修改QuEChERS方法开发分析泰乐菌素和甲硝哒唑抗生素残留在虾(中国对虾学名:使用LC-ESI MS / MS)

1.介绍

虾是一个有利可图的水产养殖物种在世界各地广泛交易(戴维斯et al ., 2021)。全球Penaeid虾产量约600万吨,其中大部分来自东南亚(粮农组织2020)。然而,密集的虾养殖很容易受到细菌疾病(Bermdez-Almada Espinosa-Plascenci, 2012)。近年来,虾养殖已经患有细菌性疾病的暴发,大大削弱了盈利能力和可持续性的操作(侯赛因et al ., 2013)。农民经常使用抗生素在水产养殖中,促进经济增长(尤其是在集约农业,Thornber et al ., 2020)和预防疾病(拉克什et al ., 2018)。然而,由于允许有限数量的抗生素在水产养殖中,一些生产商使用兽药(Defoirdt et al ., 2011)。泰乐菌素(Tyl)是一种大环内脂类抗菌素和高效抗菌药物用于兽医治疗各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(Joo et al ., 2020),甲硝哒唑(MNZ)是一种抗菌和antiprotozoal药物用于兽医和人类医学(Wagil et al ., 2015)。不正确的使用抗菌素或无视撤军时间的积累会导致在动物性食品中抗生素残留(王2009年)。抗菌素残留在食品对人类健康构成危害,肌肉因为他们敏锐地或累计过敏,organotoxic,诱变或致癌(Falowo Akimoladun, 2019)。减少风险对人类健康带来的使用抗生素在动物食品生产、欧洲共同体建立了一个法律框架来调节和控制使用兽药在动物产品(Samanidou Evaggelopoulou, 2007)。监测抗生素残留在食用动物组织需要敏感和有选择性的分析方法,以确保食品安全,提高消费者信心。众多分析方法是确定Tyl和MNZ残留在各种矩阵使用液相色谱串联质谱(质/ MS)。陈et al。(2019)描述了一种有效的方法来确定Tyl和其他五大环内酯物抗生素(mac)鸡肉样品使用质/女士随后自建多孔芳香框架(-)固相吸附剂。Sismotto et al。(2014)开发出一种方法识别Tyl和其他大环内酯类的罗非鱼片的液相色谱法耦合四极飞行时间质量(LC-QToF)。样本中提取乙醇和己烷。一个敏感的和快速的方法开发的决心MNZ和其他nitroimidazole残留在罗非鱼,三文鱼,虾样品使用ultra-performance-tandem谱(UPLC-MS / MS)。乙腈和C18 SPE盒用于样本提取和清理(沃森et al ., 2014)。Guidi et al。(2017)确定抗生素的筛选方法六组(beta-lactams四环素、喹诺酮类,大环内酯类,磺胺类药,和氨基糖甙类)在鱼类肌肉使用LC-ESI-MS /女士,三氯乙酸用于样品制备。尽管使用检测技术的好处,真正复杂的样品(如食品和食用动物组织)需要适当的样品制备,以减少干扰和防止潜在的基体效应(韦尔塔et al ., 2013))。一些萃取技术被用来分析食品中抗生素残留矩阵,包括固相萃取(SPE) (乔et al ., 2011)、加压液相萃取(中国)(胡安et al ., 2010),液液萃取(图象)(闪避et al ., 2015)。然而,这些过程是漫长和艰苦的,他们需要一个清理步骤(Stolker边缘主义者,2005年)。在这种背景下,QuEChERS(快捷,方便,廉价、有效、崎岖、和安全)的方法是一个简单的提取过程multiresidue分析(Zhang et al ., 2019)。然而,这个方法是最常用来分析农药残留在水果和蔬菜和鱼类样本(潜能。拉扎迪戈,2011年;Wilkowska Biziuk, 2011)。一些研究已经进行兽药的检测可食用组织矩阵(存根和Bigwood, 2009)。它没有被经常用来确定Tyl和MNZ抗生素在鱼类样本,和这些抗生素在低浓度水平的复苏还没有令人满意的(Wagil et al ., 2015;Susakate et al ., 2019)。在这项研究中,一个修改QuEChERS方法开发同时确定Tyl MNZ抗生素残留在虾肌肉使用LC-ESI-MS /女士。用乙腈提取的样本含有0.1%甲酸。清理样品,分散固相萃取(dSPE)吸着剂使用。作为主要dSPE吸附剂、二级胺(PSA)和十二烷基(C18)吸着剂使用。高萃取效率和最小的基体效应得到修改后的样品处理条件QuEChERS方法。这种方法提供了一些好处,包括减少提取步骤,快速提取,降低废物体积,满意的复苏,和较低的检出限。发达的方法验证按照标准委员会决定2002/657 / EC (欧洲委员会,2002)。

因此,本研究旨在开发和验证修改QuEChERS方法使用LC-ESI-MS /女士同时测定和量化MNZ Tyl残留的虾和使用这个开发和验证方法来分析从当地市场和超级商店收集的虾在孟加拉达卡和战争怎样惊人地扩大地区监控Tyl和MNZ污染水平。

2。材料和方法

2.1。试剂和化学物质

Tyl和MNZ标准(纯度99.5%)从Sigma-Aldrich采购,德国。LC-MS-grade乙腈和甲酸Sigma-Aldrich收集(纯度99.5%),德国。色散吸收剂十二烷基(C18),石墨化炭黑(GCB)和初级仲胺(PSA)从安捷伦科技采购,德国。Milli-Q仪(美国贝德福德微孔)被用来获得去离子水。

2.2。仪器

液相色谱质谱仪和ESI (LC-ESI MS / MS)和三重四极(回调)质量分析仪是用于分析。色谱分离Tyl和MNZ使用安捷伦1290无穷(安捷伦科技、Waldbronn、德国)和分离是通过使用一个ZORBAX RRHD Eclipse + C18柱(100×2.1毫米,1.8μm粒度)。分析物的分离使用的流动相(水)0.1%的甲酸和移动阶段B (ACN)。流动相流速为0.2毫升/分钟,注入体积是5μL。Tyl的保留时间和MNZ分别为2.85和3.1分钟,分别和总色谱运行时是7分钟。质谱仪包括三重四极分析器(6420三、安捷伦科技Waldbronn,德国)。三重四极质谱仪(回调)在MRM模式运作,监控两个前体离子转换,所有目标分析物离子[M + H) +前体。量化进行了更加激烈的两个质量转换,同时确认了。标准解决方案Tyl (0.2 mg / L), MNZ (0.2 mg / L)被用来优化碰撞能量(CE),前体离子,离子的产品。电离源条件如下:毛细管电压3500 V,喷雾器45 psi的压力,气体流速8 L / min,气体温度300°C,喷雾器45 psi的压力。质谱仪设置调谐如上所述表1。

2.3。样品收集

控制虾(中国对虾学名:)从质量控制实验室收集的样本,渔业,Chattogram,孟加拉国。他们收集了控制样本深海。在内部,样品被检查以确保他们没有Tyl和MNZ污染。销售虾样品(中国对虾学名:)(n= 25)收集从当地超市和超级商店孟加拉达卡和战争怎样惊人地扩大地区。样品被带到实验室的一个冰盒的市场。删除从虾壳后,样本混合和存储在一个压缩袋−20°C到进一步分析。

2.4。标准制剂

股票的解决方案(100 mg / L)是由服用10.0毫克的MNZ和Tyl标准溶液100毫升容量瓶,另行规定。容量瓶中充满ACN的马克。准备50 mg / L MNZ和Tyl中间工作标准的解决方案,解决方案的12.5毫升来自标准的股票解MNZ (100 mg / L)和Tyl (100 mg / L)和转移到25 ml容量瓶,和相同的溶剂被用于填充每个解决方案。MNZ工作标准的解决方案和Tyl (10、5、1 mg / L)准备构建一个校准曲线。最后,校准曲线建立了使用一系列的稀释0.2,0.5,1、2、5、10、20、50μg / L。在分析之前,所有MNZ和Tyl标准解决方案被储存在4°C。

2.5。样品制备

示例使用QuEChERS提取方法,做了一些调整。混合样本体重(3.00±0.01 g)为15毫升螺旋帽聚丙烯离心管的分析天平(4 dp)(日本岛津公司AUY 220)。离心管,10毫升ACN含有0.1%甲酸是补充道。1分钟后涡,样本在4500转离心5分钟。微型离心机管(2毫升)充满了1.5毫升的上层清液。然后,10毫克的C18和50毫克的PSA被添加到微型离心机管。地铁又离心5分钟后在4500 rpm动摇大力一分钟。上层清液被使用注射器,然后上层清液的过滤使用微米(μm)过滤器(0.20μm)。过滤后,上层清液被转移到2毫升瓶质/ MS分析。

2.6。方法验证

验证的方法按照欧盟委员会决定2002/657 / EC (欧洲委员会,2002)。方法的特异性和选择性测定研究空白和飙升的虾和Tyl MNZ样本。没有控制样本或峰值大约在同一目标分析物的保留时间,确认技术的特异性。评价了该方法的选择性没有任何信号在同一分析物的保留时间。确定系数(R²)计算了8分校准曲线来确定线性。线性回归分析对飙升的样本被用来创建校准曲线分析物的检测。方法的检测极限是3.3倍的标准错误拦截除以校准曲线的斜率和量化的限制是拦截的标准误差除以10倍斜率。在恢复研究中,三个不同浓度水平上升一式三份。精度估计使用相对标准偏差(RSD %),和准确性是经济复苏的比例计算。当矩阵组件可以增加或减少分析信号,matrix-matched校准(MMC)被用来减少基体效应。基体效应的比例估计使用矩阵的峰面积控制样品和溶剂的峰面积标准。

3所示。结果与讨论

3.1。优化的提取过程

在多类抗生素分析中,一个合适的样本提取准确的结果是必要的。样本提取应该快速,便宜,简单,环境友好。原QuEChERS对目标分析物的提取方法需要两个步骤:首先是通过盐析液液萃取步骤在乙腈和第二个是色散SPE (dSPE)清理。我们跟着QuEChERS一些修改后提取。优化或修改建议的方法是通过检查不同的提取溶剂、无机盐,吸着剂。ACN被认为是理想的萃取溶剂由于其容量沉淀蛋白质和脂质,这可能会降低药物残留在样品处理(吉梅内斯et al ., 2011)。起初,我们提取Tyl并使用ACN MNZ。然而,提取效率最大化时0.1%甲酸加入乙腈,导致令人满意的恢复值大于雨。样品制备过程中传统QuEChERS认为各种无机盐。跳过这一步在这个研究自清洁提取和一个常数色谱响应得到,和样品处理时间和成本降低。先前的研究表明PSA、C18和GCB吸着剂可以产生相应的结果UHPLC-MS / MS (Wilkowska Biziuk, 2011;Lombardo-Agui et al ., 2012)。我们评估的各种组合分散吸着剂来实现最高的经济复苏。抗生素的复苏的GCB减少,同时结合PSA和C18导致比单独使用C18更好的复苏。最后,一致和良好复苏时观察到50毫克的PSA和10毫克的C18被添加。类似的结果描述Grande-Martinez et al。(2018)。他们优化QuEChERS方法测定四环素在鱼类肌肉UHPLC-MS /女士。他们使用PSA和C18 dSPE吸着剂和复苏获得80 - 105%的范围。可能会丢失一些目标分析物在多步和复杂的样品清理。因此,一个简单的提取方法,如前所述在2.5节,在这项研究中,使用和恢复值高于先前的研究(表2)。

3.2。优化UHPLC-MS / MS条件

质/ MS技术用于这项研究。首先,我们女士的参数进行了优化。ESI(+)模式选择的检测Tyl MNZ,因为这种类型的电离以前用于检测这些化合物。标准解决方案(0.2 mg / L)的Tyl和MNZ准备在实验室直接注入到质谱仪调整参数。对于每一个化合物,一个前体离子和两个产品离子选择MRM分析(图1)。在MRM模式中,所使用的质/ MS技术两种转换和保留时间达到4个识别点为每个分析物(图2)。在正离子模式下,几个参数,如流量、毛细管电压、碰撞能量,和喷雾器的压力,会影响质谱进行了优化。我们还研究了LC条件。质/ MS技术、甲酸、乙酸、醋酸铵是最好的添加剂与水分离抗菌物质生物矩阵(加维兰et al ., 2015)。我们的实验结果显示,0.1%甲酸是最好的添加剂提高峰值分辨率和灵敏度。大多数发表的方法使用有机溶剂乙腈作为流动相的分析抗菌化合物(Gbylik et al ., 2012)。在这项研究中,最好的结果利用梯度洗脱和色谱柱与乙腈和0.1%的甲酸Milli-Q水。

3.3。方法的性能

3.3.1。选择性和特异性

选择性是评估通过分析的标准解决方案Tyl MNZ,空白的矩阵,矩阵和样本掺入了Tyl和MNZ同时保留时间和监控。没有任何信号在相同的保留时间抗生素矩阵表示,没有干扰,可能会导致假阳性信号,导致一个干净的色谱,是自由的干涉。证实了特异性注射10控制或空白样品。没有检测到潜在的干扰。结果表明,该方法具体(图3)。

3.3.2。线性

证实了的线性校准曲线绘制浓度与峰面积。一个很好的线性范围的0.2 -50μg / L分析物和相关系数(R²)的0.9997和0.9998是Tyl和MNZ matrix-matched校准曲线,分别。

3.3.3。LOD和定量限

检测极限(LOD)约为0.4 Tylμg /公斤和0.3μg MNZ /公斤,和量化的限制(定量限)约为1μg /公斤为MNZμg Tyl和0.9 /公斤。定量限是低于推广。

3.3.4。复苏和精度

复苏和盘中精度(重复性)飙升空白虾的方法进行样本在三种不同浓度水平(50、10和5μg / L)使用三个复制每个浓度水平1天。相同的浓度水平进行了研究与峰值空白在连续5天来评估interday精度(再现性)。盘中,interday表示为% RSD为精度的方法。经济复苏在81 - 85%的范围得到Tyl MNZ和85 - 88%。盘中Tyl精密(RSD %)是在0.7 - -4.9%和0.9 - -4.07%的范围MNZ, Tyl和interday精度(RSD %)为0.8 - -4.1%和1.20 - -3.09%的范围内MNZ (表3)。

3.3.5。基体效应

Tyl轻度基质增强效应和MNZ在80 - 85%的范围。这是确定样本矩阵阻碍Tyl和MNZ的检测。因此,matrix-matched校准(MMC)被用来减少基体效应进行定量分析。

4所示。方法应用

发达的方法应用于实际样品收集来自各种超市和当地市场在孟加拉国的达卡和战争怎样惊人地扩大地区。matrix-matched校准、试剂空白,飙升空白样品被用于质量控制。此外,后定义的标准委员会决定2002/657 / EC,保留时间和离子检测抗生素比在真实的样本比较的匹配校准标准在相同的批处理,以确保检测分子的身份。使用LC-ESI-MSMS 25样品同时检测分析。25虾样品的一个示例是大于定量限。

5。结论

修改QuEChERS量化的方法开发Tyl和MNZ抗生素残留在虾肌肉。分析物提取和清理只是使用修改后的QuEChERS技术来完成。验证数据的线性、选择性、准确性、旋进,LOD,定量限也令人满意。这些结果表明,修改QuEChERS方法快速、廉价、环境友好、适合Tyl的决心和MNZ抗生素残留在虾肌肉。该方法成功地应用于25个样品从当地市场和超级商店在孟加拉达卡和战争怎样惊人地扩大地区,和Tyl大于被发现在一个样本的定量限25岁。然而,进一步的研究需要更大样本大小确认Tyl和MNZ残留在虾的肌肉。我们所知,这是第一次在孟加拉国,修改QuEChERS方法被用来分析Tyl和MNZ抗生素残留在虾的肌肉。方法可用于改善食品安全在孟加拉,这将影响该国的出口。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

作者的贡献

先生,可研究的构思和设计。SI和可开发的方法。如果收集样本,分析它,解读数据,写的手稿。SY、马和SA提供指导的分析数据。整体研究提供指导和支持,先生编辑,回顾了手稿。所有作者提供评论之前提交的手稿。

资金

本研究支持了本文的SI授予的博士奖学金Bangabandhu科技奖学金信任,科技部,孟加拉人民共和国政府。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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