文章标题:转录分析有效性定义生物活性相似基于下一代在化妆品成分的安全评估
豪尔赫·m·Naciff
Yuquing k .山
王主任,- 宝洁公司,梅森,哦,美国
这项工作的目的是利用转录分析来评估结构相关的生物活性化学物质来定义生物相似,证实在方法可用在风险评估的有效性。两个案例研究介绍,一个4短烷基链防腐剂:甲基(MP)、乙(EP),丁(BP)和尼泊金丙酯(PP),以及他们的主要代谢物,羟基苯甲酸(pHBA)假设尼泊金丙酯目标化学;和第二个咖啡因及其主要代谢物茶碱,可可碱和paraxanthine CA化学是目标。HepG2的综合转录响应MCF7, A549和ICell心肌细胞接触后评估(TempO-Seq)车辆控制,每个尼泊金或pHBA, CA或其代谢产物,在3 non-cytotoxic浓度,差异表达基因6 h。(罗斯福≥0.05,褶皱变化±1.2≥)被确定为每个化学,在每个浓度,用于确定相似之处。每个化学物质能够引起一系列基因的表达变化,比控制。重要的是,每个转录资料引起的防腐剂高度相似性整个集团的股票。最多的基因通常影响butylparaben与PP之间。转录的防腐剂是类似于雌激素受体受体激动剂引起的,与英国石油(BP)在最近的结构和生物模拟页。在CA情况下,转录概要文件引起的所有四个methylxanthines高度相似的细胞类型,CA和茶碱是最活跃的。最健壮的响应得到最高的心肌细胞转录剖面相似性CA和TP。的转录概况methylxanthines类似于一个抑制剂引起的磷脂酰肌醇3-kinase以及其他激酶抑制剂。总的来说,我们的结果支持在精心设计的融合转录分析的方法在体外测试作为一个强大的数据支持生物相似性在驱动程序和加强传统的基于结构的方法用于风险评估。
介绍
保证安全的化妆品成分变得更具挑战性的化妆品成分的禁止动物实验,自2013年以来一直在化妆品指令(76/768 / EEC)。为了解决这些问题,Alexander-White et al。(2022)最近描述了框架执行新一代风险评估(NGRA)基于在使用化学性质(伸展),在网上毒理学和集成数据来源于新方法预测方法(南)更好的证实生物活性相似,相似,因此潜在毒性的化学物质被用于递交评估。两个案例研究描述这个框架的应用程序已经出版迄今为止,第一个使用防腐剂(韦德et al ., 2022)和第二个使用咖啡因(埋葬et al ., 2021)。新方法方法(南)数据包括转录分析数据从暴露培养细胞,作为一个关于化学的数据流,通知特定的生物活性,这工作地址使用的南流数据。递交的基本宗旨是特定的有毒的结果的外推(或缺乏)在活的有机体内从化学测试端点(源)类似的化学(目标)。一个健壮的递交评估需要演示的相似性不仅在物理化学性质,反应活性和新陈代谢(吴et al ., 2010)之间的化学物质用于伸展,而且在它们的生物活性。
收集信息来定义源和目标的生物活性化学确定两种化学物质的行为是至关重要的通过相同的行动模式,从而构成类似的风险在活的有机体内。基因表达的变化是一个集成的一部分生理反应化学暴露一个活的有机体和这些变化代表响应这种化学物质的生物活性靶器官,这可能结束在一个负面的结果取决于暴露的浓度和时间。识别基因表达变化引起的特定化学物质接触,使分子事件的识别和细胞通路受到这样的接触,可能会导致不良结果(De Abrew et al ., 2016;利希滕斯坦et al ., 2020;陈et al ., 2021)。这部分转录响应可以通过培养细胞也表现出,代表靶器官(Naciff et al ., 2016;De Abrew et al ., 2019;Alarcan et al ., 2022),这些信息提供了机会,确定与一个特定的化学相关的生物活性,并定义其模式的行动。比较基因表达变化引起的结构相关的化学物质将证实伸展的生物学基础。我们(De Abrew et al ., 2015;De Abrew et al ., 2016;Naciff et al ., 2016;De Abrew et al ., 2019)和(服饰业et al ., 2015;Rempel et al ., 2015;Yeakley et al ., 2017;Peshdary et al ., 2021;埃舍尔et al ., 2022)已经开始试验和令人鼓舞的结果在这个方向。例如,我们(De Abrew et al ., 2019)转录分析识别生物类似的化学物质用于m-ethyl苯酚和4-chloro-1 3-diaminobenzene,识别间甲酚的最近的生物模拟m-ethyl苯酚;尽管4-chloro-2-methylaniline盐酸盐和2-chloro-1,硫酸4-diaminobenzene 4-chloro-1最近的生物类似物,3-diaminobenzene。Peshdary et al。(2021)使用转录分析探讨异同双酚A (BPA)和三个类似物,双酚S (BPS)、双酚F(带通滤波器)和3,3′,5、5′-tetrabromobisphenol在人类胚胎干细胞线H9 (WA09)。Peshdary等人认为BPA、带通滤波器和基点也有类似的效能在诱导转录变化和扰乱许多相同的通路,而TBBPA至少在结构上类似的双酚a组和低得多的力量。埃舍尔et al。(2022)使用转录分析来确定生物相似性十三结构相似的支链脂肪族羧酸和确定最接近的类似物中最相似的转录资料共享HepG2细胞,而这些是2-propylheptanoic酸(2-PHP) 2-Ethylheptanoic酸,2-propylhexanoic酸,2-ethylhexanoic酸和丙戊酸(VPA)和VPA 2-PHP在这一组的两个最强大的类似物。
在本文中,我们使用转录剖析体外系统读出来确定相关的生物活性与特定组相关的化学物质,证实化学丰富的安全数据的适用性和支持一个伸展的评估目标化学。提出了两个案例研究:第一个4线性链n-alkyl苯甲酸酯,尼泊金丙酯(PP)是目标化学,而甲基- (MP)、乙(EP),和butylparaben (BP)是合适的结构类似物,以及这些防腐剂的主要代谢物羟基苯甲酸(pHBA)。第二个病例是与咖啡因(CA)是其主要代谢产物的化学和三个目标茶碱(TP),可可碱(结核)和paraxanthine (PX)作为合适的结构类似物。每个目标的表示结构类似物化学被专家判断后确定评估的过程类似物用于结构与活性关系(SAR)所描述的吴et al。(2010)。尽管每个目标化学有一个健壮的安全数据集来自动物实验进行测试禁令之前,假设是有数据差距为目标化学的案例研究。数据差异选择页是生殖和发育毒性和CA是其系统性毒性。因此,使用培养细胞的转录分析的目的是为这些端点识别潜在的问题,为每个目标化学、同时,识别相似的生物化学RXA和填充适当的数据差异。
在这项研究中,每个模拟的转录概况为每个案例研究是评价四个细胞类型:MCF7, HepG2, A549和iCell心肌细胞,而本案例研究的目标。这种比较是用来确定套结构相关的生物活性化学物质是否具有可比性。我们的研究结果清楚地表明,转录概况了防腐剂的每个股票整个小组成员高度的相似性,相似性最高的英国石油(BP)与PP之间。类似的结果在CA及其代谢物,在每个methylxanthine的转录形象有很大的一致性,转录剖面相似性最高的CA和TP。转录的通路富集分析(MSigDB v7.4)概要文件为每个化学在这两种情况下的研究表明显著重叠的监管途径被转录概况的分析,和抑制基因在两种化学组,相似性最高的PP和BP,分别和CA和TP,支持跨组中阅读的有效性,是BT和TP最近的结构和生物模拟PP和CA,分别。总的来说,我们的研究结果支持使用chemical-sensitive培养细胞中转录分析定义化学类的生物活性和更好地定义化学模拟,从而增加他们的信心在伸展的方法通过加强传统的基于结构的方法用于风险评估。
方法
化学药品和试剂
尼泊金丙酯(CAS # 94-13-3), methylparaben (CAS # 99-76-3),羟苯乙酯(CAS # 120-47-8), butylparaben (CAS # 94-26-8)羟基苯甲酸(CAS # 99-96-7),咖啡因(CAS # 58-08-2),茶碱(CAS # 58-55-9),可可碱(CAS # 83-67-0), paraxanthine (CAS # 611-59-6), trichostatin (CAS # 58880-19-6), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(CAS # 298-93-1)和二甲亚砜(67-68-5)都获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。
浓度和时间点的选择
对于每个化学测试在这个案例研究中,细胞毒性评估进行细胞株的实验中使用(例如MCF7, HepG2或A549细胞)使用这些化学物质的浓度增加浓度,导致一些毒性,但不超过10%的细胞毒性3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium显示试验(MTT)Mosmann (1983)。在我们的经验中,任何给定的细胞毒性效应的化学可以决定在任何显示细胞,这些细胞不会显示一个特定的细胞毒性敏感性影响彼此之间的相比。每个化学物质引起的最高浓度不超过10%的细胞毒性,决定在这个初步的实验中,被选为最高浓度(D1)来评估每个4细胞系:MCF7, HepG2, A549细胞(来自美国类型文化集合,写明ATCC),和iCell心肌细胞(从富士胶片/细胞动力学)。确定转录概况与接触化学,每个单元格行接受D1和两个稀释D1 (D2和D3),总共3浓度为每一个化学对于每个细胞株(表1和3相比)和适当的控制(细胞系接受合适的车辆,浓度二甲亚砜(DMSO)。DMSO溶液的浓度为0.1%,保持常数在不同化学物质和细胞评估,包括车辆控制。防腐剂的案例研究,应对每个化学评估1,50和500μM;在methylxanthines案例研究中,应对每一个化学均在50岁,500年和1000年μM。对于每一个化学和细胞类型评估4生物复制品生成。
表1。许多基因的表达明显(罗斯福< 0.05,FC±1.2)修改MP (CAS # 99-76-3), EP (CAS # 120-47-8),英国石油公司(CAS # 94-26-8)和PP (CAS # 94-13-3),以及这些防腐剂的主要代谢物,pHBA (CAS # 99-96-7),每一个细胞类型的评估。
每个化学的曝光时间和所有4细胞系是6 h。这一次已被选为了获得签名直接相关的作用机制(分子启动事件,米氏)的化学评价和保持一致性与早期实验(羔羊et al ., 2006;De Abrew et al ., 2016;De Abrew et al ., 2019)。其他研究显示使用早期反应基因预测毒理学的重要性(Zhang et al ., 2014)。这个时间点还发现比以后更丰富点羊肉et al。(2006)。因此,完整的细胞溶解产物6 h后得到的接触化学或适当的车辆(控制)转录分析,使用推荐的裂解缓冲BioSpyder (TempO-seq平台的提供者)。在每个试验中,每个细胞类型也暴露于0.1μM Trichostatin,作为积极的控制。
基因表达分析
转录反应的接触每个化学评估4细胞系:MCF-7, A549, HepG2 iCell心肌细胞培养使用推荐的文化协议和试剂(写明ATCC或富士胶片/细胞动力学,分别)。每个细胞类型显示一个特定表型的代表目标器官,包括endocrine-responsive (MCF-7) liver-derived (HepG2) lung-derived (A549)和一个电活性细胞类型(iCell心肌细胞)和终末分化。使用这四个细胞类型允许更广泛的“生物覆盖”确定的潜在影响基因表达任何给定化学被评估。细胞被播种在96孔板和3个浓度处理的每个化学或车辆(DMSO) 6 h。治疗被随机分配在板以减少批量效应和分发使用安德鲁系统1000 g液体处理机器人(Andrew联盟,沃尔瑟姆,MA)。后6 h治疗,细胞溶解产物收获Biospyder提供的根据协议(TempO-Seq Workflow-BioSpyder),然后储存在−80°C到分析。每个实验在4生物副本执行,每个复制的细胞治疗和收获在分开的日子里,为了更好地代表4生物复制品。细胞溶解产物盘子被冻结运往BioSpyder (BioSpyder Technologies, Inc .,卡尔斯巴德,CA)和Tempo-Seq人类全转录组(2.0版)测定在BioSpyder如前所述(Yeakley et al ., 2017)。
完整的基因表达数据存入国家生物技术信息中心基因表达综合(GEO) (埃德加et al ., 2002),可通过地理系列加入GSE218902数量。
基因表达数据分析
转录分析数据,包括Log2转换基因表达数据,获得适当的BioSpyder提供的原始数据。FASTQ Illumina公司标准测序仪器软件的文件由供应商提供。每个FASTQ文件由供应商使用领结对齐算法来生成一个计数表,每一列代表一个样本,每一行代表一个基因。伯爵表生成的每个细胞株用于基因表达分析使用DESeq2 v1.30.0 (爱et al ., 2014)包在R软件(v4.0.3)。探测器计数的5或更多在至少3样本保存在前置过滤步骤。DESeq2缺省参数估计用于标准化和规模因素。负二项模型用于计算差异表达基因(度)相比,车辆控制。折叠收缩为每个应用浓度变化与相关控制计算主持L2FC值为每个调查。探针与调整p价值(罗斯福)≤0.05被认为是差异表达。100年最最小,下调基因p每个化学治疗引起的值(浓度比控制在每个细胞株)被选为基因签名查询连接地图城市规划机构(cMAP)的数据库。
基因本体论和规范化路径分析
基因本体论(去)和规范度的途径进行了分析的分子签名数据库(MSigDB版本7.1)的基因集富集分析(GSEA)网站(http://www.gsea-msigdb.org)(萨勃拉曼尼亚et al ., 2005)。分离的上调和下调度确定化学物质接触后被用来评估哪些途径影响每个使用MsigDB化学。在这种情况下,每个转录概况评估使用标志下的50组基因基因集(H)使用适当的人类基因符号为每个基因正在查询。浓缩的条件、KEGG通路和Reactome途径被认为是显著的罗斯福q值小于0.05时,至少5 -或衰减基因通路的一部分。
连接地图城市规划机构(cMAP)的分析
为了识别相似的生物活性在不同化学物质评估在不同的细胞系,我们使用了提出方法,最初所描述的羊肉et al。(2006)和基于网络的细胞更新图书馆签名(距离;萨勃拉曼尼亚et al ., 2017)数据库使用线索试金石1.1.1.43 ((clue.io))数据库。这种方法允许验证转录分析数据以及发现的化学物质之间的联系已经被评估和化学品评估使用模式匹配识别他们的表达谱。这个数据库包括8969研究和注释的小分子化合物和基因试剂测试在9个人类细胞系。原始数据预处理后,从每个化学log2基因表达数据,在每个浓度,用于计算每个基因评估和叠化的表达是受每个化学处理对平均控制相应的批处理。每个基因的叠化是用于生产化学的基因表达谱或签名的评价(在每个浓度测试)在原始描述使用标准的方法提出论文(羔羊肉,et al ., 2006)。为每个化学生成签名(单独为每个浓度),两个示例t以及配对的测试实例运行在相同的批处理使用Limma软件(史密斯,2005;Wettenhall et al ., 2008)。5%的错误发现率(罗斯福)截止用于生成差异(积极的叠化)和衰减(负叠化)签名。这基因表达特征的化学物质产生了巨大的基因表达变化(在任何浓度),结合两个上调和下调基因表达变化,提出数据库中与每个签名代表广泛的研究所((clue.io))和得分确定签名之间的相似程度,评价和化学物质的“匹配”签名确认的数据基础。信心的连通性分数提供了三个措施:1)一个名义p价值派生通过比较之间的相似性查询和参考签名,使用Kolmogorov-Smirnov浓缩统计(萨勃拉曼尼亚et al ., 2005),一个空的分布随机查询;2)一个错误发现率(罗斯福)调整p值占多重假设检验;3)τ(τ),比较观察浓缩分数所有其他数据库。提出分数范围从+ 100,代表两种化学物质之间的相似的基因表达特征相比,100−代表相反的签名。这个分析的前提是,转录签名相似度高的城市规划机构(cMAP分数接近+ 100)代表类似的生物活性。我们也比较了转录反应的活性化学物质从这个案例研究中,我们评估以及其他化学物质在我们的实验室(De Abrew et al ., 2019)。
结果
苯甲酸脂类
数量的基因的转录反应是影响接触MP, EP, BP和PP、以及它的主要代谢物pHBA,每个浓度的测试,在每一个细胞系的评估,和一个罗斯福≤0.05,所示表1。每个防腐剂引起一系列基因的表达变化,控制相比,特别是在最高浓度测试。最健壮的和一致的反应是观察MCF7细胞(图1)。自500年MCF7细胞的转录响应μM BP太强烈(判断基因影响的数量),而其他三苯甲酸酯(表1),为了更好地可视化整个集团的相似之处,图1细胞的反应到50μM包括英国石油公司和细胞的反应相比其他防腐剂的浓度最高。每个转录概要文件引起的防腐剂股票高度的相似性整个集团的化学物质。比较MCF7细胞的反应,导致133年的识别常见的基因的表达是修改每个防腐剂以显著的方式在同一个方向。pHBA共享只有17基因与组。比较转录响应每个尼泊金,在最高浓度测试(500μM),与PP的响应我们确定最多的基因通常影响防腐剂被发现之间的BP和PP、受影响的634个基因在同一方向的PP和英国石油,其中319个基因的表达上调在315个基因的表达下调。做同样的比较使用百分比的基因通常影响接触人民党和其他防腐剂,相似度最高的PP和英国石油公司之间的响应也,有36%的常见基因受到这两种防腐剂。响应议员和页之间的重叠是20%,而ET与PP之间24%。
图1。基因表达谱引起的MP, EP, BP和PP、以及这些防腐剂的主要代谢物,pHBA(最高浓度测试,500μM,除了BP,显示50μM反应)在MCF-7细胞。基因显示一个健壮的响应在暴露于每个尼泊金(罗斯福<至少0.05和1.2折变化,(或衰减)这张图所示。每个细胞都代表一个不同颜色的矩形的颜色显示表达式的值(褶皱变化)的影响(白色),差异(红色)或衰减(蓝色)的基因。层次聚类是基于量效和定位,建立了根据这些基因的相似性在回应每个尼泊金评估。线的长度在树上显示每个基因的相似性在监管模式,用较短的长度表示更多的相似之处。
转录的通路富集分析(MSigDB v7.5.1)概要文件为每个尼泊金表示明显重叠的监管途径四个防腐剂。为此分析了上调和下调基因集分别进行了分析。前个人途径影响接触BP和PP MCF7细胞所示表2。顶部标志受基因的表达上调的途径这两个防腐剂:雌激素响应早期和晚期,并通过NFKB TNFA信号。而顶部标志通路所受的表达下调基因的BP和PP: G2M检查点,胆汁酸代谢和刺猬信号。这些途径也富含个人组基因受到英国石油公司(50或500μM)或页被用于分析。
表2。通路富集分析使用转录概要文件中标识MCF-7细胞暴露在500μM BP和PP。这个分析的分子签名数据库(MSigDB v7.5.1)是利用,而且只有排名靠前的基因集富集鉴定或抑制基因表达的上调(罗斯福< 0.05,褶皱变化为1.2 >),英国石油公司和PP(常见的基因影响在同一方向)如表所示。
相似的生物活性在四个防腐剂也提出分析所示使用最健壮的响应基因识别MCF-7细胞暴露在MP, EP,英国石油(BP)或聚丙烯(最高浓度测试,500μM)的线索试金石数据库1.0 (图2)。这种相似性之间并不存在任何尼泊金及其代谢物pHBA。转录概要文件引起每个尼泊金非常类似于引发的化学物质作为雌激素受体受体激动剂(即雌二醇、苯甲酸雌二醇和雌素酮)。
图2。使用最健壮的响应基因连接图分析中确定MCF-7细胞暴露在MP, EP, BP和页(在最高浓度测试,500μM)的线索试金石数据库1.0。基因表现最强劲的反应在暴露于每个化学(前100——或衰减与最小的基因p值)被用于提出分析。只有前40名化学物质识别Broad研究所的线索试金石数据基地,与每个记录剖面相似化学(积极的连接)。多次相同的化学可以列出(即雌二醇),从个人记录剖面得到在不同的细胞类型,或浓度。固体蓝色块在“类型”列表示连接到显示类的化学物质(例如雌激素受体受体激动剂)。
Methylxanthines
重要基因的数量(罗斯福≤0.05)的转录反应是影响接触CA、结核病、TP或PX,在每个浓度的测试,在每一个细胞系的评估,所示表3。所有的细胞类型评估每个methylxanthine回应,显示重要的多种基因的表达变化,控制相比,特别是在最高浓度测试(图3)。CA和TP似乎是最活跃的,健壮的和一致的响应四个细胞类型。比较转录反应在四个细胞类型,心肌细胞的反应是最类似的CA和TP之间,有604个基因的影响这两个methylxanthines在同一个方向。有趣的是,大部分的基因的表达受到CA和TP都上调(545个基因),同样的结果也决定转录形象引起CA或TP的四个细胞暴露于这些methylxanthines,超过了下调基因表达的上调基因。比较心肌细胞的反应和四个methylxanthines基于百分比的基因通常影响曝光,相似度最高的反应也是TP和CA之间,有61.8%的常见基因的转录反应是影响由methylxanthines方向相同。
表3。许多基因的表达明显(罗斯福< 0.05,FC±1.2) (CAS # 58-08-2),结核(83-67-0),TP (CAS # 58-55-9)或PX (CAS # 611-59-6)在每一个细胞类型的评估。
图3。基因表达谱的iCell-Cardiomyocytes CA, TP, PX或者结核病(1000μM)。基因显示一个健壮的响应在暴露于每个methylxanthine(罗斯福<至少0.05和1.2折变化,(或衰减)这张图所示。每个细胞都代表一个不同颜色的矩形的颜色显示表达式的值(褶皱变化)的影响(白色),差异(红色)或衰减(蓝色)的基因。层次聚类和定位,建立了根据这些基因的相似的反应化学评估。线的长度在树上显示每个基因的相似性在监管模式,用较短的长度表示更多的相似之处。
表达的上调和下调基因集确定为每个methylxanthines分别用于通路富集分析(MSigDB v7.5.1)来识别途径,尤其受到每一组基因的影响。这个分析是独立完成每个methylxanthine的基因集,以及基因的集合通常受到CA和TP的影响。时常见的一组基因的表达受到CA和TP用于通路富集分析,发现生物活性最高的相似性之间的个人反应CA或TP (表4)。顶部标志途径最受基因上调在心肌细胞是:这两个methylxanthines TNFA信号通过NFKB、缺氧、紫外线反应和有丝分裂纺锤体,而监管最严格的通路基因下调:E2F目标、DNA修复、细胞凋亡和干扰素γ的回应。
表4。通路富集分析使用转录概要文件确定了心肌细胞暴露于CA或TP 1000单独μM)或CA和TP B)。这种分析的分子签名数据库(MSigDB v7.5.1)是利用,而且只有排名靠前的基因集富集鉴定或抑制基因表达的上调(罗斯福< 0.05,褶皱变化为1.2 >)为CA或TP,单独或CA和TP(常见的基因影响在同一方向)如表所示。
提出分析、转录每个概要文件引起的methylxanthines MCF-7细胞以及心肌细胞的使用。提出分析4 methylxanthines MCF-7细胞组数据(图4一)表明,这些数据似乎比心肌细胞的数据更好的连接(图4 b),这可能是由于心肌细胞在线索并不代表数据库而MCF-7细胞。相似的生物活性在四个methylxanthines所示连接使用最健壮的地图分析响应基因识别MCF-7细胞或心肌细胞暴露在TP, PX或者结核病(最高浓度测试,1000μM)的线索试金石数据库1.0 (图4)。基于连通性的结果,很明显,转录形象引起每个methylxanthine彼此间相似,然而CA之间的相似性最高,TP。转录响应CA和TP在MCF-7细胞(图4一)或心肌细胞(图4 b)非常类似于一个化学物质作为抑制剂引起的PI3K和mTOR通路,以及atp酶和抑制剂的核因子kappa-B激酶抑制剂(IKK)。
图4。使用最健壮的响应基因连接图分析中确定MCF-7细胞(一)或心肌细胞(B)暴露在CA, TP, PX或者结核病(最高浓度测试,1000μM)的线索试金石数据库1.0。基因表现最强劲的反应在暴露于每个化学(前100——或衰减与最小的基因p值)被用于提出分析。只有前40名化学物质识别Broad研究所的线索试金石数据基地,与每个记录剖面相似化学(积极的连接)。多次相同的化学可以列出(即渥曼青霉素),从个人记录剖面得到在不同的细胞类型,或浓度。
讨论
传统递交评估是基于化学物质具有相似结构的前提下将有类似的反应活性,因此也有类似的生物活性或代谢的活跃的中间。已经完成了大量的工作来识别传达的化学特性模拟的适用性,包括结构、代谢、反应性和物理化学性质(例如,吴et al ., 2010;莱斯特严,2021)。然而,即使所有这些特性被认为是选择最佳人选(s)伸展,相似的生物活性的化学已被证实。有多个实例,实验数据表明,相似的化合物不与目标交互高分子(s)以相似的方式,从而显示生物活性的差异(马丁et al ., 2002;RedžepovićFurtula, 2022)。不同的方法已经被提出了展示类似的生物活性,与转录组分析显示巨大的潜力(De Abrew et al ., 2016;De Abrew et al ., 2019;Harrill et al ., 2021)。综合转录概况与接触敏感的细胞类型的化学物质被认为是伸展可用于定义其生物活性,确定行动的模式用来造成潜在的不良事件,从而有助于区分类似物来支持伸出最相似。在这项研究中我们已经证实使用转录分析的价值来确定生物类似的化学物质在一组可用的一组递交评估两个不相关的化学物质:四个短烷基链防腐剂和咖啡因和三个主要代谢物。
短烷基链防腐剂的案例研究
案例研究的目的,我们假设有数据差异页关于生殖和发育毒性。这个案例研究的完整描述最近发布的(韦德et al ., 2022)。一个类别的方法也可用于评估,定义页作为目标化学和MP, EP和英国石油公司认定为最相关的结构类似物的阅读。在我们的评估中,我们包括pHBA因为它是主要的和后四苯甲酸酯酯水解的主要代谢物的启发,可以参与这些短烷基链苯甲酸酯的生物活性。目标是利用转录分析证明生物活性之间的相似性防腐剂的类别成员和决定哪些是最适合模拟阅读在目标页的评估。每个防腐剂引起一系列基因的表达变化,比控制,特别是在最高浓度测试,这对每个转录形象是独一无二的防腐剂;但是有一个共同的基因的表达被修改的四防腐剂评估。通过研究基因的表达显著受到每个防腐剂,作为力量的结果,可以得出结论,苯甲酸酯表现出一种可预测的力量趋势观察跨类别成员的影响随着烷基链长度:议员< EP <页<英国石油公司。重要的是,每个转录资料引起的防腐剂测试这里股票类别成员高度的相似之处。我们确定了133个基因的表达每一个被修改的防腐剂以显著的方式在同一个方向。pHBA引起显著的基因表达变化在最高浓度评估,然而,这些变化是大多数不同引起的任何防腐剂。pHBA转录概要只股票17基因和转录响应四个防腐剂评估。 The highest number of genes commonly affected by the parabens was found between BP and PP, where 634 genes were affected in the same direction. The analysis of the transcriptional response of the MCF7 cells to MP, EP or BP to the one elicited by PP, at the same concentrations, on the bases of percent of overlap also supports our conclusion that the highest similarity in the transcriptional response is between BP and PP.
确定最相关的生物活性的防腐剂的案例研究中,通路富集的转录概况进行分析。的通路富集分析转录概况为每个尼泊金表示显著重叠的监管途径通过上调或下调基因在四苯甲酸酯。这种分析提供了强有力的证据一致性的生物活性短烷基链防腐剂和类似的潜在作用方式。最高程度的相似性之间的通路水平被发现BP和PP、顶部标志途径最受上调基因这两种防腐剂:雌激素响应早期和晚期,TNFalpha信号通过NFKB IL2-STAT5-signaling。而顶部标志途径最受抑制基因:顶端连接,信号,肌细胞生成和刺猬信号。这些通路的相似性进一步支持这样的结论:这两种防腐剂是最类似的结构和生物当中唯一的类似物,因此来自英国石油公司的数据可以用来在和填补的数据差异pp .提出分析转录响应的PP和英国石油公司还指出这些防腐剂对雌激素的反应后,特别是指向一个雌激素受体激动剂的活动。通路富集分析,提出结果表明,苯甲酸酯,尤其是在高浓度时,可能有能力影响雌激素通路通过修改与这个途径相关基因的表达,从而有可能修改雌激素的反应。结果与先前的报道是一致的,表明MP, EP, PP和BP具有弱的雌激素活性在体外(劳特利奇et al ., 1998)以及在活的有机体内(劳特利奇et al ., 1998;Hossani et al ., 2000;Lemini et al ., 2003;Lemini et al ., 2004)。结果从一个在活的有机体内试验建立了作为一个可靠的方法来确定雌激素活性化学物质的问题,老鼠uterotrophic试验,表明在大多数议员,EP和BP具有弱的雌激素活性在活的有机体内(劳特利奇et al ., 1998;Hossaini et al ., 2000;Lemini et al ., 2004);而在同一页不显示雌激素的活动在活的有机体内分析,即使在剂量高达1000毫克/公斤/天(Sivaraman et al ., 2018)。劳特利奇et al。(1998)测试MP, EP, PP、英国石油以及pHBA在体外重组酵母雌激素屏幕和确定这些防腐剂在这个试验弱阳性,与英国石油(BP)的相对力量>页> EP > MP,而pHBA没有活动。必须强调的在体外重组酵母雌激素屏幕所使用的试验劳特利奇et al。(1998)防腐剂的效能是几个订单大小低于内生自然激素17β-estradiol,议员如下面大约2500000倍。这个结果也表明,PP不如英国石油和生物活性,使用BP数据填写空白页的最后风险评估,没有细化的力量估计,将导致PP的相对保守的评估。
咖啡因及其代谢物的案例研究
CA的情况及其主要代谢物,TP, PX和结核病,假设是有系统性毒性数据差异CA和目标是确定其主要代谢产物是最合适的生物模拟可以用来阅读在高的信心。每个methylxanthines能够引起一系列基因的表达变化在暴露的细胞,与车辆控制治疗,特别是在最高浓度测试。然而,TP和CA集团是最活跃的细胞类型评价,心肌细胞对这些methylxanthines是非常敏感的。此外,转录形象引起CA和TP在心肌细胞股票高度的相似性,545个基因是上调至59被这两个methylxanthines衰减。CA和TP的转录概况评估在人类原发性肝细胞,在不同的时间点和浓度,作为日本的一部分Toxicogenomics项目财团(TGP)工作(Igarashi et al ., 2015),这些数据可用于分析(开放TG-GATEs;可以从http://toxico.nibio.go.jp/english/index.html)。然而,三峡工程下的CA和TP浓度测试程序高于我们评估的浓度,并与我们的数据直接比较是不可能的。然而,这些数据的分析比较主要的转录反应人类肝细胞CA(7500μM)和TP(10000μM) 8 h后暴露在响应中清楚地表明一个健壮的重叠。这些相似之处进一步支持我们的结论TP是生物相关模拟阅读在CA评估。
通路的基因集富集分析确定是容易修改其表达式曝光后心肌细胞CA和TP,表明这些methylxanthines TNFA信号有可能上调通过NFKB通路,缺氧和紫外线反应,以及各种激酶调控途径(即p53、喀斯特、Pi3K-AKT-MTOR)等等。提出分析还表明修改PI3K的潜力,IKK, MTOR通路以及atp酶活性,主要作为抑制剂。多个作者的研究表明,methylxanthines行动通过不同的机制,主要包括purinergic P1受体拮抗作用、腺苷A1受体和负责(弗雷德霍姆et al ., 1999)。茶碱自1937年以来一直应用于临床治疗呼吸道疾病包括哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。然而,在大多数治疗指南,黄嘌呤现在已经委托三线治疗,因为他们的治疗窗窄,药物之间的相互作用的倾向。然而,低于常规剂量的TP认为是支气管扩张剂目前已知有抗炎的行为与呼吸道疾病的治疗。TP的作用的分子机制并不清楚,但已经提出几个潜在的目标包括无选择性抑制磷酸二酯酶,抑制磷酸肌醇3-kinase (PI3K)、腺苷受体拮抗和增加特定组蛋白去乙酰酶抑制剂的活动。表明,我们提出的分析清楚地表明,转录概要文件引起的四个methylxanthines评估具有较高的相似性引起的已知PI3K和mTOR如渥曼青霉素、西罗莫司,torin1和2,等等,以及与igf - 1抑制剂如linsitinib bms - 754807和bms - 536924 (图4)。它已经建立,所有methylxanthines与腺苷酸受体相互作用,作为大众化的拮抗剂1,一个2,一个2 b和一个3腺苷受体,然而,大部分的影响似乎依赖于与一个交互1和一个2腺苷酸受体(Yasui et al ., 2000)。然而,在我们提出分析没有发现连接与化学物质与腺苷酸受体相互作用,即使有一些腺苷受体拮抗剂在线索数据库,如cgs - 15943, - 1334,夫人夫人公安局- 1115,- 1220。提出分析基因的表达被修改的CA或TP在人类原发性肝细胞(TG-GATEs)并没有导致连接任何数据库中腺苷受体拮抗剂的线索。这种明显的差异可能是由于这些配体和methylxanthines效力的差异,或不同的转录组平台用于生成配置文件的线索数据库(L1000;羔羊et al ., 2006),在我们的示例中使用的(TemO-seq Biospyder)和三峡工程的工作(Affymetrix ThermoFisher)。Methylxanthines也与一些磷酸二酯酶亚型(Lazzaroni et al ., 1990),也会影响细胞生长、增殖,能量代谢抑制PI3K和mTOR信号通路(周et al ., 2010;伊斯兰教Tariqul et al ., 2019)。我们的通路富集和提出分析支持methylxanthines这些机制的行动。TP的主要作用机理一直被归因于非选择性抑制磷酸二酯酶酶(尼科尔森和舍希德,1994),但是有越来越多的证据表明,一些临床TP的影响可能是由于其他机制的行动如增加组蛋白脱乙酰酶酶(s)活动(HDAC;Ito et al ., 2002),或者干扰某些细胞内激酶(et al ., 2010);后者的机制也被建议的能力占TP扭转在COPD患者糖皮质激素不敏感。TP表现出预期的浓度依赖A1,拮抗作用,负责A2B和A3受体(范Mastbergen et al ., 2012),适度抑制磷酸二酯酶PDE2, 3和10,尤其是PDE2A1和只在相对较高的浓度(10−4米)(范Mastbergen et al ., 2012)。TP也已被证明能够抑制PARP-1人类肺上皮细胞(Mooren et al ., 2005)。可可碱是一种磷酸二酯酶(PDE)抑制剂,增加细胞内的环磷酸腺苷(营)(杉本et al ., 2014)。营激活cAMP-response元件结合蛋白(分子),反过来,诱导特定基因的表达。结核病Akt-mammalian雷帕霉素mTOR的目标信号的抑制体外以及在体内(鼠)系统(杉本et al ., 2014)。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是由一种蛋白激酶激活。我们的分析也整合与结核病相关的活动。
TP浓度,结核病PX或CA诱发显著的毒性在活的有机体内似乎并没有因为对purinergic受体拮抗作用,但机制不明的行动导致系统性毒性。例如,TP的发育毒性测定,降低结核病或PX如胎儿体重增加和骨化的变化,如增加发生多余的肋骨,只发生在母体毒性剂量(1984年国家结核控制规划;Khera 1985)。主要途径参与骨骼发育有缺口,刺猬,FGF,规范Wnt通路(长,2011)。然而,这些途径都在我们的分析特别丰富。这可能是由于浓度的差异我们测试在体外方法与使用的在活的有机体内或不能克服的培养细胞的反应之间的区别与一个完整的器官。相关联的一个限制我们使用的方法和方法与当前工作相关的细胞类型评估。虽然我们试图掩盖一个相对广泛的生物空间四个转录响应分析细胞类型选择,绝不是我们覆盖所有潜在的细胞特定类型反应化学。更大的细胞类型必须评估和综合的环境中个体细胞反应,以及反应的背景下整个组的细胞类型评价,为了实现这一目标。一个特定的细胞类型的限制评估这是他们有限的代谢能力。为更全面的转录响应任何给定的化学分析,母体化合物的转录响应以及其主要代谢产物必须获得。在我们的研究中,我们已经介绍了这个限制,包括在分析的主要代谢物短烷基苯甲酸脂类、羟基苯甲酸,在第一个案例研究中,和咖啡因的主要代谢产物在第二个案例研究。其他化学物质,必须解决母体化合物的代谢,通过包括一组代谢能力的细胞类型(例如HepaRG细胞,3 d皮肤模型),或通过评估响应的主要代谢物。同样必须在收集数据从其他类型的分析,如药理分析。
,CA的通路富集和提出分析,TP和结核病培养细胞中产生转录数据清楚地表明在体外反应非常类似于观察到的响应在活的有机体内对于这些methylxanthines,使用转录剖析的方法来定义相关的生物活性的化学物质被认为是一个读在锻炼的结果是一个可靠的方法来确定最相似的生物活性化学模拟的一个特定的目标。
结论
提出了研究结果,为短烷基链防腐剂和咖啡因及其代谢物的案例研究,表明转录分析来自暴露面板有限的细胞类型的化学物质利益,提供了一种实用的解决方案来确定最合适的模拟基于生物活性的化学物质感兴趣的相似之处伸展。短烷基链的防腐剂,目标化学是PP和潜在的类似物读MP, EP和英国石油公司。基于基因的表达的数量修改每个在每个细胞类型评价,尼泊金MCF-7细胞最敏感的这些防腐剂,途径影响和连接到其他活跃的化学物质,它可以得出结论,PP相似度最高的生物活性的一个从英国石油公司BP,因此数据可以用来阅读,填补这一假设的数据空白页高的信心。CA的情况及其主要代谢物TP, PX和结核病,CA被选为目标化学而其主要代谢产物被认为是潜在的类似物在阅读。结果表明,最健壮的转录反应是引起CA和TP的四个细胞类型评价,与这些methylxanthines iCell心肌细胞是最容易。在基因表达、通路富集和提出分析水平,被确认CA和TP之间最高的相似之处。因此,这两个methylxanthines最近的生物模拟,可以得出结论:TP的数据可以用来阅读,填补这一假设的数据差距CA高的信心。总的来说,转录的数据展示了工具结构相关的化学物质的分析提供一个健壮的数据流描述给定群之间的相似性在生物活性化学物质被认为是覆盖数据缺口。
数据可用性声明
完整的基因表达数据存入国家生物技术信息中心基因表达综合(GEO) (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691520304294?via%3Dihub埃德加et al ., 2002),可通过地理系列加入GSE218902数量。
作者的贡献
所有作者的手稿的完成起到很大作用。此外,所有的作者都在宝洁公司和适当的披露都包含在作者的从属关系的。
资金
这项工作是支持的长期科学策略(lrs)项目的欧洲化妆品。
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的利益冲突
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关键词:生物活性,在防腐剂、methylxanthines转录剖析
引用:王Naciff JM,山YK、X和Daston GP(2022)文章标题:转录分析功效定义生物活性相似基于下一代在化妆品成分的安全评估。雷竞技rebat在毒理学领域4:1082222。doi: 10.3389 / ftox.2022.1082222
收到:2022年10月27日;接受:2022年12月05;
发表:2022年12月21日。
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