原始研究的文章

前面。Toxicol。,20 September 2022
秒。监管毒理学
卷4 - 2022 | https://doi.org/10.3389/ftox.2022.936014

使用在体外来指导发展的生物安全的生物聚合物用于食品包装

艾玛·哈珀 ¹,

Eoin坎宁安 ²和

丽莎·康诺利 ¹*

¹全球食品安全研究所,生物科学学院的贝尔法斯特女王大学,英国贝尔法斯特
²学校的机械和航空航天工程,贝尔法斯特女王大学,英国贝尔法斯特

石油聚合物通常用于塑料包装生产已被证明浸出危险化学品,如双酚a (BPA)。生物聚合物可能更安全的选择,许多可以可持续来自食品工业废水。本研究评估生物聚合物进行食品包装发展的内分泌扰乱渗滤液迁移水平的雌激素,雄激素和progestagen核受体转录活动。报告基因分析是伴随着迁移测试,使用标准化的测试条件进行存储和温度。测试样品包括9个生物聚合物和四个无机废物添加剂与传统的以石油为原料的聚合物混合,聚丙烯。热塑性淀粉材料,聚丁烯琥珀酸、聚已酸内酯、聚丁烯己二酸对苯二甲酸乙二醇酯(PBAT),两个聚乳酸(PLA) / PBAT混合,polyhydroxybutyrate (PHB)和蛋壳/聚丙烯(10:90)呈现不显著减少代谢活动在任何测试条件或激素的活动。聚丙烯(PP)没有激素的活动。代谢活动减少的雌激素敏感细胞株10天后迁移测试蛋壳/聚丙烯(0.1:99.9)在40°C,甲醇在甲醇和PP和dH₂0。雌激素受体激动剂活性观察10天后在家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)在甲醇20°C和40°C,家禽羽毛聚合物在甲醇和dH为基础₂在40°C O,蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和dH的解放军₂O在40°C。活动是在0.26 - -0.50范围内ng 17β雌二醇等价物/毫升,相当于一种雌激素的力量3 -∼2800倍小于雌激素的渗滤液BPA。家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)甲醇了10天了雌激素活动20°C和40°C以上范围内,人类在40°C。Progestagenic活动没有被观察到在任何测试条件的任何化合物。有趣的是,低浓度的蛋壳或页可能消除蛋壳求偶性和PP毒性。另外蛋壳可能绑定和消除有毒元素页。同样,解放军雌激素的活动都被解放军/ PBAT混合。此研究表明,生物测定指导的好处更安全、可持续发展的包装以石油为原料的塑料的替代品。操纵添加剂的类型和他们的配方与毒理学测试可能进一步提高安全方面。

介绍

塑料包装用于生产、加工、运输、处理和存储的食品和饮料,并高度重视,因为它可以保护食品和饮料从物理损坏,腐蚀和微生物腐败(Muncke et al ., 2017)。丰富和高电阻退化的塑料垃圾在陆地上和海上已成为全球关注的环境污染问题与塑料碎片(Muncke 2011)。此外,塑料贡献者对增加全球变暖的影响和石油等不可再生的化石资源的损耗(只是et al ., 2017)。以石油为原料的塑料是已知的有害化学物质的来源、增塑剂等化学物质双酚a (BPA)和邻苯二甲酸酯经常引用的潜在危险和流行病学响应(齐默尔曼et al ., 2019)。BPA和邻苯二甲酸以石油为原料的塑料包装可以迁移到食品、土壤、水和海洋,因此被动物或人类摄入可能造成不良的健康影响(杨et al ., 2011;Moreira et al ., 2015;Muncke et al ., 2017;Guillard et al ., 2018)。

一些以石油为原料的塑料渗滤液也被发现在人类引起内分泌功能紊乱,干扰的生产、释放、运输、代谢,绑定或消除体内天然激素,因此,公认为是内分泌干扰化学物质(edc) (杨et al ., 2011;Moreira et al ., 2015)。edc的定义世卫组织/ ipc (2002)为“一种外源物质或混合物,改变函数(s)的内分泌系统,从而导致不良健康effectsin一个完整的有机体,或其后代,或(子)的数量。“人类暴露于BPA和邻苯二甲酸酯等合成激素模仿化学品与发育有关,生殖和代谢干扰包括不孕或生育能力下降,影响学习和记忆困难,糖尿病、肥胖和心血管疾病(Casals-Casas Desvergne, 2011;Schug et al ., 2011;世卫组织/环境规划署,2013)。edc可以影响我们的性荷尔蒙导致破坏生殖发展,性别分化、胚胎早期发育和青春期(Casals-Casas Desvergne, 2011)。雌激素受体(ERs)是edc的主要目标之一,因此影响正常的雌激素信号通路(Shanle徐,2011)。

生物塑料的生产和使用可能是一个潜在的安全替代品以石油为原料的塑料,同时还有助于减少塑料的依赖不可再生的化石燃料,减少温室气体排放,从塑料垃圾填埋场的压力,减少食物浪费和食品化学污染(莫汉,2011;Alvarez-Chavez et al ., 2012;Peelman et al ., 2013;只是et al ., 2017;Guillard et al ., 2018;Firoozi et al ., 2021;McGauran et al ., 2021)。尽管生物塑料是目前被认为是安全的,很少有研究调查他们的环境、健康和安全的影响在整个生命周期(Alvarez-Chavez et al ., 2012)。最近的一项研究强调,生物塑料和植物性材料比传统塑料(可能不安全齐默尔曼et al ., 2020)。此外,内分泌学会最近的一份报告强调,需要更多的测试和开发之前,我们可以完全解决问题再循环能力;土地、杀虫剂和用水生产淀粉含有植物生物塑料;塑料是解决和有毒添加剂(缺陷et al ., 2020)。理想情况下,所有的新产品都应该安全测试之前使用,然而,这是目前不是这样的,因为它不是强制性的实验室检测进行包装(欧洲委员会,2011年;包装基本要求规定,2015年)。具体措施存在某些类型的材料和物质,然而,并不是所有的资料和文章,故意添加物质或艾滋病需要聚合进行测试(欧洲委员会,2011年)。包装可能接触到食品应食品接触测试,以确保它们是安全的,不转移选民对食物的数量超过了特定的迁移限制,不引起食物(物理或其他变化欧洲委员会,2011年)。毒理学研究可以帮助指导生物塑料产品开发早期协助决策向更安全的产品。生产流程、代副产物和生物塑料的生物降解性可能带来的风险环境,人类或动物的健康和安全(Alvarez-Chavez et al ., 2012;只是et al ., 2017;Ramakrishnan et al ., 2018)。重要的是要理解流程和生产流程,期间使用的化学品生产和副产物生成,为了识别出任何不利影响的所有部分生物塑料的生命周期(Alvarez-Chavez et al ., 2012)。

添加剂或故意添加生产副产品如化肥和杀虫剂可能浸出的生物塑料食品、饮料或环境,因此可以由人类或动物摄入(Alvarez-Chavez et al ., 2012;Seltenrich 2015)。浸出单体和添加剂的塑料进入食品的内容往往是加速如果产品在阳光下暴露于紫外线辐射等常用压力和/或通过沸腾或供暖。即使使用材料,最初被认为是安全的,制造的压力可以改变化学结构或创建安全的物质或化学转化为化学反应的担忧之一(杨et al ., 2011)。然而,有限的信息安全的生物塑料及其渗滤液对人类健康和环境。

从包装渗滤液迁移到食品通常是评估使用替代品的食物,被称为食品模拟的。亲水、亲脂性的或食物的两亲性特征决定了食品模拟的使用。例如,迁移到酸性食物(pH值低于4.5)测量使用醋酸3% (w / v) (欧洲委员会,2011年)。迁移测试是最糟糕的可预见的条件下进行使用的塑料,因此,迁移到食品模拟物被认为高估实际迁移进入食品(Muncke 2014)。整体迁移测试是进行材料为了接触不同的食物类别或食物类别的组合。测试执行欧洲标准使用标准化的测试条件下,为了评估和迁移的化合物转移到食物,饮料和/或环境(欧洲委员会,2011年;Muncke 2011)。

本研究的目的是调查一系列生物聚合物的毒理学安全源自各种可再生资源(表1食品和饮料包装)和发展。除了生物聚合物,基于传统non-bio-based合成石油的聚合物称为聚丙烯(PP)和一些无机生物添加剂与PP混合也被评估。评估是通过应用迁移测试样品,准备根据欧洲测试标准,对哺乳动物的报告基因化验(rga)将自然性类固醇受体能够测量(ant)激动的雌性激素,雄性激素和孕激素核受体转录活动(Willemsen et al ., 2004;Connolly et al ., 2011;Frizzell et al ., 2013)。rga平行,MTT试验是用来测量细胞代谢活动作为细胞生存能力的指标和监控细胞毒性效应的测试样品。

表1

表1。根据生物聚合物不同的可再生资源。

材料和方法

化学药品和试剂

细胞培养试剂杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),一般的胎牛血清的边后卫,TrypLE™表达胰蛋白酶,台盼蓝和伯爵夫人™细胞计数室幻灯片由生命技术(英国佩斯利)。标准17β雌二醇(E2)(纯度≥97%),睾酮(纯度≥98%)和孕酮(纯度≥99%)由Sigma-Aldrich(英国普尔,多塞特郡)。甲醇(甲醇)、二甲亚砜(DMSO),磷酸盐,charcoal-stripped的边后卫(10%)和噻唑基溴化四唑蓝(MTT)由σ-奥尔德里奇。裂解试剂和荧光素酶检测系统是由Promega(南安普顿,英国)。超纯水是提供从一个in-house18 MΩ微孔水系统、微孔有限公司(英国赫特福德郡)。生物聚合物样品由Eoin坎宁安博士贝尔法斯特女王大学工程系,Rodenburg生物聚合物和CobelPlast,比利时。

整体迁移模拟

整体迁移测试执行欧洲标准使用标准化测试条件下(欧洲委员会,2011年),即。,24 h and 10 days at 20 and 40°C in distilled water (dH₂O)或水的等效质量所示表2。甲醇是除了dH使用₂啊,因为它没有溶解的聚合物和通常使用的在体外生物细胞溶解的标准应用程序。此外,甲醇和dH₂O在整个迁移测试允许更多的极性和极性溶剂使用。

表2

表2。整体迁移测试标准测试条件下(欧洲委员会,2011年)。

在这项研究中使用的生物聚合物(表3)是利用生物资源生产的废水,微生物,bio-derived单体或生物量。生物聚合物颗粒样本分别称重和加入1毫升的水超纯MilliQ 18 mΩ(dH₂O)或甲醇(甲醇)和条件在水浴24 h或10天20或40°C一式两份。检查的潜在影响溶剂,dH₂O和甲醇,一个空白样品进行玻璃小瓶只包含溶剂。24小时或10天的迁移后,溶剂dH₂O和甲醇蒸发在氮气流在37°C和500年重组µl甲醇和冷冻−20°C到使用在体外生物分析。

表3

表3。聚合物样品的性质和供应商的细节在本研究包括评估;生物、无机生物混合non-bio-based传统合成石油为基础的聚合物称为聚丙烯,独自和聚丙烯。提供所有的聚合物都是纯粹的没有额外的添加剂。样本来自鸡在传统农业生产实践。

细胞培养

三个报告基因的细胞系,MMV-Luc(雌激素响应),TARM-Luc(雄激素和孕激素响应性)和TM-Luc(孕激素响应)以前开发的转变人类乳腺细胞系与荧光素酶基因的一种类固醇激素诱导启动子的控制下(Willemsen et al ., 2004)。75厘米的细胞常规培养²组织培养瓶(Nunc、鲁开德、丹麦)37°C公司为5%₂和95%的湿度。细胞系的培养细胞包含DMEM培养基,10%的边后卫(50/500毫升中、谷酰胺1%)。然而,对于培养MMV-Luc细胞系,DMEM使用无酚红由于疲软的求偶性酚红。细胞是通过80% confluency和媒介改变了每周2 - 3次。细胞被分离从烧瓶用TrypLE™表达胰蛋白酶。细胞计数和可行性检查之前播种盘得到用台盼蓝染色和伯爵夫人^®自动细胞计数(生命技术、佩斯利、苏格兰)。播种和曝光,细胞培养分析媒体包含DMEM(或无酚红DMEM MMV-Luc细胞株)补充激素减少10%血清谷酰胺(charcoal-stripped的边后卫)和1%。

报告基因分析

(蚂蚁)受体激动剂核受体转录活动评估如前所述Frizzell et al。(2011)。简单地说,细胞被播种在4×10的浓度⁵细胞/毫升成白色的围墙,明确96 -孔板和平板触底(他一一Bio-One, Frickenhausen,德国)。24小时后,生物聚合物样品和相关的甾类激素标准溶解在甲醇(甲醇)被添加到细胞在最后0.5%的甲醇浓度v: v在媒体。兴奋剂测试,标准曲线用于每个细胞株:0.00014 - -2.7 ng / ml E2 (MMV-Luc), 0.03 - -144.21 ng / ml睾酮(TARM-Luc)和0.3 - -3144.6 ng / ml孕酮(TM-Luc)。积极控制各自的细胞系中使用的是:0.14 ng / ml E2 (MMV-Luc), 14.5 ng / ml睾酮(TARM-Luc)和157 ng / ml孕酮(TM-Luc)。拮抗剂试验是由孵化测试化合物的相对积极的控制被测试的细胞系。溶剂控制(0.5% v:甲醇在媒体)也包括对于每个细胞株。细胞培养48 h,上层清液被丢弃后,细胞与磷酸盐洗一次。细胞是细胞溶解25μl细胞裂解缓冲和100μl荧光素酶底物注入每一个荧光素酶活性测定,使用密特拉多模读者(贝特,德国)。细胞系的各种化合物的反应测定并与相应的溶剂和积极的控制。rga的进行了一式三份为每个实验在三个独立的风险点和重复。

溴化噻唑基四唑蓝(MTT)测定

MTT测定是并行执行RGA测量细胞的代谢活动,监控测试化合物的细胞毒性效应的RGA细胞系。总之,清晰,平底的96孔板(Nunc、鲁开德、丹麦)和4×10被播种⁵细胞/毫升MMV-Luc TARM-Luc TM-Luc细胞系和孵化24 h。测试化合物在最后0.5%的甲醇浓度和溶剂控制(0.5% v: v甲醇在媒体)被添加到细胞和培养48 h。上层清液是丢弃200μl磷酸盐和细胞洗一次。然后,50μl MTT的解决方案(2毫克/毫升的股票磷酸盐,稀释在媒体1:6)被添加到每个和孵化3 h在37°C。在这个分析,可行的细胞可溶性黄色MTT转化为不溶性紫色甲瓒线粒体琥珀酸脱氢酶的作用。DMSO溶液的上层清液取出来200μl添加到每个溶解甲瓒晶体。板是在37°C的环境与搅拌10分钟。光密度(OD)测量使用日出分光光度计(瑞士TECAN)在570纳米过滤器在630 nm的引用。所有的样品都在一式三份井和三个独立的风险评估。可行性计算作为样品的吸光度比例相比,溶剂的吸光度控制。

统计分析

rga的剂量反应曲线是装有GraphPad棱镜软件,版本6.0 (CA)圣地亚哥使用s形的剂量反应曲线方程,Y =底+(自上而下)/ (1 + 10 (^(LogEC50-X))∗HS),其中X是浓度的对数,Y响应,底部和顶部是固定的0%和100%,分别的最大响应标准用于每个测试、电子商务₅₀浓度的增加50%最大响应和HS山上斜坡。百分比(%)反应是通过计算测量相比,积极的响应控制。所有实验点rga和MTT检测进行了一式三份井和重复在三个独立的风险(n= 3),变异系数(CV)计算的三个风险敞口;实验分都低于15%。数据分析使用Microsoft Excel和GraphPad棱镜软件,版本6.0。显示所有值表示为平均值±标准平均误差(SEM)化合物的三个独立的风险测试。单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett多重比较测试被用来确定样本之间的显著差异和相应的控制。平均浓度检测显著差异在95%置信水平。由重大影响p≤0.05 (*),p≤0.01(* *)和p≤0.001 (* * *)。

结果

潜在的荷尔蒙活动迁移测试样本调查的核受体转录活动利用rga的面板。rga平行,细胞代谢活动也用MTT试验监测样品的细胞毒性效应。所有的结果总结表4。

表4

表4。淋溶的生物聚合物荷尔蒙活动以RGA和MMV-Luc(雌激素反应)和TARM-Luc细胞系(雄激素反应)。

以MTT测定代谢活动

影响细胞迁移测试样本的可行性研究MMV-Luc, TM-Luc TARM-Luc细胞系,量化使用MTT代谢活动转换。没有显著影响MMV-Luc代谢活动,TM-Luc和TARM-Luc细胞系诱导迁移测试的测试样本进行了24小时相比,溶剂控制。无显著影响的代谢活动TM-Luc和TARM-Luc细胞系诱导迁移测试的测试样本进行了10天相比,溶剂控制(数据未显示)。然而,代谢活动显著减少MMV-Luc细胞系(图1)治疗后蛋壳/聚丙烯(0.1:99.9)接受10天40°C的迁移测试甲醇(13.35和12.83%;p≤0.05)和聚丙烯(PP) 10天后迁移测试甲醇在40°C(13.71和16.6%;p分别为≤0.05和0.01)和dH₂O(13.71和18.13%;p分别为≤0.05和0.01)相比,溶剂(甲醇0.5% v: v)的控制。

图1

图1。MTT代谢活动的MMV-Luc细胞株后48 h接触(一)蛋壳/聚丙烯(0.1:99.9)(B)聚丙烯和控制溶剂(甲醇0.5%)。数据表示为溶剂的比例控制(甲醇0.5% v: v);意味着±SEM,n= 3。p≤0.05 (*)p≤0.01 (* *)。

报告基因分析(受体激动)

没有观察到任何主动影响标准化的测试条件下的测试样本MMV-Luc, TARM-Luc TM-Luc细胞株(数据未显示),除了四个测试样本MMV-Luc(雌激素响应)细胞株,后10天的迁移测试(表5)。

表5

表5。E2与雌激素的量(EEQ)计算使用MMV-Luc(雌激素响应)细胞系作为衡量生物淋滤的雌激素活性的聚合物家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)、家禽羽毛基础聚合物,蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和聚乳酸(PLA)和E2 EEQ估计日常人类消费通过食品包装。

雌激素剂量反应曲线生成使用类固醇激素标准E2 (MMV-Luc) (图2)。E2等效量(EEQ)作为衡量测试的雌激素活性化合物的计算使用s形的剂量反应曲线方程Y =底+(自上而下)/ (1 + 10 (^(LogEC50-X))∗HS)。X是Y的对数浓度,响应,底部和顶部是固定的0%和100%,分别的最大响应标准用于每个测试、电子商务₅₀浓度的增加50%最大响应和HS山上斜坡。假设一个成年人的平均体重是70公斤,欧洲食品安全局,每日人类消费水平的雌激素的化合物可以基于雌激素受体激动剂的浓度计算活动(ng /公斤体重(bw) /天)=等效E2浓度(ng / g)稀释系数x日剂量(g /天)/平均体重(ABW)(公斤)欧洲食品安全署,2012;Plotan et al ., 2013)。的EEQ值计算测试样本和雌激素的人类活动和日常消费的E2生物聚合物渗滤液所示表5。

图2

图2。雌激素反应的剂量反应曲线的E2 MMV-Luc RGA细胞系(雌激素响应)。值意味着±SEM为三个独立的实验(n= 3)。

经过10天的迁移测试,家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)甲醇在20和40°C,家禽羽毛聚合物在甲醇和dH为基础₂O在40°C,蛋壳在dH /聚丙烯(40:6 0)₂O在dH 40°C和解放军₂在40°C O提出响应统计高于溶剂控制(甲醇0.5% v: v);p≤0.05 (*),p≤0.01 (* *)和0.001 (* * *)(图3)。雌激素的反应从2.53% - -5.63%变化(表4)与相应的EEQ从0.26 - -0.50 ng / ml (表5)。生物聚合物PLA,市场上目前最常见的生物聚合物(用于各种食品接触包装产品,包括杯子,盖子,沙拉盒和涂料),表现出在dH最强的雌激素活性₂在40°C O 10天后迁移测试;然而,E2相比,所有的雌激素的生物聚合物显示相对较弱的雌激素反应雌激素响应MMV-Luc细胞系。计算所有值都在可接受的每日摄入量(ADI)限制(0-50 ng /公斤体重)E2设定的食品添加剂联合专家委员会(2000)。

图3

图3。雌激素受体激动剂的反应(一)家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90),(B)家禽羽毛聚合物为基础,(C)蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和(D)聚乳酸(PLA) MMV-Luc细胞系(雌激素响应)。反应溶剂相比控制测量(甲醇0.5%)和积极控制(0.14 ng / ml E2)。响应表示为百分比响应±SEM、n= 3。p≤0.05 (*),p≤0.01(* *)和0.001 (* * *)。

报告基因分析(受体拮抗)

没有观察到显著的拮抗效果的标准测试条件下的测试样本MMV-Luc, TARM-Luc TM-Luc细胞株(数据未显示),除了一个测试样本。经过10天的迁移测试生物聚合物家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)在甲醇40°C展出的拮抗效应TARM-Luc(雄激素和progestagen响应)细胞系,用19.49%和11.02减少雄性激素核受体转录活动(p≤0.01和p分别为≤0.001)所示图4。这减少雄性激素核受体转录活动可以确认为真正的对抗没有显著减少MTT代谢活动中看到MTT试验(数据没有显示)。

图4

图4。敌对的反应家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)TARM-Luc细胞系(雄激素反应)。响应测量比较控制溶剂(甲醇0.5%)和积极控制睾丸激素14.5 ng / ml。响应表示为百分比响应±SEM、n= 3。p≤0.01(* *)和0.001 (* * *)。

总结结果样本的淋溶的化合物表现出减少代谢活动或一个(ant)主动响应MMV-Luc(雌激素响应)或TARM-Luc(雄激素反应)细胞系中给出表4。表4排除的结果TM-Luc (progestagen响应)细胞株没有总值(ant)受体激动剂活性或细胞细胞毒性检测的生物聚合物测试在任何标准化的测试条件。没有表现出的生物聚合物渗滤液总细胞细胞毒性或(ant)主动响应的RGA细胞系在任何标准化的测试条件,提出了表6。所有样品的测试结果与EEQs归纳了相关的地方表7。

表6

表6。生物聚合物样品显示没有细胞毒性MTT测定的活动或(ant)受体激动剂MMV-Luc荷尔蒙活动(雌激素响应),TARM - Luc(雄激素反应)或TM-Luc(孕激素响应)RGA细胞系在任何标准化的测试条件。

表7

表7。总结的结果在体外生物测定所有迁移测试的测试样品和混合,包括细胞毒性/代谢影响,荷尔蒙活动和E2等效量计算(EEQs)。

讨论

这项研究调查了内分泌干扰的潜在影响生物聚合物的雌性激素,雄性激素使用rga和progestagen核受体转录活动。平行于rga,代谢活动使用MTT试验测量,作为控制指标样本总细胞的细胞毒性。研究中观察到所有的细胞毒性和荷尔蒙渗滤液活动总结表7。

这项研究表明,蛋壳/聚丙烯(10:90),PHB, PBAT TPS, PBS、PCL和解放军/ PBAT混合并没有引起任何激素或细胞毒性活动在任何标准化的测试条件。因此,他们可能更安全的候选生物塑料行业的进一步发展,特别是对食品包装应用。

10天后迁移测试40°C,蛋壳/聚丙烯(0.1:99.9)甲醇和甲醇non-bio-based PP和dH₂O降低代谢活动只有在雌激素响应MMV-Luc细胞系。该细胞系特定效应可能是由于不同的鲁棒性RGA父细胞系,MCF-7细胞系是父母的血统MMV-Luc细胞系而T47D TM-Luc父母的血统,TARM-Luc细胞系。传统的合成聚合物页通常用于制造食物容器和曾被描述为一个安全non-EDC-related材料(爆炸et al ., 2012;钟et al ., 2013)和细胞毒性的影响(黄et al ., 2019;齐默尔曼et al ., 2019)。使用CCK-8比色测定测量细胞生存和扩散,黄et al。(2019)发现PP粒子和PP分散在介质直接接触有细胞毒性影响外周血单核细胞和小鼠巨噬细胞生264.7,结束化学品时可能释放PP粒子溶解在介质或直接接触细胞。齐默尔曼et al。(2019)发现食品接触的材料(fcm)包含页,如酸奶杯和橡皮糖包装,不同的基线毒性和细胞毒性,一些诱导毒性Microtox试验通过抑制生物荧光细菌Aliivbrio fischeri和一些AREc32诱导细胞毒性试验和基于酵母RGA细胞系。PP基于fcm的毒性的化学成分取决于包装、添加剂,如抗氧化丁羟甲苯和增塑剂三丁基acetylcitrate已报告在ToxCast诱导细胞毒性数据(齐默尔曼et al ., 2019)。在最近的研究中,减少代谢活动只是观察到温度较高的测试条件(40°C)和长期(10天)。同样的,光照山河Hakkarainen和(2011)发现加热PP基于fcm导致退化的抗氧化剂的增加,导致增加页迁移到食品模拟的。这将是未来的兴趣识别细胞毒性PP渗滤液(s)负责,但这需要进一步的工作和分析方法能够检测未知。整体而言,这些结果表明,PP不适合FCM发展和蛋壳/聚丙烯(0.1:99.9)可能只适合使用更多的极性溶剂,如建立食品在低温下储存和使用。另外,这些配方为非食品接触应用程序概要文件可以开发。

相比之下,蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和蛋壳/聚丙烯(10:90)含有低水平的PP(分别为60%和90%)并没有减少代谢活动在任何标准化考试的条件。此外,细胞毒性PP渗滤液(s)容易淋溶成甲醇只有dH₂O蛋壳在非常低浓度的0.1%或不是。这表明,蛋壳可能绑定毒物在dH更高的亲和力₂O在甲醇相比。这个特定的绑定可以提供一个有益的清理工具在许多包装配方。确实是非常有趣的未来的工作将蛋壳添加到聚合物已知leach edc和评估如果碳酸钙的引入可以绑定和edc清理。

大多数塑料制品leach雌激素的化学物质,强调潜在的内分泌扰乱渗滤液在食物或饮料产品(杨et al ., 2011;齐默尔曼et al ., 2020)。当前的研究表明,经过10天的迁移测试,测试的四个样品中雌激素的活动表4,包括家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)、家禽羽毛基础聚合物,蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和中国人民解放军。虽然是理想的零荷尔蒙活动,发现雌激素活性在低水平,从2.67%到5.47%不等的相对响应与相应的EEQ ER RGA的范围从0.26到0.50 ng / ml。假设一个成年人的平均体重是70公斤,暴露水平的雌激素化合物通过食物或饮料包装的生物聚合物可以计算(欧洲食品安全署,2012;Plotan et al ., 2013)。Plotan et al。(2014)计算了接触水平基于雌激素受体激动剂的浓度雌激素化合物活动(ng /公斤体重(bw) /天)=等效E2浓度(ng / g)稀释系数x日剂量(g /天)/平均体重(ABW)(公斤)。然而,每日剂量的产品是未知的生物聚合物的发展阶段和尚未使用的行业。因此,假设一个成年人消耗平均每日摄入500克或500毫升的食物或饮料包装的生物聚合物,暴露水平的雌激素化合物摄入可以计算,从1.86 - -3.57 ng /公斤体重/天(表5)。这些暴露水平低于成年人吃杂食的饮食,估计是23 ng /人/天EEQ内源性雌激素。然而,这是一个估计价值不考虑植物雌激素或雌激素的贡献没有雌激素效能或出现数据(考德威尔et al ., 2010;Plotan et al ., 2013)。食品添加剂联合专家委员会(2000)建立的ADI E2 50 ng /公斤体重/天。因此,它可能会得出结论,认为暴露水平的基础上摄取雌激素的化合物,雌激素的活动水平的生物聚合物渗滤液不给消费者带来安全风险。类似于我们的研究结果表明使用无机废物添加剂如蛋壳可以将细胞毒性渗滤液从聚合物如PP、也可能在未来操纵生物聚合物配方减少或完全消除这种低水平的荷尔蒙活动。

雌激素活性检测相比,测试样本是最小的BPA的雌激素活性已被确定浸出塑料制品(Kuruto-Niwa et al ., 2005;格氏et al ., 2012;Bittner et al ., 2014;胡锦涛等人。,2016年)。欧盟委员会(European Commission)设置一个特定的迁移限制BPA;600μg /公斤的食物之前禁止使用BPA生产聚碳酸酯婴儿喂奶瓶(欧洲委员会,2004;2011 b)。BPA报道迁移的聚碳酸酯塑料婴儿奶瓶在迁移水平1.83μg /公斤(0.008µM) (Simoneau et al ., 2011)。Le et al . (2008)发现BPA的渗聚碳酸酯水瓶在室温下1 ng / ml的浓度(0.004µM),然而,在接触到100°C的浓度BPA (7.67 ng / ml;0.03µM)浸出的塑料瓶增加。BPA在相对浸出浓度可能与激素响应有关乳腺癌可能介导的双酚a的雌激素活性;激活ERα-mediated信号,随后改变反应在乳腺上皮细胞的基因转录和表达(翁et al ., 2010)。此外,双酚a之间的关联(1.66 ng / ml)相对浸出浓度和人类复发性流产的风险了沈et al。(2015)。以前的工作(哈珀,2020)已经表明,双酚a(0.002 -20µM), bisphenol-F(瘘)(0.002 -200µM)和bisphenol-S (BPS)(0.002 -20µM)表现出雌激素活性浓度相关的每日耐受摄入量(TDI) 4µg BPA /公斤体重/天为一个70公斤的人(剂量相当于0.02∼µM) (欧洲食品安全署,2015)。雌激素的反应从14.91%变化到54.23% BPA,带通滤波器和16.23% 17.1% -131.2% -79.22%个基点与相应EEQ从1.354到7.838 ng / ml的BPA, 1.58 - -736.47 ng / ml带通滤波器和1.49 - -22.83 ng / ml个基点。EEQ计算可以确定化合物的雌激素效能(Vega-Morales et al ., 2013)。先前的研究已经表明BPA,带通滤波器和基点在体外有类似雌激素的效能强大100000倍低于17吗β雌二醇(格氏et al ., 2012;罗彻斯特和博尔登,2015年;Mesnage et al ., 2017)。双酚相比,诱导弱雌激素响应的测试样品在最近的研究中,通过受体活性显著降低雌激素的效能,从3∼少强大2800倍。最小雌激素活性和生物聚合物渗滤液的效力的研究在当前的研究表明,生物聚合物可以是一个更安全的替代塑料包装使用BPA等化合物。

家禽羽毛基于bio-polymer由丙醇醇(28%),包括在催化剂配方(硫化钠,1 - 2%)和角蛋白中含有大量的蛋白质的氨基酸半胱氨酸与硫醇组(莎莉尼·辛格,2009;徐et al ., 2017)。MMV-Luc细胞系是特定的检测ER转录激活和内生表达Erα和Erβ时,但主要Erα(Willemsen et al ., 2004;法国埃兹et al ., 2019)。ER是一种dna结合蛋白功能作为雌激素反应激活转录因子的蛋白质。包含两个锌指dna结合域的受体;每个手指都有一个锌原子协调4半胱氨酸(Garcia-Morales et al ., 1994)。因此,角质蛋白的半胱氨酸和硫醇团体可能会扰乱hormone-binding Erα域(周et al ., 2013)。基于雌激素活性的家禽羽毛bio-polymer只是观察到温度较高的40°C。Aranberri et al。(2017)发现鸡毛用于可生物降解高分子材料有一个大型低温吸热峰在77°C;这个峰值范围从30 - 130°C和角蛋白结构确定束缚水的数量,可以称为“变性”的温度。因此,角质蛋白可能已开始展开和放松,随后导致雌激素的化合物的迁移或添加剂的生物聚合物(大的,他和2016;拉皮德斯,2017)。

解放军表现出最强的雌激素活性的生物聚合物测试EEQ 0.50 ng / ml的价值。齐默尔曼et al。(2019)发现,解放军的fcm,酸奶杯和蔬菜托盘,激活人类ERα使用基于雌激素报告基因分析。同意我们的发现,齐默尔曼et al。(2019)观察到的低雌激素的活动计划,分别为5.47%和0.34%。ToxCast数据确定的众多化合物包括脂肪酸;月桂酸(月桂酸)、硬脂酸(硬脂酸)、棕榈酸(棕榈酸)和油酸可浸出的解放军塑料和诱导雌激素的活动(齐默尔曼et al ., 2019)。研究发现改变脂肪酸调节人的E2绑定到受体和/或裂开土生土长的人(Borras和勒克莱尔,1992年;普林斯罗和van Aswegen, 2002年)。Borras和勒克莱尔,1992年发现不饱和脂肪酸可以扰乱ER行动通过胞内互动ER和不饱和脂肪酸作为第二信使在调节细胞功能或通过跨膜调制磷酸激酶和/或磷脂酶与ER的作用机制。杨et al。(2011)雌激素的活动报道(> 15%的相对最大响应E2)的塑料包装由解放军使用MCF-7细胞增殖测定盐水分离开来。的结果杨et al。(2011)相关结果发现在当前的研究中,解放军会渗透到更多的极性溶剂,dH₂O和盐水,并表现出虽然没有发现雌激素活性雌激素活性的解放军测试在极性溶剂,甲醇和乙醇。极性溶剂已确定增加外来化合物的降解并释放在解放军包装由于聚合物水解。乳酸是解放军唯一的单体,可以作为乳酸或加入迁移到调光器和解放军水解产生的寡聚物(Fortunati et al ., 2012)。有降低聚乳酸在食品包装中的应用,作为解放军已经证明了热稳定性低,可怜的屏障属性(Fortunati et al ., 2012)。

家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)提出了雌激素和抗雄性激素的活动。同意我们的发现,Bittner et al。(2014),确认页没有任何额外的化学物质添加在生产零聚碳酸脂塑料表现出MCF-7细胞中没有检测到雌激素活性。我们也没有发现(反)雄激素的活动页。因此,荷尔蒙活动必须来自家禽垃圾灰元素。家禽的构成垃圾灰/聚丙烯(10:90)包括聚丙烯、硫酸钾、氯化钾、磷酸氢钙、氟化钠和五氧化二磷。氟化物曾被认定为一个EDC,改变正常的内分泌功能和反应(国家研究委员会,2006年)和氟化钠也被发现在低剂量作为EDC (范登堡et al ., 2012),抑制胰岛素分泌甲状旁腺和甲状腺激素。家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)也淋溶物质和雄激素受体(AR)激活对着干的极性溶剂,甲醇,而不是更多的极性溶剂,dH₂在40°C O, 10天后迁移测试。更自由的氟化钠溶解在甲醇溶剂的温度增加,因此,氟化钠可能淋溶的家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)甲醇在40°C (Germuth 1931)。也报告了氟化钠抑制AR mRNA表达支持细胞在小鼠体内,降低睾丸的AR蛋白和基因表达,因此,负面影响男性生育能力(黄et al ., 2008)。减少基于“增大化现实”技术的转录活动在当前的研究中观察到的影响可能是由于氟90 kda热休克蛋白质(一半),可能会降低转化生长因子受体2 (TGFR-2)水平,并抑制TGF-β信号活动,通过调节细胞周期蛋白D1 (CCND1) (克努森,et al ., 1999;Le et al ., 2017)。以前的研究也发现,塑料渗滤液BPA可以直接绑定到基于“增大化现实”技术作为拮抗剂的基于“增大化现实”技术通过抑制内源性雄激素的行为和基于“增大化现实”技术的目标基因的转录浓度高于和低于每日总摄入量(4μg /公斤体重/天为一个70公斤的人)(李et al ., 2003;徐et al ., 2005;太阳et al ., 2006;Bonefeld-Jørgensen et al ., 2007;腾et al ., 2013;马et al ., 2019)。BPA可以降低AR老鼠足15 p - 1细胞转录活动集成电路₅₀0.08µM和可以减少基于“增大化现实”技术的转录活动超过20%相对浸出浓度0.01µM (李et al ., 2003)。BPA的拮抗作用的基于“增大化现实”技术可能导致对男性生殖系统造成的不良影响,如降低精子数量,干扰精子能动性和减少生殖器官重量(徐et al ., 2005)。减少的基于“增大化现实”技术的转录活动接触家禽后垃圾灰/聚丙烯(10:90)低于相对浸出浓度的BPA。因此,生物聚合物的研究在当前的研究中可能更安全替代塑料包装使用BPA等化合物和潜在安全适合生物塑料行业的进一步发展。

雌激素活性最高的生物聚合物中发现蛋壳比聚丙烯(40:6 0)。鸡蛋壳的成分由95%的碳酸钙,蛋壳膜、磷、镁、锶和钠的痕迹,锌、铁、铅、锰和铜(2003年莫拉;Rovensky et al ., 2003;Ummartyotin Tangnorawich, 2015;数et al ., 2019;阿加延et al ., 2020)。渗滤液化合物(s)负责诱导禽类蛋壳的雌激素活性是未知的。蛋壳可能含有生物活性的化合物,如重金属和蛋白质丰富的氨基酸如组氨酸、精氨酸和天冬氨酸(Nakano et al ., 2003;Nagamalli et al ., 2017)。信息的雌激素活性金属锶是有限的。但是,先前的研究已经发现,金属,如镉、汞、砷、铅、锰和锌会影响激素水平、激素生产、基因转录活性的类固醇激素受体和模仿操作(Garcia-Morales et al ., 1994;Lafuente et al ., 2003;Smida et al ., 2004;斯利瓦斯塔瓦et al ., 2004;松et al ., 2005;Bodwell et al ., 2006;Agusa et al ., 2007;Iavicoli et al ., 2009)。一些金属已经被列为metalloestrogens由于他们能够干扰雌激素荷尔蒙的作用(安全的,2003)。金属和氨基酸有能力扰乱E2的作用,人队和DNA由于锌指图案的参与过程,如ER二聚作用与DNA和绑定。这些锌指图案有半胱氨酸和组氨酸对金属的高亲和力。研究表明,金属和氨基酸能够绑定到ER锌指DNA结合域的图案,破坏一些转录因子与DNA的结合能力(Zawia et al ., 1998;Reddy Zawia, 2000;Razmiafshari et al ., 2001;老爹et al ., 2011)。金属包括铝、锑,砷,钡,镉,chro-mium (Cr (II))、钴、铜、铅、汞、镍、亚硒酸盐、钒酸锡和有能力结合的配体结合域Erα,提高E2的兴奋剂活动他们的人,因此,作为雌激素受体激动剂在测试系统包括亲和色谱法,MCF7细胞增殖和报告基因(Darbre 2006)。因此,金属在蛋壳的存在可能有可能引起雌激素MMV-Luc细胞系的活动通过metalloestrogens的类似行动。

迁移测试工作在当前的研究中进行了塑料最糟糕的可预见的使用条件下,因此,渗滤液迁移到食品模拟物被认为高估实际迁移进入食品(欧洲委员会,2011年;Muncke 2014)。因此,还应该指出的是,在当前的研究中渗滤液的细胞毒性和内分泌活动可能高估了。

fcm的内分泌扰乱潜力取决于化学成分的塑料包装,然而,塑料产品制造商通常不列出他们的化学成分(杨et al ., 2011)。聚合物和生物聚合物生产少量的各种添加剂,如抗氧化剂、增塑剂的身体而不是化学绑定到聚合物结构,因此,这些添加剂可以从塑料制品以非常低的浸出浓度(例如,摩尔picomolar)单独或组合可以导致不良健康效应(缺陷et al ., 2020)。塑料的生产过程中使用了很多单体和添加剂可能表现出雌激素活性或可能减少的核受体转录活动由于物理化学性质,使他们能够绑定到核受体(杨et al ., 2011)。浸出从塑料的添加剂和单体到其内容如食品通常是加速如果产品在阳光下暴露于紫外线辐射等常用压力和/或潮湿的热通过沸腾或洗碗。然而,许多生物可降解聚合物对水和水分敏感所以不会适用于洗碗机。即使使用材料,起初不知道leach激素活性化合物,制造业的压力可以改变化学结构或创建化学反应将非激素活性化合物转化为与内分泌扰乱化学活动(杨et al ., 2011)。

极性和溶解性属性迁移的重要因素是由于聚合物之间的相互作用,模拟的移民和食物。如果移民贫困食物中的溶解度模拟的它将保留在聚合物基质中,而同时影响基于高亲和力食品模拟物和聚合物之间可能会导致聚合物基质吸收。此外,溶剂的吸收可能会导致肿胀聚合物基质中,因此,扩大分子间的缝隙,导致小颗粒的迁移和降解产物(Zygoura et al ., 2011;Fortunati et al ., 2012)。结果也不同,相同的生物聚合物之间的相同的标准测试条件下浸出更多的极地dH₂O和极地甲醇。因此,使用更多的极性和极性溶剂应评估,以确保能够发现更多的极性和极性渗滤液活动作为塑料容器可以保存类型的液体或液体的混合更多的极性和极性溶剂(如牛奶)(杨et al ., 2011)。

溶解度、温度和曝光时间控制渗滤液迁移的重要因素。在协议与我们的研究中,Muncke (2014)还发现,化学迁移的程度从食品包装食品和食品模拟的高度与温度和暴露的持续时间。迁移的激素活性渗滤液的家禽羽毛基础聚合物,蛋壳/聚丙烯(40:6 0),解放军和家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)后发生迁移测试条件下实施代表在室温下长期存储或低于或加热到100°C。相比之下,代表短期存储在室温条件下或下面,似乎没有一个生物聚合物溶解物质和激素的活动。

结论

内分泌干扰和有毒包装渗滤液对消费者是一个主要的健康问题和环境。同时进行所有的生物聚合物研究可以忽略不计或者少荷尔蒙渗滤液活动相比,双酚a,理想情况下是可取的发展与零包装毒理学风险。还应该指出的是,虽然目前的研究进行初步调查的雌性激素,雄性激素和孕激素核受体转录活动,进一步的调查也应该调查其他endocrine-related通路,通过不同的作用机制。

传统的石油为基础的聚合物PP没有激素活动但也浸出潜在的有毒化合物,减少代谢活动在我们雌激素响应MMV-Luc细胞系。生物聚合物蛋壳/聚丙烯(10:90),PHB, PBAT TPS, PBS、PCL和解放军/ PBAT混合不存在任何激素或细胞毒性活动在任何标准化的测试条件,从而可能潜在的候选人更安全食品接触包装行业的进一步发展。基于家禽羽毛的聚合物和解放军和配方蛋壳/聚丙烯(40:6 0)和家禽垃圾灰/聚丙烯(10:90)雌激素活性,后者也呈现人类。这些发展聚合物及其配方可能更适当的涌向非食品包装领域的进一步发展。

本研究的主要发现是,改变配方和成分水平可能消除有毒,或激素的活动。例如,雌激素和有毒活动中观察到蛋壳和蛋壳/聚丙烯PP配方被淘汰(10:90)制定由相对较低的蛋壳和PP浓度比其他配方或单独页。这种情况发生的机制还有待阐明,但效果可能与复合稀释减少或者蛋壳可能绑定和消除有毒元素页类似雌激素的活动中观察到解放军消灭在PLA / PBAT混合。

总之,本研究首次证明毒理学分析结合开发新的生物或操纵与传统合成聚合物无机添加剂的混合物可能会消除荷尔蒙和有毒渗滤液从包装材料、包装安全发展提供一个有用的方法。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

作者的贡献

嗯,开发研究设计和研究问题,完成实验室工作,撰写和编辑的手稿。EC、开发研究设计和研究问题,聚合物的主管工作,撰写和编辑的手稿。LC,整体研究的发起者想法,开发研究设计和研究问题,主管的生物测定工作,撰写和编辑的手稿。

资金

这项工作是支持的经济部门提供的博士奖学金资助(DfE)北爱尔兰。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用

Agusa, T。,Kunito, T., Iwata, H., Monirith, I., Chamnan, C., Tana, T. S., et al. (2007). Mercury in hair and blood from residents of phnom penh (Cambodia) and possible effect on serum hormone levels.光化层68 (3),590 - 596。doi: 10.1016 / j.chemosphere.2007.01.003