPS-primed BMdM治疗有无U18666A(10μg /毫升)或DOPG(50μM)前1 h二氧化硅(50μg /毫升)应用程序在完成媒体。24小时后,(一)细胞死亡是评估在上层清液和LDH释放(B)IL-1β释放被ELISA测定。数据表示为的意思是±扫描电镜,n= 4与图基的多重比较分析了双向方差分析测试。*p< 0.05,* *p< 0.01,* * * *p <0.0001控制相比,未经处理的细胞。+ +p< 0.01和+ + +p< 0.001相比silica-exposed细胞。
胆固醇的保护效应证实了溶酶体膜的U18666A(10μg /毫升)BMdM 1 h硅前24 h。U18666A与NPC1胆固醇转运体通过绑定sterol-sensing域和导致溶酶体增加胆固醇(Liscum《浮士德》,1989年;陆et al ., 2015;钟et al ., 2018)。U18666A显著降低silica-induced细胞死亡(图1一个)和IL-1β版本相比,硅处理控制BMdM (图1 b)。
U18666A相比,据报道,DOPG增加胆固醇贩卖的溶酶体,从而减少溶酶体胆固醇(Ilnytska et al ., 2021 b)。这里100 nm DOPG组成的脂质体(50μM)在24小时前向BMdM申请1 h硅治疗。虽然DOPG本身没有影响细胞死亡控制BMdM相比,DOPG显著增加细胞死亡而silica-only BMdM治疗(图1一个)。此外,DOPG治疗显著增加IL-1β释放相比silica-only BMdM (图1 b)。这些结果说明U18666A治疗减少silica-induced细胞死亡和IL-1β释放而DOPG治疗增加silica-induced BMdM细胞死亡和IL-1β释放。
3.2 DOPG从BMdM增加胆固醇流出
DOPG及其导数,lysobisphosphatidic酸(LBPA)据报道,增加胆固醇贩卖从溶酶体(McCauliff et al ., 2019;Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)。溶酶体从巨噬细胞胆固醇贩卖模式影响细胞胆固醇流出,因此U18666A和DOPG胆固醇流出的影响是证实。BMdM都含有荧光标记TopFluor胆固醇为24小时无血清条件。洗后,细胞治疗U18666A(10μg /毫升)24小时或DOPG(50μM) 1 h RPMI 1640年完成媒体的边后卫(10%)。荧光强度测量在24小时后上层清液,而未经处理的BMdM评估胆固醇流出。DOPG治疗显著增加胆固醇流出比未经处理的控制BMdM (图2)。相比之下,U18666A BMdM证明治疗显著降低胆固醇流出(图2)。这些结果说明DOPG促进胆固醇流出从BMdM U18666A防止胆固醇流出。
图2。从BMdM DOPG增加胆固醇流出U18666A减少流出。BMdM被装满TopFluor血清中胆固醇(5μg /毫升)自由RPMI 1640媒体。24小时后,细胞被清洗和处理U18666A(10μg /毫升)24 h或DOPG 1 h在完整的媒体。TopFluor荧光强度测量数据表示为24小时后上层清液。的意思是±扫描电镜,n= 4。分析了单向方差分析与Dunnett多个比较测试。* *p< 0.01和* * *p <0.001未经处理的控制细胞相比。
3.3 DOPG BMdM U18666A-induced溶酶体积累胆固醇的降低
证明DOPG-induced胆固醇流出的增加与减少溶酶体在DOPG胆固醇治疗,免费BMdM内胆固醇被菲律宾菌素染色法测量。菲律宾菌素是一种结合荧光抗生素unesterified(免费的)胆固醇在固定细胞(Maxfield Wustner, 2012)。以前,已经证明U18666A治疗使filipin-stained自由胆固醇的积累在溶酶体(reiner et al ., 2011;迈耶et al ., 2021)。这里,BMdM孵化了U18666A展示免费胆固醇积累或DOPG + U18666A 24小时免费评估DOPG能否扭转胆固醇积累U18666A引起的。治疗前BMdM沾Lysoview 633固定和菲律宾菌素染色。U18666A引起显著的增加不同的puncta Lysoview 633和菲律宾菌素染色相比,控制BMdM表明胆固醇的积累在溶酶体(图3一)。DOPG + U18666A-treated BMdM显示一个类似colocalization Lysoview 633和菲律宾菌素的胆固醇是隐藏在溶酶体(图3一)。量化的菲律宾菌素彩色puncta ImageJ表明U18666A显著增加菲律宾菌素puncta比未经处理的BMdM (图3 b)。DOPG + U18666A治疗细胞也有显著提高菲律宾菌素puncta比未经处理的BMdM;然而,他们相比,数量显著降低U18666A只治疗细胞(图3 b)。DOPG独自没有论证彩色puncta菲律宾菌素的变化,可能由于相当低可观测puncta控制细胞的数量(数据没有显示)。曼德重叠系数的分析(使用ImageJ JACoP)有显著提高的Lysoview 633染色重叠与菲律宾菌素染色(图3 c)在U18666A治疗,然后由DOPG治疗显著降低。
图3。DOPG减少U18666A菲律宾菌素puncta。BMdM服用U18666A或DOPG + U18666A 24 h。细胞染色前Lysoview固定和菲律宾菌素染色。(一)代表Lysoview和菲律宾菌素的图像彩色BMdM。(B)菲律宾菌素puncta每个细胞由ImageJ量化分析。(C)曼德colocalization分析菲律宾菌素与Lysoview染色法染色。数据表示为的意思是±扫描电镜,n= 3独立实验。分析了单向方差分析与图基的多个比较测试。* *p< 0.01和* * * *p <0.0001控制相比,未经处理的细胞。+ + + +p< 0.0001相比U18666A细胞治疗。
3.4 DOPG溶酶体的胆固醇下降,而不是在BMdM质膜胆固醇
DOPG提出减少溶酶体胆固醇通过促进胆固醇增加贩卖NPC2蛋白(McCauliff et al ., 2019;Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)。为了评估,溶酶体的胆固醇降低,使用洋地黄皂苷治疗。洋地黄皂苷是一个专门与细胞膜permeabilizer膜胆固醇(Nishikawa et al ., 1984)。因此,由于膜胆固醇的变化会影响permeabilize膜洋地黄皂苷的功效,我们评估DOPG洋地黄皂苷治疗的影响比未经处理的BMdM滴定曲线。增加细胞膜中胆固醇含量符合增加易感性digitonin-induced裂解(Sudji et al ., 2015)。溶酶体酶的检测提取细胞溶质可以用来评估溶酶体膜完整性(河中的小岛et al ., 2015;Jessop et al ., 2017)。
应用洋地黄皂苷(0 - 200μg /毫升)15分钟在冰上,然后为胞质酶胞质提取测定乳酸脱氢酶(LDH)和溶酶体酶n -乙酰-β-glucosaminidase(唠叨)。洋地黄皂苷的最高剂量(200μg /毫升)被选中,因为它是远高于其余的范围,将permeabilize质膜和溶酶体膜在所有条件。DOPG治疗并没有改变LDH测量相比,治疗BMdM除了洋地黄皂苷μg 10点/毫升(图4一)。相比之下,NAG值显著下降而控制BMdM多个洋地黄皂苷浓度(15 35μg /毫升)(图4 b)。
图4。DOPG降低溶酶体对洋地黄皂苷提取。BMdM滴定与洋地黄皂苷(0 - 200μg /毫升)15分钟在冰上。(一)LDH光学密度和(B)唠叨相对荧光测定胞质提取物。数据表示为的意思是±扫描电镜,n= 3。分析了双t以及,*p< 0.05和* *p< 0.01,未经处理的,DOPG BMdM之间各自的洋地黄皂苷浓度。
缺乏论证的区别BMdM LDH值有无DOPG治疗(图4一)表明,洋地黄皂苷提取是提取细胞溶质之间的可比程度两组由于其相似的质膜胆固醇水平。治疗之间的唠叨测量荧光强度显著下降,DOPG BMdM指向一个显著差异在两组之间的溶酶体胆固醇含量,降低溶酶体的胆固醇的治疗DOPG BMdM将使其洋地黄皂苷提取的影响较小。因此,这些结果说明DOPG治疗没有显著影响质膜胆固醇,但显著降低了溶酶体的胆固醇含量。
提高了3.5 Silica-induced LMP在BMdM DOPG治疗
表示的变化对洋地黄皂苷滴定法在治疗DOPG支持假设DOPG溶酶体降低胆固醇与先前的报道一致(Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)。溶酶体增加胆固醇已经证明是保护LMP因各种原因(Appelqvist et al ., 2011;reiner et al ., 2011;Biswas et al ., 2014;Fucho et al ., 2014)。在这个工作中,DOPG治疗BMdM促进胆固醇流出,进而增加silica-induced细胞死亡和IL-1β释放。因此,我们评估的影响降低了溶酶体与DOPG治疗胆固醇LMP硅接触。BMdM预处理和没有DOPG 1 h硅申请前24 h。胞质NAG活性评估以类似的方式使用洋地黄皂苷如上所述。洋地黄皂苷剂量被前面的滴定法确定优化工作浓度(15μg /毫升),有选择地permeabilized在不破坏细胞内的膜质膜,与200年相比,一个完整的细胞溶解μg /毫升为每个条件。被表示为唠叨唠叨活动15/唠叨200年。这样做是为了占细胞死亡引起的硅,这可能导致唠叨水平较低的提取硅BMdM治疗。硅接触显著增加LMP比未经处理的BMdM (图5)。DOPG独自NAG活性没有影响;然而,DOPG预处理前硅接触导致显著增加唠叨活动相比silica-only BMdM (图5)。这些结果说明DOPG显著增加silica-caused LMP。
图5。DOPG增加silica-induced LMP。BMdM对待,没有DOPG 1 h硅申请前24 h。BMdM洋地黄皂苷提取的(15μg /毫升)和胞质唠叨活动测量荧光底物唠叨。NAG值15μg /毫升洋地黄皂苷提取归一化到200年完成裂解μg /毫升洋地黄皂苷显示胞质唠叨的活动。数据表示为的意思是±扫描电镜,n= 3。分析了双向方差分析与图基的多个比较测试。* *p< 0.01和* * * *p <0.0001控制相比,未经处理的细胞。+ + + +p< 0.0001相比silica-exposed细胞。
3.6 Silica-induced在脂质体膜的破坏
之前我们已经表明,石英可以相互作用,干扰脂质膜,导致膜脂质秩序的变化。这可能是通过优惠与磷脂酰胆碱(DOPC)磷脂headgroups (孔雀舞et al ., 2020;Sydor et al ., 2021;孔雀舞et al ., 2022)。因为这个我们目前的工作使用100 nm DOPC组成的脂质体有或没有胆固醇的孵化与石英为目的的检测silica-induced改变膜秩序。时间分辨荧光各向异性是用来测量荧光膜探针Di-4-ANEPPDHQ的运动。Di-4-A-NEPPDHQ wobble-in-a-cone角是减少当脂质膜的订单增加,防止膜内的探测器的运动。硅(200μg /毫升)治疗引起的显著减少锥角控制DOPC脂质体(相比图6)。为了评估的影响胆固醇降低硅诱导膜破坏,DOPC脂质体准备4:1 DOPC胆固醇摩尔比。增加胆固醇脂质体预防减少锥角与200μg /毫升硅(图6 b)。增加400μg /毫升硅DOPC 4:1胆固醇脂质体也未能显著减少Di-4-ANEPPDHQ的锥角(图6 b)。
图6。时间分辨Di-4ANEPPDHQ在脂质体的各向异性。(一)纯DOPC脂质体治疗硅(200μg /毫升)2 h。(B)DOPC脂质体与胆固醇比例4:1 M孵化与硅(200μg /毫升和400μg /毫升)2 h后各向异性测量。数据表示为均值±扫描电镜,n= 3独立实验。(一)分析了单向方差分析Dunnett的事后测试。(B)分析了双尾未配对t以及。*p <0.05。
这些结果表明,二氧化硅引起膜脂质增加订单的减少Di-4-ANEPPDHQ锥角(图6),由增加胆固醇预防DOPC脂质体(图6 b)。
4讨论
本研究调查了机制silica-induced LMP和溶酶体在调解LMP胆固醇含量的作用。溶酶体胆固醇含量与胆固醇运输抑制剂U18666A增加。为了促进溶酶体的减少胆固醇,BMdM DOPG脂质体治疗。Phosphatidylglycerol溶酶体是一种前体脂质LBPA,已报道促进胆固醇贩卖NPC1缺乏细胞溶酶体的模型和直接与NPC2 (McCauliff et al ., 2019;Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)。在当前的工作中,所使用的电池是野生型BMdM C57BL / 6 j小鼠,没有缺陷在NPC1 NPC2蛋白质。这项研究的结果表明,BMdM DOPG治疗溶酶体胆固醇含量减少。
巨噬细胞,当暴露于石英,已经证明了这一点在体外和在活的有机体内吞噬硅导致细胞死亡,LMP和IL-1β释放(Gilberti et al ., 2008;Biswas et al ., 2017;Jessop et al ., 2017;雷et al ., 2020)。在当前的工作中,预处理的BMdM U18666A silica-induced减少细胞死亡以及IL-1β释放。这提议是由于phagolysosomal胆固醇含量的增加,衰减silica-induced LMP。相反,预处理的BMdM DOPG脂质体产生了相反的效果,与细胞死亡和IL-1β分泌明显多于U18666A细胞没有硅接触前预处理。胆固醇在调节结果的关键作用是评估通过应用U18666A或DOPG non-silica暴露对胆固醇流出细胞显示不同的影响。U18666A降低胆固醇流出,这是归因于缺乏胆固醇运输从溶酶体由于抑制NPC1活动(陆et al ., 2015)。治疗DOPG上层清液胆固醇增加,这可能是由于胆固醇增加贩卖从溶酶体(Ilnytska et al ., 2021 a;Ilnytska et al ., 2021 b)。
描述DOPG在溶酶体的影响,我们首先测量了DOPG治疗的敏感性BMdM洋地黄皂苷透化作用。permeabilize膜作为洋地黄皂苷的机制是基于膜胆固醇含量,这种分析是适合检查DOPG如何影响胆固醇含量在质膜和溶酶体膜(Nishikawa et al ., 1984;Sudji et al ., 2015)。我们发现DOPG治疗没有影响质膜胆固醇类似洋地黄皂苷的LDH值为代表的滴定法之间的控制和DOPG BMdM治疗。然而,唠叨的水平在洋地黄皂苷提取的细胞低与DOPG治疗,表明溶酶体的减少胆固醇。作为提出了溶酶体的胆固醇下降导致增加silica-induced LMP,同样被用来量化LMP洋地黄皂苷提取技术。唠叨的比较值的工作浓度洋地黄皂苷(15μg /毫升),只有permeabilized NAG值的质膜与完整的细胞膜溶解到200年μg /毫升洋地黄皂苷。分数cytosolically活跃的唠叨唠叨15/唠叨200年)表明,硅在LMP引起显著增加,进一步加剧了DOPG治疗(图5)。我们的结果与溶酶体的胆固醇下降了DOPG上下文中有意义的先前的研究显示U18666A-induced溶酶体胆固醇积累导致降低易感性LMP引起的各种代理(Appelqvist et al ., 2011;reiner et al ., 2011;Appelqvist et al ., 2012)。虽然这些研究中使用的不同的溶酶体增敏剂,共性是,溶酶体的胆固醇积累似乎增加稳定溶酶体膜,防止LMP。
为了进一步研究U18666A和DOPG溶酶体的影响,使用了菲律宾菌素染色。共焦显微镜成像后的细胞,增加菲律宾菌素染色观察puncta U18666A治疗。这可能是由于缺乏溶酶体胆固醇贩卖,导致增加溶酶体的菲律宾菌素染色。量化时,每个细胞的puncta数量与U18666A应用显著增加。BMdM也co-treated U18666A和DOPG脂质体,产生显著增加puncta每个细胞相比,但摘要细胞显著减少puncta U18666A相比只有细胞治疗。菲律宾菌素染色结果表明DOPG可以减少溶酶体胆固醇尽管NPC1被U18666A抑制。治疗只有DOPG本身没有产生菲律宾菌素的变化强度和puncta相比,控制细胞(数据未显示)控制水平的菲律宾菌素强度和puncta每个细胞已经很低。
硅被描述与脂质膜,破坏它们,以脂质顺序变化(Sydor et al ., 2021;孔雀舞et al ., 2022)。具体来说,我们建议近自由表面的硅醇组石英可以与磷脂酰胆碱headgroup脂质膜,导致脂质变化的秩序(孔雀舞et al ., 2022)。脂质体膜被用作模型检查膜胆固醇含量如何影响silica-induced膜破坏。Di-4-ANEPPDHQ wobble-in-a-cone角作为衡量时间分辨荧光各向异性被用作衡量脂质体膜中的脂类订单。脂质体与DOPC和胆固醇的混合物产生4:1 M比率没有显著变化与硅脂质订单后孵化。然而,DOPC胆固醇脂质体没有显示显著减少Di-4-ANEPPDHQ的锥角。这表明一个交互与硅增加脂质膜的秩序和胆固醇的能力减弱silica-induced膜破坏。这种粒子之间的相互作用和磷脂头部集团被认为限制脂肪运动,也有相似地方凝胶被描述为其他particle-membrane交互(刘先生和刘,2020年)。虽然看似大剂量使用硅膜的研究在当前模型,重要的是要考虑脂质体和细胞之间的差异。脂质体与粒子以被动的方式,而巨噬细胞吞噬物质活性机制,集中在溶酶体。因此,所需的材料在每个系统将实现和效果不同。Di-4-ANEPPDHQ之间的任何关联和二氧化硅预计不会造成重大变更wobble-in-a-cone角。荧光各向异性的变化似乎更取决于磷脂headgroups膜,在夹住Di-4-ANEPPDHQ脂质体膜不受硅治疗中描述的一项研究(孔雀舞et al ., 2022)。这项研究只关注一种硅(⍺石英min-u-sil 5),其他类型的硅可以共享类似的表面性质如NFS。也许这些表面组织的存在决定了不同的硅材料的生物活性。未来的工作将需要使用其他类型的材料除了⍺石英评估的能力引起溶酶体胆固醇调节LMP其他类型的粒子。
溶酶体是至关重要的监管机构调节炎症细胞内稳态和发挥作用的细胞因子释放。溶酶体功能障碍导致许多炎性疾病包括老年痴呆症、帕金森症,尼曼皮克病和矽肺(万斯和哈维·j·卡特说道,2014;黄et al ., 2019;是不是et al ., 2021)。在矽肺,溶酶体功能障碍发生在硅颗粒与特定磷脂headgroups和溶酶体膜变化秩序与脂质体模型演示。破坏二氧化硅粒子通过增加胆固醇对溶酶体膜的影响提供了一个治疗的好处在二氧化硅粒子诱发炎症DOPG否定的治疗。这次考试的溶酶体胆固醇提供了洞察的机制,导致粒子诱导炎症和表明,机械的溶酶体功能疾病的理解可以提供治疗的目标。增加有针对性的溶酶体中胆固醇疾病提升了LMP可能有益而溶酶体的胆固醇下降可能是有害的。
5个方程
wobble-in-a-cone角(θDi-4-ANEPPDHQ)是由以下方程计算。脂质膜的有序参数值所代表的是美国的初始各向异性Di-4-ANEPPDHQ表示r0,而限制定义的脂质膜的各向异性r∞。wobble-in-a-cone角可以通过使用生成初始和限制各向异性值和描述(小Kinosita Ikegami, 1982)。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究是蒙大拿大学机构进行审核和批准的动物保健和使用委员会。
作者的贡献
女士和RK设计概念,并进行了实验。啊帮助在设计和概念化的实验中,随着数据的解释。女士和RK写手稿编辑啊。
资金
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助:P30GM140963, R01ES033533 S10OD021806, F31ES033562。也是由国家科学基金会资助切- 1531520。
确认
我们要感谢中心的生物分子结构和动力学以及Biospectroscopy核心研究实验室帮助蒙大拿大学的时间分辨荧光测量和成像,和吸入肺生理核心(环境健康科学中心)蒙大拿大学的援助与骨髓托收。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:二氧化硅、巨噬细胞溶酶体、炎症、膜
引用:Sydor MJ,肯德尔RL和Holian(2023)胆固醇含量调节silica-induced溶酶体膜通透性。前面。Toxicol。5:1112822。doi: 10.3389 / ftox.2023.1112822
收到:2022年11月30日;接受:2023年1月30日;
发表:2023年2月13日。
编辑:
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