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前面。Toxicol。2022年12月15日
秒。纳米毒理学
卷4 - 2022 | https://doi.org/10.3389/ftox.2022.1093765

编辑:纳米毒理学的方法和协议

哈拉尔德·f·克鲁格¹*和

卡佳nautica ²

¹NanoCASE GmbH，恩格尔堡，瑞士
²卡尔斯鲁厄理工学院，德国卡尔斯鲁厄

尽管对纳米级材料(胶体)毒理学的第一次研究是在近100年前进行的，但对纳米材料的研究数量的巨大增加只是始于在原子水平上对物质进行有针对性的操纵所引发的快感。因此，人们对这项技术背后的风险(Hoet et al.， 2004；斯特恩和麦克尼尔，2008年)．许多国家已经建立了国家或国际倡议或行动计划(参见美国2000年发起的国家纳米技术倡议[NNI]和欧盟委员会的报告纳米科学和纳米技术:2005-2009年欧洲行动计划，出版于2005年。所有这些倡议都包含以纳米材料的健康和环境影响为重点的资助项目。这种情况导致研究材料的数量急剧增加，以及关于这些材料的生物安全性的出版物(图1)．很明显，纳米材料在生物测试中会带来很多问题。这里要提到的是材料对测试本身的干扰(Wörle-Knirsch等，2006；Kroll等人，2012年；Guadagnini等人，2015)．此外，尽管名称通常是相同的(例如碳纳米管)，但使用的材料是非常不同的(例如，单壁，多壁，短或长纤维，刚性和刚性或柔性和纠缠)，这使得密集的表征是必要的，以便能够正确地分类结果(Warheit 2008；克里斯特等，2013年)．此外，已经在市场上很长一段时间的材料几乎没有被认为是“纳米材料”(例如，TiO₂、SiO₂但是，尽管这些产品已经注册为市场产品，如TiO，目前仍在讨论中₂．

图1

图1．有关“纳米毒理学”的刊物数目每在元数据库PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)．从2000年到2021年的每一年(横坐标)，在该数据库中以以下搜索配置文件搜索出版物:“所有领域”包含“纳米毒素*”或“富勒烯*和有毒*”或“纳米管*和有毒*”或“纳米颗粒*和有毒*”或“纳米*和有毒*”或“石墨烯和有毒”，其中星号为通配符。

鉴于纳米毒理学的大量出版物(2000年以来的> 60.000，见图1)，必须解决的关键问题是:为什么关于可能的生物效应的陈述仍有如此多的不确定性?为什么结果如此不一致?特别是在许多情况下，结果的可重复性非常弱，尽管这并不局限于纳米毒理学(2016年贝克,)．许多科学家对这种情况提出了批评(赫希等人，2011年；克鲁格,2014；彼得森等人，2014年)．其他人试图给出答案并提出建议，以提高可重复性(彼得森等人，2020年)，以提高整体学习质素(Fernández-Cruz等，2018)和“产生固有的公平”¹纳米安全数据支持纳米材料的有效治理和监管”(Jeliazkova等人，2021年)．在这方面，尽管有重大的资助计划和许多国家和国际项目，但仍有非常重要的需求尚未得到充分满足。这是因为科学界仍然缺乏被接受的统一协议。到目前为止，经合组织的一些化学品测试指南已适用于纳米材料，但在欧洲项目中建立和标准化的大量协议大多未用于许多实验室对纳米材料毒性的深入研究。事实上，欧洲有几项活动(例如马耳他倡议)²)以及有助于制定或调整经合组织纳米材料测试指南的项目(例如NANOHARMONY^3., Gov4Nano⁴, NANORIGO⁴, RiskGONE⁴)．德国项目DaNa收集了来自不同项目的标准操作程序(SOPs)和实验室协议，并在网上发布。在各种子类别中，如生物测试方法，物理化学性质，样品制备，人们可以下载标准操作规程和实验室协议pdf文件。此外，DaNa团队还建立了一个模板，其中包含用于创建sop的填充性帮助⁵．这一开创性活动现在得到了欧盟项目的补充，地平线2020项目巡逻队的网站上有一份SOP手册⁶．

为此，启动了项目活动，并出版了像本期这样的期刊特刊，以帮助改善这种情况。纳米材料及其潜在生物效应的研究通常始于在体外细胞毒性测定，如前所述，由于被测材料和测定成分之间的干扰，可能会产生误导(Wörle-Knirsch等，2006)．为了克服这些问题，Alamar蓝测定法被进一步开发，使其即使在高通量实验中也可以重复应用(Longhin等人。)．第二个例子是菌落形成效率测定。这种活性测定方法已经为高通量实验进行了优化，并且由于没有使用染料，因此实际上是无干扰的。此外，治疗时间可延长至10天，可视为亚慢性试验(Runden-Pran等人。)．作为下一步在体外毒性评价是氧化应激诱导毒性的重要途径。大多数情况下，这个终点是通过使用荧光染料DCF来分析的，但这种测定方法就像其他依赖荧光染料的测定系统一样容易出错(彼得森等人，2020年)．或者，可以执行更好、更可靠的分析通过核红系2相关因子2 (NRF2)转录因子控制下抗氧化酶的表达。一个世界性的联盟已经开发了一种用于测量NRF2介导的基因表达的报告基因测定方法，并对其进行了验证通过实验室内及实验室间轮Robins (马丁等人。)．虽然实验室内和实验室间结果的变异性相对较低，但很明显，表达诱导越高，实验室间的变异性就越高。

TiO的遗传毒性潜力₂最近已经(重新)评估，但仍在讨论中，这清楚地表明需要更好和更可靠的基因毒性测试。由于这是一种物质毒理学评价中最重要的终点，因此必须进一步发展现有的测定方法并建立新的可靠的试验方法。到目前为止，Comet检测一直被批评为容易出错和提供有偏差的结果(Rajapakse等人，2013；费拉罗等人，2016)．为了避免这些缺点，建立了一种改进的方案，考虑到细胞毒性和纳米颗粒被细胞摄取，并建立了明确的测试接受标准和考虑历史对照(El Yamani等人。)．使用这种方法将使在体外彗星分析在未来更加可靠。一项类似的研究已经为自己设定了一项任务，即对现有的协议进行调整在活的有机体内彗星试验(OECD试验指南489)，以便该方案也可用于纳米材料(Cardoso等人。)．另一组人设定了一个类似的目标。在这里，OECD测试指南490(胸苷激酶基因突变测试)适用于纳米材料的测试。此外，通过对现有方案的这些更改，谨慎地确保有明确的接受标准，并考虑到特定的纳米材料相关特性(Chen等。)．仍然希望这些对现有经合组织准则的调整能够被科学界接受，并尽快纳入官方议定书。纳米材料遗传毒性研究的结果往往是误导性的，因为没有区分初级和次级遗传毒性。然而，由于许多纳米材料可以诱导氧化应激或炎症过程，然后间接导致随后的DNA损伤，继发性DNA损伤往往被低估，纳米材料的整体遗传毒性被高估。为了更好地捕捉这种结果的变化，建立了一个共培养系统，可以很好地区分初级和次级遗传毒性(瓦拉巴尼和卡尔森)．以具有相应阳性对照的氧化镍纳米颗粒为例，研究表明所使用的细胞反应显著不同，人类支气管上皮细胞只显示继发性DNA损伤。该方案的另一个优点是通过流式细胞术分析微核，减少了可能的偏倚。总的来说，关于遗传毒性，本期特刊的文章提到了在研究纳米材料时，个别方法在不同步骤中的各种困难。因此，作为一种概述，本系列的另一篇文章一步一步精确地解决了这些问题，并给出了避免这些问题的明确建议(Elespuru等人。)．本文不批评以往研究的方法错误(什么是错误的)，但展示了本系列中的个别出版物如何以积极的建议解决关键点，以避免这些错误(什么是正确的)。本系列的最后一篇文章涵盖了一个更基本的方面:建立更现实的体系在体外测试系统。通过使用微流控无血清芯片细胞系统，可以证明动态条件可以更准确地反映组织反应(Gupta等人。)．在未来，这种微流体系统很可能包含多种细胞类型，可以代表整个器官，并可能有助于减少动物试验，并增加研究的意义在体外方法。