阳离子碳纳米颗粒诱导Inflammasome-Dependent Pyroptosis巨噬细胞通过溶酶体功能障碍
优思明Arezki,
Luc Lebeau
弗朗索瓦丝脑桥- Laboratoire de等概念应用德分子Bioactives UMR 7199年CNRS-Universite de斯特拉斯堡,将年鉴Illkirch,法国
碳纳米材料,包括碳点(CDs),形成一个不断增长的家庭工程纳米颗粒(NPs)的广泛应用。作为纳米技术的迅速发展引发了安全隐患,NPs与免疫系统的相互作用是接收大量的关注。最近的研究报告说,转基因NPs pyroptosis可能诱导巨噬细胞死亡。因此,本研究调查了阳离子CDs是否导致人类巨噬细胞和评估pyroptosis inflammasome和溶酶体的作用过程。阳离子cd微波热解形成的柠檬酸和高分子量支化聚乙烯亚胺。NPs诱发可行性存在剂量依赖的相关性损失THP-1-derived巨噬细胞。细胞渗漏、IL-1β分泌增加和激活caspase-1也应对NPs中观察到。抑制caspase-1 CD-induced细胞渗漏和IL-1β分泌减少,而恢复细胞的可行性。此外,cd引发肿胀和溶酶体的完整性丧失,和溶酶体酶的抑制组织蛋白酶B减少CD-induced IL-1β分泌。因此,我们的数据提供了证据表明,阳离子cd诱导inflammasome-dependent pyroptosis巨噬细胞通过溶酶体功能障碍。
介绍
在过去的几十年里,许多种类的纳米颗粒(NPs)与不同的化学成分(碳、金属、硅脂质聚合物)被设计用于各种目的,包括药或生物医学成像(Rudramurthy和偶像,2018年)。纳米技术的迅速发展引发了安全问题,工程纳米材料与免疫系统相互作用是接收大量的关注(Dobrovolskaia et al ., 2016;Boraschi et al ., 2017;Pallardy et al ., 2017)。实际上,当进入身体,NPs可以视为异物,感觉到危险信号的免疫系统,特别是巨噬细胞。巨噬细胞的第一线的主机防御各种各样的外部刺激,因此先天免疫系统的重要效应物(Laskin et al ., 2011)。作为专业的吞噬细胞,巨噬细胞清除身体的细胞碎片,死细胞,病毒和细菌。他们还分泌大量的介质包括活性氧化物种(ROS)、蛋白酶、细胞因子和生长因子。这些介质引发急性炎症反应后的身体受伤或感染和调节宿主防御。巨噬细胞作为抗原递呈细胞”的一部分,也有助于适应免疫力。大量的研究表明,巨噬细胞可以识别和内化各种NPs (中山2018)。这可能导致NP间隙,但他们的免疫毒性。实际上,巨噬细胞产生活性氧和分泌细胞因子后接触NPs (蒲赛et al ., 2012;de Luna et al ., 2016;Brzicova et al ., 2019;Casset et al ., 2019)。NPs也引发NLRP3 inflammasome激活,溶酶体功能障碍,在巨噬细胞和细胞死亡(霍农et al ., 2008;Tahara et al ., 2012;徐et al ., 2015;Tsugita et al ., 2017;Ronzani et al ., 2019)。因此,巨噬细胞已被证明发挥重要作用在免疫介导的疾病NPs所致在活的有机体内,如急性肺部炎症或纤维化(Shvedova et al ., 2005;Ronzani et al ., 2012)。
碳质纳米材料包括纳米金刚石、富勒烯、石墨烯、碳纳米管和碳点(CDs)形成一个日益增长的家庭材料广泛的应用程序(Cha et al ., 2013)。发现几乎2年前,CDs是quasi-spherical粒子具有独特的属性,包括非常小的尺寸(纳米),良好的水溶性,可调固有荧光、抗光漂白(徐et al ., 2004)。此外,他们可以很容易地通过一系列方法从合成成本有效的材料,可以直接实现及其功能化,使其宝贵的多功能平台设计复杂的设备与工业应用潜力巨大Himaja et al ., 2015)。旁边光电、光伏发电、能源存储或污水处理、CDs目前为应用程序开发的纳米医学包括药物或基因传递、生物医学成像和开展(Pierrat et al ., 2015;Claudel et al ., 2019;杜et al ., 2019;Ghosal Ghosh, 2019)。尽管碳不是视为一种有毒元素,碳基纳米材料提出了一些安全隐患,尤其是对免疫细胞(元et al ., 2019)。关于光盘,我们和其他报道内化NPs的巨噬细胞,与氧化应激有关,细胞因子分泌,和活力损失(Lategan et al ., 2018;Ronzani et al ., 2019)。然而,这些影响取决于CD物理化学特性,尤其是表面电荷。NPs使用一个大的图书馆,我们表明,阳离子cd,尤其是阳离子NPs与表面电荷密度诱导巨噬细胞生存能力损失,而阴离子cd展览没有影响(风扇et al ., 2019;维斯et al ., 2021 b)。阳离子cd与明显表面电荷密度引起肺部炎症小鼠气道管理,与阴离子的(维斯et al ., 2021 b)。假定的AOP导致这种病理反应涉及吸收NPs的巨噬细胞分子发起事件(维斯et al ., 2021 a)。
Pyroptosis裂解,促炎的程序性细胞死亡形式,在1992年首次描述(Cookson和布伦南,2001)。主要观察巨噬细胞,尤其是在细菌感染,并表现为膜完整性的丧失,导致释放细胞内容,包括有关的分子模式(抑制)和炎性细胞因子如IL-1β。Pyroptosis收益主要通过两个途径:时规范inflammasome路径依赖inflammasome和caspase-1激活,和2中的通路由caspase-4/5/11 (Hachim et al ., 2020)。最近的研究报告说,转基因NPs pyroptosis可能诱导细胞死亡的小鼠或inflammasome-dependent地人类肝细胞或巨噬细胞(Reisetter et al ., 2011;陆et al ., 2016;Mirshafiee et al ., 2018;Zhang et al ., 2018;梁et al ., 2020;王et al ., 2020)。除此之外,一些证据表明,溶酶体损伤和组织蛋白酶在一定条件下与pyroptosis (王et al ., 2018)。因此在目前的研究中,我们调查是否阳离子cd表现出表面电荷密度高触发pyroptosis在巨噬细胞和评估在这一过程中溶酶体的作用。进行这项工作佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)分化THP-1细胞代表一个合适的模型来研究巨噬细胞功能在体外(Chanput et al ., 2014)。
材料和方法
制备和表征的cd
CDs调查所产生和特点根据之前报道协议(风扇et al ., 2019;Ronzani et al ., 2019;维斯et al ., 2021 b)。短暂,CD合成柠檬酸(2.0克)和支化聚乙烯亚胺25000 Da (bPEI 25 k, 8.0 g)介绍了400毫升烧杯和溶解在超纯水(70毫升)。结果清晰的混合物搅拌在230 - 250°C,直到厚深棕色的糖浆。反应混合物冷却到rt,用超纯水稀释(35毫升),并与盐酸中和12 N获得的解决方案被广泛透析在一个密封的14 kDa MWCO袋对盐酸0.1 N (96 h,频繁更换透析媒介),和超纯水(24小时),透析袋的内容比0.22μm PES膜过滤(Millex)和冻干−50°C 24-36 h,产生一个棕色的吸湿蓬松粉(2.6 g)。CD进行表征新的CD悬浮液在1.5毫米(1.0毫克/毫升)准备氯化钠pH值7.4。CD水力直径和ζ-potential由动态光散射(DLS)和电泳光散射(ELS)使用Zetasizer NanoZS装置(莫尔文仪器)。测量进行了一式三份25°C和数据表示为(±SD)的意思。CDs的表面电荷密度是由聚电解质滴定,监测ζ-potential变异CD悬挂,沿着飙升的聚(丙烯酸)解决方案(PAA,兆瓦±1800哒,氯化钠1.5毫米pH值7.4),之前报道(维斯et al ., 2021 b)。结果表达μmol /毫克。光学性质的CD录音紫外和荧光光谱测定CD上准备,使用多模读者(Varioskan勒克斯,热费希尔科学、法国)。
细胞培养
THP-1细胞(tib - 202™,写明ATCC)是生长在rpmi - 1640培养基含有谷酰胺(2毫米),2-mercaptoethanol(0.05毫米),青霉素(100 UI /毫升),链霉素(100μg /毫升)和热灭活胎牛血清在37°C(10%) 5%的股份有限公司2从GIBCO湿室(所有文化试剂)。
细胞暴露在cd和药理抑制剂
细胞被播种在96 -或24-well文化板块的密度1×105或5×105细胞/好,分别和分化成巨噬细胞通过添加10 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate一夜之间(PMA、σ)培养基。分化成巨噬细胞后,细胞附着。分化细胞然后用磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)和孵化刚做好的光盘解决方案(3 - 100μg /毫升完全培养基)单独或与培养基(控制)为4 h (pyroptosis CD细胞吸收,细胞或组织蛋白酶B活动)或24 h(细胞生存能力或坏死,IL-1β释放,溶酶体肿胀或完整性)。在一些实验中,细胞被孵化caspase-1 (YVAD-CHO, 50μM,默克公司)或组织蛋白酶B (ca - 074我,10μM,恩佐生活)抑制剂1 h30 CD曝光之前在37°C。所有细胞反应进行了分析最后的CD潜伏期。
评估CD细胞吸收
荧光激活细胞分类(流式细胞仪)是用来评估CD被巨噬细胞吸收由于NPs的光学特性,如前所述(维斯et al ., 2021 b)。短暂接触后,cd(25μg /毫升)4 h,培养基被丢弃,细胞被胰蛋白酶处理冲洗两次PBS和收获。细胞悬浊液LSRFortessa X 20进行分析TM流式细胞分析仪,通过收集样品荧光(20000事件/样本)使用BV510(紫激光)通道。CD吸收被确定量化的平均荧光强度的变化(MFI) CD-treated细胞比未经处理的细胞。结果表示为CD-treated细胞的MFI比未经处理的细胞的小额信贷机构。
细胞生存能力
细胞MTT试验可行性评估。细胞治疗cd 24 h与PBS仔细洗前的MTT(100μL, 1.0毫克/毫升在完全培养基,σ)。1小时孵化后37°C,培养基被移除,细胞细胞溶解和二甲亚砜(100μL)和吸光度的样本是在570 nm和修正在690海里(Varioskan勒克斯多模读者,热科学)。细胞生存能力表示为CD-treated细胞的吸光度的比例相对于控制细胞的吸光度。
质膜完整性
质膜完整性评估通过测量释放乳酸deshydrogenase (LDH)文化上层清液的细胞暴露于cd 24 h,使用细胞毒性检测装备+(罗氏应用科学)。LDH活性测定根据制造商的说明和表示为上层清液的吸光度测量的褶皱变化CD-exposed细胞相对于上层清液的吸光度测量无细胞(控制)。
Caspase-1活动和Pyroptosis
Caspase-1活动和pyroptosis使用FAM-FLICA流式细胞仪测定®分析(Biorbyt)和低分子量DNA染色,propidium碘(BD生物科学)。在暴露于cd(25和100μg /毫升)4 h, PBS的细胞被洗,脱离胰岛素治疗和离心机的培养板。细胞被洗培养基,在无血清培养基resuspended包含10μL FAM-FLICA(290μL)®试剂(PBS稀释一至五)。1小时孵化后,每个样品洗前化验设备缓冲区流式细胞术分析。pyroptosis评估,propidium碘(1/100稀释)被添加到每个样本之前,流式细胞术分析。样品荧光(20000事件/样本)测量LSRFortessa×20™血细胞计数器(BD生物科学)由FACSDiva™软件(BD生物科学),使用FITC(λ前女友488海里,λ新兴市场530海里,FAM-FLICA®)和PE德州红色(λ前女友561海里,λ新兴市场610海里,propidium碘)通道。Caspase-1活动表示为FITC平均荧光强度的变化(MFI)细胞暴露于cd相比,控制细胞。Pyroptosis表示为double-positive细胞的百分比。
溶酶体肿胀
溶酶体肿胀被评估使用LysoTracker溶酶体标记流式细胞术®红色dnd - 99(分子探针)。24小时后暴露在CDs(25μg /毫升),这些细胞被洗PBS和孵化50 nM LysoTracker无血清培养基为30分钟37°C。最后孵化,PBS的细胞被洗,脱离文化板块的胰岛素治疗,离心机,resuspended无血清培养基(500μL)。样品荧光(20000事件/样本)进行了分析与励磁561 nm和信号检测在586 nm(体育频道,黄绿色激光)。溶酶体肿胀被表示为MFI变化的细胞暴露于cd相比,控制细胞。
溶酶体的完整性
中性红试验是用来评估变化的溶酶体完整性针对cd。细胞治疗cd(3 - 100μg /毫升)24 h与PBS仔细洗前的中性红(200μL 100μg /毫升溶液完全培养基,σ)。3 - h潜伏期后37°C,细胞上清液被除去,PBS的细胞被洗,之前添加中性红提取解决方案(200μL 1:1的水-乙醇溶液含有1%乙酸)20分钟。最终样品的吸光度测量在540 nm (Varioskan勒克斯多模读者,热科学)。结果表示为CD-treated细胞的吸光度的比例相对于控制细胞的吸光度。
组织蛋白酶B活动
量化了的活动组织蛋白酶B使用魔法红色荧光®分析(CliniSciences)。细胞治疗cd(25和100μg /毫升)4 h,洗PBS和孵化与组织蛋白酶B的基质1 h在37°C,根据制造商的指示。潜伏期结束时,这些细胞被洗与PBS和样品荧光测量在590 nm,激励在540 nm (Varioskan勒克斯多模读者,热科学)。结果表示为荧光强度的比值来衡量细胞暴露于cd相比强度以控制细胞。
IL-1β化验
Interleukin-1β(IL-1β)量化的上层清液中细胞孵化与cd(3 - 100μg /毫升)24小时的ELISA (Biotechne、法国)。试验是根据制造商的指示。在450 nm校正吸光度是读570海里(Varioskan勒克斯多模读者,热科学)。表达的细胞因子浓度pg / mL。
数据的统计分析
数据表示为均值±SEM和绘制条形图。量效曲线(细胞生存能力和溶酶体完整性)对数变换后得到的数据和符合希尔的方程,其斜率是用来计算半最大有效浓度(EC50)。统计组之间的差异决定的t以及或一个或双向方差分析(方差分析),后跟一个Dunnett或Sidak的测试,使用GraphPad Prism 6.0软件。数据被认为是明显不同p值小于0.05。
结果
CD特征,细胞向巨噬细胞吸收和毒性
CDs的特点提出了表1。CDs的意思是水动力直径9.9±0.5 nm和ζ-potential和电荷密度是5.5 + 32.4±1.3 mV和μmol /毫克,分别。,他们的最大荧光激发和发射波长在350年和460年,分别。因此,所使用的cd的体积小,与高电荷密度和阳离子电荷表现出内在的荧光性质。这些预期的特征是与之前的报道相一致(维斯et al ., 2021 b)。NPs一般涉及到他们的细胞毒性条目,我们首先研究cd的巨噬细胞用流式细胞仪,根据先前的研究Ronzani et al ., 2019;维斯et al ., 2021 b)。如图所示在图1一个,一个重要CD-associated荧光信号(p< 0.001)在巨噬细胞暴露在NPs(25μg /毫升)4 h,确认CD细胞内化。评估cd对巨噬细胞的细胞毒性,细胞暴露在浓度增加NPs 24 h, MTT试验和细胞生存能力评估。CD从3到100μg /毫升浓度是根据先前的研究风扇et al ., 2019;Ronzani et al ., 2019)。图1 b表明,CDs诱导浓度生存能力损失的EC50 17.82μg /毫升(CI95 15.04 -21.10μg /毫升)。生存能力损失是在CD 12浓度显著(p< 0.01)、25日(p< 0.001),50μg /毫升(p< 0.001)和100年μg /毫升(p< 0.001),达到c。95%, 50和100μg /毫升。进一步描述细胞死亡引起的cd,巨噬细胞细胞膜完整性评估通过测量细胞与LDH泄漏试验。如图所示在图1 c剂量依赖性细胞渗漏观察针对cd。这泄漏从而增加与减少细胞生存能力和并行统计学意义在12 (p< 0.001)、25日(p< 0.001),50μg /毫升(p< 0.001)和100年μg /毫升(p< 0.001)。因此,CDs调查所诱导巨噬细胞死亡。
表1。物理化学特征的cd。
图1。CD对巨噬细胞吸收和毒性。(一)CD被巨噬细胞吸收了流式细胞仪在细胞暴露在NPs(25μg /毫升)4 h。结果表示为褶皱相比荧光强度的变化来控制细胞暴露于培养基。它们意味着±SEMn= 3实验。统计组之间的差异取决于学生的学习任务。* * *p< 0.001。(B, C)对巨噬细胞细胞毒性的cd。细胞暴露于浓度增加cd(3 - 100μg /毫升),或单独培养基(控制)24 h,在细胞生存能力(B, MTT试验)和细胞膜渗漏(C, LDH测定)评估。结果表示为百分数(可行性)或褶皱变化(LDH释放)相对于控制。他们的平均±SEMn= 3 - 4实验。统计差异相比,控制由方差分析其次是Dunnett的测试。*p< 0.05,* *p< 0.01和* * *p< 0.001。
cd诱导巨噬细胞Pyroptosis
调查是否cd pyroptosis引发巨噬细胞细胞死亡,我们首先评估inflammasome激活的NPs主要通过测量两个标记的细胞通路,IL-1β释放和caspase-1激活。事实上,inflammasome pyroptosis的规范化途径中扮演着中心角色通过caspase-1激活导致IL-1β成熟和细胞膜渗漏由于孔隙的形成(Hachim et al ., 2020)。为此,巨噬细胞受到的NPs 4 (caspase-1)或24 h (IL-1β版本)。如图所示在图2一个、CD(3 - 100μg /毫升)诱导IL-1β浓度释放,这是在CD 12浓度显著(p< 0.05)、25日(p< 0.001),50μg /毫升(p< 0.001)和100年μg /毫升(p< 0.001)。,cd(25和100μg /毫升)触发caspase-1活动(增加3.9倍,p< 0.001和5.0倍,p分别为< 0.001),评估使用FAM-FLICA流式细胞术测定(图2 b)。提供进一步证据的巨噬细胞pyroptosis cd,细胞暴露在NPs(25和100μg /毫升)4 h双标签FAM-FLICA试剂和propidium碘化,同时测量caspase-1活动和膜完整性的损失。然后,双阳性细胞被确认为pyroptotic细胞流式细胞仪,如图所示的剂量25μg /毫升CDs图2 c。七十二和百分之七十八的巨噬细胞暴露于25和100μg /毫升cd分别是双阳性,百分之四控制文化(p< 0.001为CD剂量),建议由pyroptosis巨噬细胞死亡(图2 d)。证实这一假设,我们评估的影响caspase-1抑制巨噬细胞生存能力和膜完整性损失引起的cd(25和100μg /毫升),使用YVAD-CHO抑制剂。如图所示在图2,caspase-1抑制部分恢复细胞生存能力图2 e,p< 0.001 25μg /毫升)和降低膜渗漏、LDH释放(即可见一斑图2 f,p< 0.001 25μg /毫升p< 0.05 100μg /毫升)的巨噬细胞暴露于cd。
图2。cd诱导巨噬细胞pyroptosis。(A, B)Inflammasome激活。巨噬细胞暴露在cd(: 3 - 100μg /毫升;B: 25 100μg /毫升)或单独培养基(控制)前24和4 h IL-1β分泌(A, ELISA)和caspase-1活动(B,流式细胞仪)测量,分别。结果表示为绝对值(IL-1β分泌)或褶皱变化相对于控制(caspase-1活动)。他们的平均±SEMn= 3 - 5实验。统计差异相比,控制细胞由方差分析随后Dunnett的测试。*p< 0.05和* * *p< 0.001。(C, D)由pyroptosis巨噬细胞死亡。细胞暴露于cd(25和100μg /毫升CDs)或单独培养基(控制)4 h pyroptosis之前评估通过流式细胞术。(C)代表流式细胞术图表显示caspase-1活动作为propidium碘荧光的函数在控制和细胞治疗25μg /毫升cd。(D)Pyroptosis 25和100μg /毫升cd,表示为双阳性细胞百分比。数据的均值±SEMn= 3实验。统计差异相比,控制是由方差分析其次是Dunnett的测试。* * *p< 0.001。(E, F)在CD-induced caspase-1抑制巨噬细胞死亡的影响。细胞被孵化的caspase-1抑制剂YVAD-CHO(50μM)为1.5 h,然后暴露于cd(25 100μg /毫升)或单独培养基(控制)24小时前可行性和膜泄漏评估。结果表示为百分数(MTT测试)或褶皱变化(LDH泄漏)相对于控制。他们的平均±SEMn= 3 - 6实验。统计差异由川方差分析随后Sidak的测试。* * *p< 0.001,相比,细胞没有抑制剂预处理和CD曝光。$ $ $p< 0.001,相比没有CD细胞抑制剂预处理和曝光。#p< 0.05和# # #p< 0.001,相比与CD细胞没有抑制剂预处理和曝光。
巨噬细胞溶酶体介导CD-Induced Pyroptosis
最近,有人建议,溶酶体损伤和组织蛋白酶可以通过触发涉及pyroptosis inflammasome激活(王et al ., 2018)。因此,我们调查了CDs溶酶体完整性的影响。为此,巨噬细胞被孵化的NPs 4或24 h,评估和溶酶体的完整性和肿胀。如图所示在图3一、cd(3 - 100μg /毫升)浓度的方式减少巨噬细胞溶酶体的完整性,在浓度显著影响12 (p< 0.001)、25日(p< 0.001),50μg /毫升(p< 0.001)和100年μg /毫升(p< 0.001)和13.11的EC50μg /毫升(CI95 9.39 -18.49μg /毫升)。这EC50符合17.82的EC50μg /毫升MTT试验观察。这种溶酶体完整性的损失导致细胞内溶酶体肿胀,证明处理25μg /毫升使用溶酶体标记LysoTracker cd®红色dnd - 99 (图3 b)。这些数据表明,CDs引起溶酶体功能障碍。探讨组织蛋白酶的作用引起的巨噬细胞pyroptosis cd,我们评估组织蛋白酶B细胞暴露于NPs活动,以及组织蛋白酶B抑制的影响CD-induced inflammasome激活。如图所示在图3、巨噬细胞暴露于cd(25和100μg / ml, 4 h)导致组织蛋白酶B 2.3——2.9倍增加活动,分别为(图3 c,p< 0.001 CD剂量),和组织蛋白酶B抑制ca - 074我与IL-1β分泌显著下降(图3 d,p< 0.001 25μg /毫升p100年的< 0.05μg /毫升)。
图3。巨噬细胞溶酶体介导CD-induced pyroptosis。(A, B)cd引起溶酶体功能障碍。细胞暴露于cd(: 3 - 100μg /毫升;B: 25μg /毫升)或单独培养基(控制)24小时前溶酶体完整性评估(A,中性红试验)和肿胀(B, LysoTracker®红色dnd - 99染色)。结果表示为褶皱变化(溶酶体肿胀)或百分比(溶酶体完整性)相对于控制。他们的平均±SEMn= 3 - 6实验。统计差异相比,控制细胞由方差分析随后Dunnett的测试(一)或由t以及(B)。* *p< 0.01和* * *p< 0.001。(C)组织蛋白酶B活动后巨噬细胞暴露于cd。细胞暴露于cd(25或100μg /毫升)或培养基(控制)为4 h在组织蛋白酶B活动之前测量的神奇的红色®化验。均值±SEM的结果n= 3 - 6实验。统计区别控制细胞由方差分析随后Dunnett的测试。* * *p< 0.001。(D)组织蛋白酶B抑制效果CD-induced IL-1β分泌。细胞与ca - 074 pre-incubated我(10μM)或培养基仅为1.5 h,然后暴露于cd(25 100μg /毫升)或培养基仅24 h。均值±SEM的结果n= 3 - 5实验。统计差异由方差分析之后Sidak的测试。* * *p< 0.001,相比,细胞没有抑制剂预处理和CD曝光。美元p< 0.05,相比没有CD细胞抑制剂预处理和曝光。#p< 0.05和# # #p< 0.001,相比与CD细胞没有抑制剂预处理和曝光。
讨论
工程NPs与免疫细胞相互作用是一个重要的问题考虑的根本作用的免疫系统在宿主防御和许多疾病。因此,密切关注已在过去的几十年中NP免疫毒性。然而,NPs的机制和分子途径影响免疫细胞的生存能力和功能尚不清楚。在目前的研究中,我们调查了工程碳NPs对巨噬细胞的毒性机制关注pyroptosis,促炎症的程序性细胞死亡形式。我们表明,阳离子cd触发inflammasome-dependent pyroptosis巨噬细胞通过溶酶体功能障碍。
尽管cd正在迅速扩大纳米材料,他们的毒理学资料仍然了解甚少的由于大起始原料的多样性和合成协议,可用于制造这些NPs,从而导致cd与广泛的变量物理化学特征。研究探索cd与免疫细胞的相互作用尤为稀缺的文献。阴离子cd准备从甘油被证明是细胞毒性小鼠巨噬细胞(264.7原始细胞)和诱导炎性细胞因子(MIP-1α,MIP-1β和MIP-2)生产,但在相对较高的浓度(62.5 -500μg /毫升)(Lategan et al ., 2018)。在比较研究三种阴离子cd, NPs都不过非细胞毒性264.7原始细胞在1毫克/毫升(阿亚兹et al ., 2020)。阳离子和阴离子cd -400μg /毫升(6.25)由牛血清白蛋白和柠檬酸,分别在非细胞毒性264.7原始细胞400μg /毫升,但阳离子cd诱导TNF-α和il - 6分泌的增加从100年μg /毫升(乌斯曼et al ., 2020)。同样,cd显示净正电荷被报道更比带负电的毒性cd对培养的成纤维细胞(Havrdova et al ., 2016)。在我们这边,通过筛选大量cd、图书馆我们之前报道,阴离子cd准备从柠檬酸(3 - 200μg /毫升)不向THP-1-derived巨噬细胞细胞毒性,与阳离子cd (风扇et al ., 2019)。一起,这些研究表明,阳离子cd细胞毒性与阴离子的。因此,我们只对阳离子cd进行了本研究。然而,值得注意的我们以前证明阳离子电荷并不足以带来毒性cd和表面电荷密度,而不是ζ-potential的绝对值更相关的毒性描述符(风扇et al ., 2019;维斯et al ., 2021 b)。因此,我们选择在此阳离子电荷密度高的CD。我们因此证实阳离子cd对巨噬细胞的细胞毒性,在浓度低或等于50μg /毫升。这个观察工程NPs与文献一致,表明表面电荷影响NP生物相容性,以积极ζ-potential与毒理学风险,由于更大的破坏性影响阳离子NPs在细胞和/或溶酶体膜或更大的蛋白质形成电晕驱动NP细胞吸收(Mahmoudi et al ., 2011;Luyts et al ., 2013;Gatoo et al ., 2014)。在这方面,我们在此表明,阳离子cd被巨噬细胞内化与我们之前的协议报告(Ronzani et al ., 2019;维斯et al ., 2021 b)。我们没有评估CD细胞吸收机制在目前的工作,但我们之前报道,内化的阳离子电荷密度高的CD是通过网格蛋白的内吞作用的结果——而且caveolae-mediated途径,但也在某种程度上,吞噬作用和一些暧过程(维斯et al ., 2021 b)。这些吸收机制可能发生在本研究。CDs是否进入细胞通过受体介导机制,尤其是通过受体参与pyroptosis如toll样受体,但是未知的和值得调查。
NPs已被证明通过各种机制诱导细胞死亡包括自噬,ferroptosis、细胞凋亡和坏死(斯特恩et al ., 2012;Mohammadinejad et al ., 2019;郑et al ., 2021)。此外,各种各样的NPs,包括碳纳米管(默et al ., 2012;Svadlakova et al ., 2020),银(墨菲et al ., 2016)、聚合物(南帝et al ., 2021)或硅(桑德伯格et al ., 2012;此人et al ., 2014)已报告NPs激活NLRP3 inflammasome,表明NPs也可能触发细胞死亡pyroptosis通过规范化的途径。符合这一假说,参与inflammasome-dependent pyroptosis几个NPs在巨噬细胞的毒性已经证明(Reisetter et al ., 2011;Mirshafiee et al ., 2018;王et al ., 2020)。在他们一边,CDs已报告诱导肿瘤细胞自噬和细胞凋亡(Arkan et al ., 2018;亚太区et al ., 2020;焦et al ., 2020),但他们的能力来触发pyroptosis到目前为止还没有被调查。在目前的研究中,我们首次提供证据,inflammasome-dependent pyroptosis参与巨噬细胞死亡引起的阳离子cd。事实上,我们发现:1)caspase-1被激活和IL-1β分泌增加细胞暴露于cd后,2)巨噬细胞生存能力损失和inflammasome激活引起的cd与细胞膜渗漏pyroptosis的一个特点,3)抑制caspase-1显著恢复细胞巨噬细胞生存能力,同时限制泄漏。Pyroptosis可以通过激活介导的非规范途径caspase-4/5/11激活(Hachim et al ., 2020)。最近,caspase-3 pyroptosis激活与死亡有关的癌症细胞(Yu et al ., 2021)。cd能否诱导pyroptosis通过caspase-4/5/11或caspase-3激活还有待开发。
inflammasome之间已经建立了一个链接激活和溶酶体功能障碍,溶酶体损伤的关键作用和蛋白酶组织蛋白酶B释放(霍农et al ., 2008;Svadlakova et al ., 2020)。事实上,溶酶体固NPs是众所周知的细胞吸收后会导致溶酶体功能障碍(斯特恩et al ., 2012)。在目前的工作,我们发现增加组织蛋白酶B活动后巨噬细胞暴露于cd,和减少CD-induced IL-1β分泌组织蛋白酶B抑制剂的存在,表明溶酶体的作用CD-induced inflammasome激活,并可能由pyroptosis巨噬细胞死亡。这些数据是在协议与我们先前的观测,阳离子cd杂在巨噬细胞溶酶体内化,溶酶体中起着重要的作用的毒性影响NPs (Ronzani et al ., 2019)。在文献中,几个inflammasome激活机制以应对NPs已经提出,其中增加了活性氧的生产是最常见的描述(侯赛因et al ., 2009;Tschopp施罗德,2010;Zhang et al ., 2018;王et al ., 2019)。虽然我们没有测量氧化应激在目前的研究中,我们和其他人表明阳离子cd能诱导活性氧的生产(Havrdova et al ., 2016;Ronzani et al ., 2019)。因此,激活inflammasome pyroptosis cd可能会引起从组织蛋白酶B释放溶酶体完整性损失后,而且氧化应激。
由于其肿胀自然,pyroptosis导致促炎细胞因子的释放,如IL-1β和其他抑制,也称为alarmins (Cookson和布伦南,2001;Vande机器人瓦力Lamkanfi, 2016)。这些抑制帮助身体对抗外国攻击通过招募和/或激活免疫细胞和结构,启动或促进局部或全身性炎症。炎症构成中央病理过程中无数的疾病,pyroptosis被认为参与一些障碍,包括免疫和心血管疾病以及癌症(马et al ., 2018)。巨噬细胞pyroptosis针对cd可能因此导致在活的有机体内纳米材料的毒性,为硅NPs证明和心脏肥大或肝毒性(Zhang et al ., 2018;王et al ., 2022)。除此之外,考虑到其病理作用,pyroptosis被认为是一个潜在的治疗目标在一些疾病,特别是癌症(王et al ., 2021)。目前各种策略研究了诱导pyroptosis治疗癌症的目的。在这些策略中,纳米材料出现有吸引力(吴et al ., 2021)。因此,阳离子cd所描述在此能找到治疗癌症领域的应用。
结论
总之,我们在这里展示,阳离子电荷密度高的碳NPs诱导inflammasome-dependent pyroptosis巨噬细胞通过溶酶体功能障碍。拟议的机制CD-induced巨噬细胞pyroptosis包括CD内化和贩运到溶酶体,导致溶酶体膜完整性损失和溶酶体肿胀导致组织蛋白酶B释放。组织蛋白酶B反过来激活NLRP3 inflammasome,导致IL-1β释放,并通过caspase-1激活细胞肿胀(图4)。这些数据提供了新的视角与免疫系统相互作用的碳纳米粒子,特别是巨噬细胞在宿主防御中发挥核心作用。他们也带来有用的信息safe-by-design纳米材料的发展和使用这些纳米材料作为治疗癌症的治疗工具通过pyroptosis归纳。
图4。提出CD-induced巨噬细胞pyroptosis机制。溶酶体后巨噬细胞内化、cd杂。CD积累的细胞器改变膜完整性和引起溶酶体肿胀导致组织蛋白酶B释放。组织蛋白酶B反过来激活NLRP3 inflammasome,导致IL-1β释放并通过caspase-1激活细胞肿胀。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
作者的贡献
丫:碳点表征、生物调查和数据分析。先生:碳点的合成。我资金收购,碳点的合成和手稿的监督审查和编辑。CR:资金收购,研究监督,数据分析,数据准备,手稿审查和编辑。FP:资金收购,研究监督稿件写作。所有作者同意最后的手稿。
资金
这项工作得到了国家de la矫揉造作的(ANR-Grant号码:anr - 18 - ce34 - 0005 - 0 - 1)和跨学科主题研究所2021 - 2028项目的斯特拉斯堡大学科学研究所及Inserm (anr - 10国际防务展- 0002和anr - 20 - sfri - 0012)的框架InnoVec研究所。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
作者感谢克劳丁埃贝尔和穆里尔·科赫的帮助与流式细胞仪实验(血细胞计数平台、IGBMC斯特拉斯堡)。
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关键词:碳点,pyroptosis, caspase-1 inflammasome,溶酶体组织蛋白酶B,巨噬细胞
引用:Arezki Y,拉普米,Lebeau L, C和脑桥Ronzani F(2022)阳离子碳纳米颗粒诱导Inflammasome-Dependent Pyroptosis巨噬细胞通过溶酶体功能障碍。前面。Toxicol。4:925399。doi: 10.3389 / ftox.2022.925399
收到:2022年4月21日;接受:2022年6月20日;
发表:2022年7月19日。
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*通信:弗朗索瓦丝脑桥,pons@unistra.fr
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