破译的微生物组成生物动力学的准备和对苹果的根际微生物的影响

介绍

土壤微生物在作物生产中扮演着重要的角色,但在人类世强烈影响组件(1,2)。因此,它是至关重要的识别威胁导致肠道菌群失调,以及找到可持续的恢复策略影响微生物(2)。土壤和植物卫生微生物多样性是至关重要的(3)以及对人类健康,它可以测量的分类和功能多样性以及基因总数内微生物群(4)。然而,丰富土壤中微生物多样性是一个挑战,可以直接管理通过应用微生物移植(我),(ii)与有益微生物属性,(3)microbiota-active代谢物,或间接通过改变环境条件,微生物也改变他们的结构和功能失调为一个健康状态(1,5)。在字段中使用肥料施肥,古典微生物移植,可以追溯到人类文明的出现,标志着由农业革命(6)。很多好处提高土壤生态系统功能、土壤质量、和植物健康,是由于堆肥在耕地和自然生态系统(7- - - - - -9)。然而,许多广泛的农业系统取代了过去的所谓如今激烈,传统农业。它的特点是高收益品种,这需要高投入的合成肥料,农药和通常导致减少土壤活力,新兴市场和多药耐药土传病菌和总收率下降,这提示重新评估农业实践(10- - - - - -12)。

当前的农业实践的持续评估转移注意力转向替代和可持续发展的系统,包括生物动力农业恢复“失去的土壤微生物”(13- - - - - -15)。此外,在全球范围内不断增长的食品和饮料需求下产生有机管理实践(16- - - - - -18)激励更深入的调查中微生物成分,利用有机修正案。生物动力农业(BD)最初是由奥地利哲学家概念化鲁道夫·施泰纳(1861 - 1925)(19),被认为是第一个系统的形式的生态或有机农业(15,19,20.)。尽管有机和BD农业有关,后者认为具体实践的目的是影响生物形而上学方面包括自然节奏关于太阳和月亮,天气和季节的农场(10,15,21)。BD农业的一个特殊特性是使用特定的BD肥料和发酵植物制剂(20.)。这些产品应用在固体肥料或液体提取表单的字段喷雾剂(即。、土壤或叶的应用程序)来提高土壤质量和促进植物健康(22- - - - - -24)。最近的研究强调了BD制剂的作用,尤其是在提高土壤多样性(15,18,25),并且还发现应用程序在葡萄栽培(17),特别是在提高winegrape质量(26)。此外,长期田间试验表明土壤微生物差异BD,集成和有机农业系统(27,28)即使在沙漠农业条件(29日)。

BD农业是根植于人智学,认为人类是地球的周期之间的主要联系和宇宙与人类桥接(精神和物质世界之间的差距17)。特殊的自然生物动力准备(被称为“斯坦纳准备”)制定和运用在这个系统来取代合成产品(17)。过程获得BD配方涉及发酵牛粪在牛角创建所谓的生物动力提取物(堆肥茶),然后按照施泰纳(30.)。发酵的原因在牛角可能仍然是未知的,准备从这个方法被证明能对感冒有特殊的品质包括土壤肥力的改善和增强植物生理反应光线辐射(25)。此外,(26)发现产生重大影响的BD准备提高葡萄酒的质量,winegrape树冠和化学,尽管矛盾结果关于对土壤质量的影响。然而,BD配方的微生物肥料和植物制剂,BD肥料之间的差异和non-biodynamic堆肥以及他们对根际微生物群的影响仍然未知。

因此,我们分析了细菌和真菌群落BD配方(肥料和植物制剂)和堆肥(标准、马和苹果混合物)。摘录BD肥料和堆肥通常应用领域喷雾;因此,我们也调查了微生物液体提取物及其前体材料。两分析提取物应用于不同的管理(有机和集成)苹果园和采集标本在布鲁姆(一个月),和收获后(4个月)探讨颞可变性在根际微生物。这项研究是基于这样的假设:(i) BD肥料和堆肥有不同的微生物;(2)双相障碍的微生物肥料是影响生物动力工厂准备的修正案;(3)双相障碍的微生物肥料不同地区之间的年生产;(iv)提取获得的微生物BD粪肥和堆肥是不同的前体材料,和(v)苹果根际的微生物是影响提取的应用。

材料和方法

生物动力的描述和肥料配方

我们取样4 BD肥料产品和6个生物动力工厂准备扩增子序列分析。BD角肥料来源于得墨忒耳(奥地利维也纳)和BioDynamie服务sarl(城堡、法国),而植物制剂都是来自法国。BD农业社区,工厂准备被称为p - 502, p - 503, p - 504, p - 505, p - 506, p - 507。在生产过程中,BD肥料(500)准备从发酵牛粪牛犄角,埋在土壤中50厘米的深度为6个月(即。在秋季和冬季)。角从土壤中恢复过来后,检索到的角肥料(500)可以修改6个不同植物制剂(p - 502 p - 507),称为500 p。

本研究中使用的BD配方起源于两种不同地区的生产:法国(fr - 500 / fr - 500 p)和奥地利(- 500 / - 500 p)。除了原产地地区的差异,我们包含了BD产品不同生产年(表1)。根据生产商,BD准备被存储在陶罐,放在一个被称作木箱覆盖着一个木制的盖子。盒子被单独关在地窖储存在恒定环境条件的准备。我们分析了BD粪便样品没有准备(在/ fr - 500)在2019年,2020年和2021年,BD肥料与制剂(在/ fr - 500 p)从2012年,2016年和2020年(表1)。BD肥料fr - 500 p在2016年修改四个工厂准备生产编码F T,年代,在法国和V,根据生产商。

比较生物动力肥料和堆肥,三个堆肥(标准,苹果,和马堆肥)在分析(包括表1)。简而言之,不同的堆肥是构成如下:(i)标准堆肥(70%的灌木枝条,5%的土壤,和25%有机废物);(2)马堆肥(60%的灌木枝条,5%的土壤,和35%马粪草);和(3)苹果堆肥(75%的灌木枝条,5%的土壤,和20%按有机苹果水果)。

治疗和实验设计

作为一种常见的做法在BD农业、现场应用喷雾是提取BD配方。同样,堆肥可以应用于液态形式为“堆肥茶”;它是由混合液体提取物堆肥糖蜜和石屑。我们应用两个提取物BD肥料(- 500 - p)和堆肥(标准堆肥)在两个苹果园,维护遵循有机和综合管理实践。有机和集成果园位于47.1289°N, 15.7807°E和47.2125°N,分别为15.8569°E。苹果树在每个果园种植了大约十年。治疗开始时进行春(2021年5月)。BD准备被洒应用提取的植物根系附近,用1:10的“得墨忒耳”推荐应用程序速度(即流浸膏:水)升每英亩。对于每一个果园,随机的情节设计4块每治疗和8 - 10棵树被选中。占的空间变化,情节被随机分布在六个相邻的行。 Rhizosphere samples were randomly taken from each plot using an auger of 5 cm diameter. Ten soil cores from each plot were pooled to comprise a biological replicate. Rhizosphere (soil associated with roots) sampling was performed one- and four- months after treatment and corresponded with the spring and autumn seasons. Samples were kept cooled and transported within six hours to the laboratory at the Institute of Environmental Biotechnology (Graz University of Technology, Graz, Austria).

样品处理和脱氧核糖核酸提取

BD肥料,肥料和BD工厂准备,4克的样品被储存在-70°C到DNA提取。从液体中提取DNA提取前(“堆肥茶”),摘录堆肥和肥料BD离心机在16000 g 16分钟,和微生物颗粒被冻结在-70°C到DNA提取。果园样品,大约。4克的根际土壤储存在-70°C。对所有样本,使用E.Z.N.A.总微生物基因组DNA提取^®土壤DNA工具包(ωBio-tek, Inc .);美国Norcross-Georgia)遵循制造商的指示。DNA质量检查使用Nanodrop 2000(美国热科学、威明顿、德)和存储在-20°C进行PCR扩增子测序。

总细菌和真菌丰度的实时定量PCR

引物对unibac - ii - 515 f / unibac - ii - 806 r细菌如前所使用的(29日)和ITS1f / ITS2r真菌(31日)被用于实时qPCR量化确定16 s rRNA及其基因的拷贝数在不同的样本。反应进行的总量10μL反应混合组成的5μL KAPA SYBR绿色(Bio-Rad、大力神、钙、美国),0.5μL每个引物(10µM), 3μL PCR年级水和1μL模板DNA(样本稀释水1:10 PCR年级)。放大进行了一式三份的每个示例使用Rotor-GeneTM 6000系列热循环(Corbett研究,澳大利亚悉尼),下面的程序设置:初始变性(95°C, 5分钟)其次是35周期的变性(95°C, s);退火(54°C, 15秒);扩展(72°C, s);然后融化从72年到96°C。连续稀释的标准包含定义复制数据生成的根据(29日)和用于计算基因拷贝数在不同的样本。标准,称为16 s rRNA基因片段的浓度芽孢杆菌sp,它从一个区域青霉菌sp.。

扩增子库的准备

提取的DNA被进一步用于扩增子库制备基于细菌的变异度高的V4地区16 s rRNA基因和真菌DNA的ITS1地区。我们采用一步使用引物PCR对515 f (5“-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3”),和806 r (5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)的细菌库制备(32)。两个正向和反向引物包含sample-specific条形码促进多路复用测序。对于每个PCR, 1µL提取DNA作为模板在30µL反应。肽核酸(机构)PCR夹子是用来阻止植物质体和线粒体16 s rRNA基因扩增的PCR扩增细菌社区(33,34)。反应混合物中含有6µL (5 xtaq去,PCR预混,议员生物医学),0.6µL(10µM 515 f / 806 r)引物,0.45µL(50µM mPNA和pPNA),和20.9µL PCR年级水。所有的反应都表现在一式三份thermocycler (Bio-metra GmbH,耶拿,德国)。PCR程序包含一个初始变性(96°C, 5分钟),紧随其后的是30个周期(94°C的60年代,78°C机构一步5 s, 54°C 1分钟,60年代74°C),其次是74°C 10分钟,然后冷却至10°C。

真菌的社区中,我们使用底漆对ITS1f (5 ' -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ')和ITS2r (5“-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3”) (31日,35图书馆准备)。所有放大进行了一式三份。µL之一中提取DNA用于每个30µL反应。反应混合物中含有6µL (5 xtaq去,PCR预混,议员生物医学),0.6µL(10µM ITS1F / ITS2R)引物,21.8µL PCR年级水。PCR程序包括最初的第一步变性(96°C, 5分钟),紧随其后的是30个周期(变性:60年代96°C,退火:58 60°C,和扩展:60年代74°C),其次是74°C 10分钟(最终扩展)和冷却步骤10°C。在正确的PCR扩增成功扩增子大小经凝胶电泳。PCR扩增子使用向导SV凝胶和纯化PCR清理系统(Promega,麦迪逊,WI)后,制造商的指示。纯化PCR扩增子量化使用Nanodrop 2000(美国热科学、威明顿、德)和汇集克分子数相等的浓度。Paired-end Illumina公司MiSeq 2 x 250测序的扩增子库进行Eurofin(德国柏林)。所有原始读取从测序公司都需要在欧洲获得核苷酸存档(ENA)研究加入PRJEB53400数量。

针对管道

Paired-end读取从测序设备使用Cutadapt quality-checked和去复用(36)。去复用读取分析使用2021.11.0 QIIME2版本(37)。引物序列被移除,DADA2 QIIME2环境中的算法采用质量过滤器、降噪和删除嵌合序列(38);因此产生扩增子序列变异(asv),和一个功能表的微生物计数。分类任务的去噪使用VSEARCH(执行读取39)工具QIIME2通过比较阅读与参考数据库:16 s rRNA SILVA132 (40,41)和联合v7 (42)顺序读取。

统计分析

所有数据进行分析与R统计软件(版本4.0.3)使用RStudio(1.1.423版)(43),辅以基于web的微生物分析工具(44)。获得的微生物、表和分类任务处理使用phyloseq (45)和素食2.5.7 (46)包。

α和β多样性分析,统计数据进行数据集稀薄1000年和700年的最小取样的深度阅读每样16 s及其分析,分别。的sample-specific稀疏曲线为细菌和真菌社区可视化(图S1)。一个生物动力工厂准备样品(p - 507)被排除在分析由于复制不足(样本保留一个)。

微生物α多样性计算使用的香农多样性指数(H)。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验(47),其次是邓恩的测试(使用Bonferroni修正为多个比较方法)进行香农多样性指数和丰富的数据来测试样品之间的差异(例如,BD肥料和堆肥,提取与前体材料);和治疗的比较(摘录标准堆肥和- 500 p) post-inoculation不同果园。此外,治疗的效果在根际微生物在不同采样时间进行了测试。置换方差分析(PERMANOVA 999排列)基于Bray-Curtis不同被用来测试社区结构样品组之间的差异。重要的因素(组合),使用“成对进行两两比较。adonis2素食”功能(46),假定值使用Bonferroni调整方法。微生物群落结构样品组之间的差异是可视化使用系统树图(由完整的Bray-Curtis距离聚类),和摘要多维标度(nmd)。

微生物分类构成基于top20类群的相对多度百分比类,顺序,和家庭使用堆叠柱形图代表水平。线性判别分析效应大小(LEfSE) (48)中实现微生物分析师(44)是用来确定观察到微生物差异背后的类群堆肥和生物动力的准备工作,以及揭示不同果园和采样时间的治疗效果。常见的微生物(定义为患病率为50%,检测阈值的相对丰度0.001%)是用于获得独特的和共享的、与不同的样品。asv的列表是使用生成的维恩图可视化systemPipeR包(49在R工作室。

我们使用了SourceTracker R脚本(50)来估计苹果根际微生物群的比例可能起源于喷雾剂从堆肥中提取和BD土壤肥料后治疗。SourceTracker估计微生物群的比例来源于一组源和汇环境(如前所述)(50)。在我们的示例中,摘录BD肥料(- 500 - p)和标准堆肥用于果园治疗被认为是作为源环境和根际土壤的水槽环境。通过考虑控制土壤作为微生物的来源,我们也跟踪处理根际土壤中微生物群没有提取的起源,但很可能起源于土壤。

结果

活生物肥料和堆肥不同微生物的结构和组成

扩增子测序的细菌和真菌群落产生了2213856年和4534963年高质量的读取,分别分配给9387 2742细菌和真菌asv。一般情况下,我们观察到显著差异在微生物结构之间BD肥料(- 500 / P或fr - 500 / P)和混合物(如苹果、马、标准混合物),特别是对于细菌社区(图1)。此外,基于分离观察BD肥料的原产国(图1 a, B)。香农多样性的显著差异(P = 0.008)堆肥和BD肥料之间观察到细菌社区(表S3A),而无显著差异(P = 0.19)观察真菌社区(表S4A)。微生物细菌丰度明显不同(P = 0.04;表S1A)和真菌社区(P = 0.009;表S2A)。

细菌丰度(每克土壤16 s rRNA基因片段)高在BD粪便堆肥和范围如下范围如下:(BD肥料:2.52×10¹¹4.17×10¹¹vs堆肥:8.89.16×10¹⁰1.46×10¹¹)。与此同时,真菌社区(每克土壤地区副本):(BD肥料:1.34×10⁹1.18×10¹¹对堆肥:8.89×10¹⁰1.46×10¹¹)。然而,显著性差异(P < 0.05)观察只对BD肥料之间的真菌丰度(- 500)和马堆肥(图开通),而无显著差异(P > 0.05)观察细菌社区(图S2A)。

细菌在BD肥料香农指数高于在堆肥和范围如下:BD肥料(5.28 - -5.63)与堆肥(1.81 - -3.54)。显著高于细菌多样性(P = 0.02)在BD肥料(- 500和fr - 500)与马相比堆肥观察(图S2C)。相比之下,真菌香农多样性范围(2.63 - -3.13)之间BD肥料相比堆肥(2.41 - -2.60),并显著差异(P > 0.05)在香农多样性观察真菌社区(图S2D)。

PERMANOVA BD肥料和堆肥透露这些有机配方之间的显著差异在社区组成细菌(R²= 0.85,P = 0.001)和真菌(R²= 0.85,P = 0.001)。此外,BD肥料修改与植物制剂(在/ fr - 500 p)可能不同于那些没有准备(在/ fr - 500),特别是对于细菌社区(图1 a, B)。

比较高级的分类BD肥料和堆肥微生物组成样本之间的差异。优势类群包括Chloroflexi(平均丰度百分比:35.0%),变形菌门(29.5%)和厚壁菌门(8.9%)。的门Chloroflexi主要在堆肥(标准、苹果和马),与丰度(分别为69.8%、72.4%和87.7%)。与此同时,变形菌门,厚壁菌门,放线菌在BD肥料相对丰度最高为43.7%,14.8%,和9.5%,分别。真菌群落的门子囊菌类(59.7%),担子(5.7%)和Mortierellomycota(5.1%)是主要的。我们观察到堆肥微生物之间的区别,尤其是对细菌社区。细菌家族Anaerolineaceae现在只有在堆肥;然而,未受教育的主导地位的细菌(图1 c)。与此同时,BD肥料被认为包含成员的家庭假单胞菌科,Peptostreptococcaceae,Microbacteriaceae,Lentimicrobiaceae,Lachnospiraceae,Devosiaceae,Burkholderiaceae(图1 c)。真菌的家庭包括不明Microascales,不明肉座菌目,Cladosporiaceae观察在堆肥(图1 d)。Trichosporonaceae,Microascaceae,Lasiosphaeriaceae,Mortierellaceae,毛壳菌科观察在BD肥料,而真菌家庭吗Cordycipitacea只有在苹果堆肥(图1 d)。

此外,细菌属包括芽孢杆菌,Devosia,假单胞菌主要是与BD肥料(P和fr - 500 / - 500 / P)。的真菌属Lecanicillium,节丛孢属主要是出现在堆肥,而毛孢子菌属,Scutellinia,掷孢酵母属与BD肥料。

分析常见的微生物分析显示,109年和82年细菌asv BD独有的肥料和堆肥,分别,只有两个asv共享(图1 e)。一些细菌属双相障碍的常见微生物肥料Paenibacillus,Mesorhizobium,分枝杆菌,纤维菌属,梭状芽胞杆菌。另一方面,13和54中被发现含有独特的真菌asv BD肥料和堆肥,而五asv之间共享微生物(图1 f)。共享真菌asv包括不明Capnodiales和不明身份的Microascacea。

生物动力肥料不同结构和成分的不同国家之间生产,但有着共同的微生物

我们比较BD肥料生产,生产和地区不同(奥地利、法国)。真菌多样性的差异(P < 0.05)观察fr - 500 - P[2012]和[2021]500如图所示(图S3D),而真菌丰度更高的在- 500[2020/2021]相比fr - 500 p (2016: S T和V) (图S3B)。无显著差异(P > 0.05),细菌丰度和多样性是生物动力学的肥料中观察到,这两个地区和不同年份的生产(数字S3A C)。

与微生物多样性和丰富,我们观察到大量的微生物组成差异BD肥料生产基于国家如下:细菌社区(BD肥料:R²= 0.78,P = 0.001: R²= 0.24,P = 0.001),社区(BD肥料:R和真菌²= 0.78,P = 0.001: R²= 0.26,P = 0.001)。这些差异也显示nmd明确分离的样品观察根据地区和BD肥料类型(图S4)。

占主导地位的细菌类Gammaproteobacteria(19.3平均百分比相对丰度),梭状芽胞杆菌(14.5%),Alphaproteobacteria(12.1%)。主要包括真菌类Sordariomycetes(47.9%),Tremellomycetes(6.7%),Pezizomycetes(5.9%)和Dothideomycetes(5.2%)。地区差异明显,尤其是对细菌社区。例如,订单Actinomarinales只有在BD肥料在法国生产图S3C)。与此同时,Sphingobacteriales观察只在奥地利BD粪便样本(图自己)。真菌社区这两个地区之间的订单分开Capnodiales,Ascosphaerales,Pleosporales在法国与BD肥料产生关联。独立的地区生产,BD肥料被发现含有细菌的家庭等芽胞杆菌科,Burkholderiaceae,Clostridiaceae,Flavobacteriaceae,假单胞菌科。

双相障碍的常见微生物肥料的评估两国显示30十三个真菌、细菌和共享。大多数细菌asv独特(分别为120年和123年奥地利和法国)。相比之下,总共有16个和11个真菌、奥地利和法国独特的(数字S4E F)。一些细菌asv包括共享Acidibacter Devosia,固氮菌,梭状芽孢杆菌、Romboutsia纤维菌属,Sorangium Solirubrobacter,Turicibacter。共享的真菌属毛孢子菌属,Mortierella,不明Microascaceae,不明Lasiosphaeriaceae和不明身份的Sordariales。

常见的植物制剂和微生物preparation-amended BD肥料

建立BD植物制剂是否改变了BD的微生物肥料(FR / - 500 p), BD的群落结构和多样性的准备工作(肥料和植物制剂)进行分析。之间的显著差异在微生物成分被修改BD肥料和不同植物制剂(细菌:R²= 0.83,P = 0.001;真菌社区:R²= 0.94,P = 0.001。nmd可视化显示一个明确的BD肥料和植物制剂之间的分离。微生物分离细菌和真菌植物准备观察社区,分别为(数字S5A C)。

有一个高微生物群负载在BD植物制剂和肥料(细菌:8.12×10¹⁰2.65×10¹¹)和真菌(9.70×10⁹1.34×10¹⁰)。观察一个显著差异(P < 0.05)之间的真菌丰度fr - 500和P - 505 (图S6B),没有差异(P > 0.05)观察到的细菌社区(图S6A)。另一方面,BD植物制剂的香农多样性指数和修订肥料(即fr - 500 p)范围在4.38 - -5.28和2.20 - -3.18之间,分别对细菌和真菌的社区。显著差异(克鲁斯卡尔-沃利斯,P < 0.05)细菌多样性的观察之间的BD肥料(fr - 500 P)和植物制剂(P - 505),以及P - 504之间P - 505和- 506 (图S5C)。真菌多样性更高(P < 0.05)在准备(P - 505和- 506)相比,P - 503 (图S6D)。

细菌的顺序Bacillales出现在BD肥料和植物制剂,除了准备p - 505,和p - 503和- 504年最高平均相对含量为11.8%和36.0%,分别。细菌的订单Rhizobiales,Pseudomonadales,Flavobacteriales观察植物制剂和BD肥料(图5 b)。与此同时,细菌性的是特别是在- 500 / P和工厂准备(P - 503和P - 505)。真菌的社区,BD肥料被订单区别植物制剂Capnodiales,肉座菌目,Ascosphaerales,散囊菌目和身份不明的真菌。真菌的订单Microascales,盘菌目与BD肥料和植物制剂(图S4D)。

比较准备修改和non-amended肥料显示120年和155年细菌asv之间共享(- 500和- 500 - p),以及(fr - 500和fr - 500 - p),分别为(数字S7B D)。同样,为真菌社区25 - 23 asv共享(数字S8B D)。有一个常见的微生物组之间共享BD肥料和植物制剂,为细菌(数字S7A C)和真菌社区(数字S8A C),分别。独特的比共享成员的细菌(数字S7A C)和真菌(数字S8A C)、观察植物制剂和BD肥料。BD之间共享的一部分常见微生物肥料和植物制剂是由细菌属Romboutsia,固氮菌,土微菌属,芽孢杆菌。与此同时,真菌属被共享镰刀菌素,Arthrographis,不明Microascaceae,不明毛壳菌科,不明Nectriaceae。

LEfSe分析确定了细菌和真菌属解释BD肥料之间的差异(fr - 500 p)和植物制剂(图2 a, B分别)。BD植物制剂(p - 502, p - 503, p - 504, p - 505,和p - 506)被细菌属的分化Luteibacter,Oceanobacillus,Virgibacillus,分枝杆菌,葡萄球菌(图2一个)。Lentimicrobium,Romboutsia,Devosia与双相障碍有关肥料(/ fr - 500 p)。然而,属芽孢杆菌BD肥料之间共享(在/ fr - 500 p)和植物准备。与此同时,真菌属Scutellinia,毛孢子菌属,掷孢酵母属主要是与BD肥料,而镰刀菌素,Ascosphaera,Pseudallescheria,Arthrographis,毛壳菌属,Cyberlindnera,Scedosporium与双相障碍有关植物制剂(图2 b)。

提取和前兆资料的BD粪肥和堆肥标准包含一个常见的微生物

微生物多样性和丰富对比提取和前兆资料的BD肥料(- 500 - p)和标准堆肥透露,提取通常包含微生物多样性高于前体材料,除了在- 500 p (数字S9C D);微生物丰富,反之亦然(数字S9A B)。显著提高(t检验,P < 0.05)微生物丰度在BD肥料的前体(- 500 - P)各自的提取相比,对细菌和真菌社区(数字S9A B)。无显著差异(P > 0.05)在微生物丰度观测之间的前体和提取的标准混合物(数字S9A B)。标准的堆肥中提取的细菌多样性显著降低(t检验,P = 0.004)比提取来自堆肥材料(图S9C)。相反,真菌多样性提取来自标准的堆肥和BD肥料(- 500 - P)明显高于(t检验,P < 0.05)相比,前体物质(图S9D)。

提取和前体材料之间的微生物群落结构BD肥料(- 500 - p)和标准堆肥是截然不同的。这PERMANOVA分析证实了我们观察到显著的差异提取及其衍生材料(即。细菌:R²= 0.65,P = 0.001和真菌:R²= 0.72,P = 0.001)。此外,社区两两比较显示显著差异(P < 0.05)前体之间的群落结构材料(标准堆肥和- 500 - P)和各自的提取,对细菌和真菌社区(表S7和S8分别)。

标准堆肥的提取和前体材料不同微生物组成。BD粪肥和各自提取显示类似的微生物组成(图3 a, B)。细菌类Anaerolineae(61.6%)和Chloroflexia在标准的堆肥(8.2%)成为主流,而Gammaproteobacteria(52.3%)和杆菌(34.0%)的提取主要是出现在标准堆肥(图3一)。BD肥料(- 500 - p)和提取主要是与细菌类Gammaproteobacteria(前身:30.8%和提取:20.6%),Bacteroidia(18.0%和11.3%),Alphaproteobacteria(11.8%和18.1%),梭状芽胞杆菌(11.8%和11.5%)Deltaproteobacteria(5.2%和8.2%)。真菌的社区,提取标准的堆肥和BD肥料而前体材料含有丰富的更高Dothideomycetes(分别为10.0%和1.2%,2.6%和0.1%),Eurotiomycetes(分别为7.7%和1.2%,4.1%和0.3%),以及Leotiomycetes(分别为2.0%和0.7%,3.1%和0.5%)(图3 b)。

有趣的是,BD肥料(- 500 - p)和相关提取共享228年和110年asv常见的微生物,包括细菌和真菌群落,分别为(图3 c, E)。相反,标准的堆肥和提取196年和111年被发现分享asv (图3 d, F)。微分分析显示细菌属的浓缩芽孢杆菌,假单胞菌,Paenibacillus,黄杆菌属,固氮菌标准提取物的堆肥相比前体材料(图S10A)。与此同时,在提取(p - 500)作为前体材料相比,细菌属包括的一个浓缩Roseobacter和Polynucleobacter观察到,Lentimicrobium, Devosia,Simplicispira被浓缩在- 500 p(前体)图S10B。

真菌社区,genus-level差异提取和前体材料标准的堆肥和肥料BD (- 500 p)是浓缩的真菌属镰刀菌素,毛孢子菌属和曲霉属真菌在提取比标准的堆肥和- 500 p前体(数字S10C D)。此外,青霉菌,Scutellinia由标准堆肥的提取(图S10C),而Arthrographis在- 500 p提取(富含图S10D)。

提取时间影响苹果的根际微生物在有机和综合管理系统

微生物的结构和组成,以及多样性及丰度分析,进行与根际土壤样本两个苹果园使用有机和综合管理系统进行管理。获得的样本在两个采样时间(春季和秋季)从果园。没有明显差异(P > 0.05),治疗和控制之间的微生物丰富,有机和集成在一个果园——四个月post-inoculation (图S11)。一般来说,四个月后,细菌多样性较低相比,在治疗控制。相比之下,真菌多样性较高的治疗与控制(图S12)。在四个月post-inoculation,细菌多样性显著降低(P < 0.05)在标准堆肥(提取治疗)与控制有机果园,以及在- 500 P之间的控制集成果园(图S12B)。此外,真菌多样性明显高于在- 500 p治疗与控制集成果园四个月post-inoculation (图S12D)。

β多样性,重要的微生物结构差异果园类型和采样时间观察:果园类型(细菌:R²= 0.14,P = 0.001;真菌:R²= 0.30,P = 0.001)和取样时间(细菌:R²= 0.06,P = 0.001;真菌:R²= 0.06,P = 0.004)。总体治疗效果的观察微生物有机果园,一个月后(PERMANOVA;细菌:R²= 0.32,P = 0.02;真菌:R²= 0.26,P = 0.001)和四个月(细菌:R²= 0.27,P = 0.002;真菌:R²= 0.23,P = 0.05)如图所示(表S7,S8细菌和真菌的社区,分别)。然而,在集成的果园,一个重要的治疗对细菌群落结构的影响观察治疗后4个月(R²= 0.32,P = 0.002),而没有显著的影响(P > 0.05)被真菌社区(表S7,S8)。两两之间的显著差异(P < 0.05)的治疗和控制在月post-inoculation真菌社区的证明(表S8),和细菌社区在果园post-inoculation(4个月表S7)。nmd的微生物群落聚类显示了不同的治疗方法和果园,在一个月(数字S13A C),4个月(数字S14A C接种后,分别对细菌和真菌的社区。

苹果主导了两果园根际细菌类群变形菌门(有机:集成;26.1%:25.8%)厚壁菌门(30.0%:3.4%),放线菌(18.8%:26.9%),Chloroflexi(13.1%:15.5%)Acidobacteria(17.2%;10.4%)。另一方面,真菌社区成为主流了子囊菌类(70.1%:68.1%),Mortierellomycota(21.8%:21.8%)担子(6.5%:8.3%)。对果园,在月post-inoculation细菌组成相似,但更高的平均少丰富的类群的相对多度分为(“他人”)是在根际土壤处理提取的BD肥料(- 500 - p)和标准堆肥而控制(图S13B)。真菌的社区,我们观察到,家庭等Microascaceae,毛壳菌科治疗和控制(高图S13D)。

在四个月post-inoculation,家庭层次分类组成相似,但观察差异不甚丰富的类群(“他人”),其丰度高的治疗和控制(数字S14B D)。相比之下,一个高富足的家庭毛壳菌科观察在治疗与控制相比,有机和集成果园(图S14D)。

所有微生物属负责重大成对社会成分差异进一步探索治疗和控制。在月post-inoculation,浓缩的控制真菌属链格孢属,Thelonectria,Solicoccozyma有机果园中可观察到图4一)。与此同时,属毛壳菌属非常丰富的根际处理提取的BD肥料(- 500 - p)。在四个月post-inoculation,细菌属包括芽孢杆菌,Bradyrhizobium,Pseudolabrys,不明Burkholderiacea丰富的控制与治疗相比,虽然Chthniobacter和Candidatus Xiphinemebacter在根际丰富有机果园(治疗后图4 b)。集成的果园,细菌属假单胞菌,分枝杆菌,Candidatus Udeobacter在根际,浓缩处理- 500 p(提取),Candidatus Xiphinemebacter和未受教育的Pirellulaceae浓缩在根际提取物标准堆肥处理(图4 b)。

提取物的应用标准堆肥和BD引入了新的苹果根际微生物进入,尤其是在综合苹果园

SourceTracker来揭示根际微生物组的一部分,这是引入的潜在的治疗,包括提取物在- 500 p标准的堆肥和有机和集成果园(图5在两个采样时间)。我们观察到时间的差异被引入的根际微生物的比例提取物。比例post-inoculation微生物群的一个月,四个月post-inoculation可以追溯到治疗,尤其是对集成的果园。

我们观察到在综合治疗方法引入了更高比例的细菌比有机果园,尤其在月post-inoculation,百分比和平均比例范围如下:有机(1% - -2%)和综合管理(1% - -20%)。然而,高比例的细菌(10%到60%)和真菌(0% - 20%)的提取(即贴上“未知”)无法被追踪的根际(图5)。真菌的社区,在有机和集成的果园,提取从标准堆肥相比在- 500 p被发现可能引入更多真菌进入根际:有机(在0% - 500 p: -2%比标准堆肥:0% - -3%),和综合管理(-1%比0% -2% 0%)。考虑控制土壤作为微生物来源,我们观察到一个高比例的微生物(细菌:40%到90%,真菌:80%至95%)是与根际土壤处理。

讨论

生物动力学的肥料、堆肥、植物制剂进行不同的微生物。我们观察到一个更高的微生物多样性在BD肥料比BD植物制剂和堆肥(苹果、马和标准的混合物)。而有机材料的类型和数量的影响对堆肥微生物之前报道(51),我们的研究首次揭示了特定的微生物BD肥料之间的差异和堆肥。这些变化可能是由于各种因素如起始物料的类型和使用的堆肥技术(52)。此外,物理和化学的作用参数如氧气、温度、水分含量、pH值和营养可用性形状堆肥微生物(53)。

特定于BD农业、动物粪便和随后的修正案的发酵工厂准备形成一个双相障碍的关键部分产品(20.)。这项研究显示,植物准备和修改BD肥料含有不同的微生物。此外,微生物群落中各种不同的植物制剂。这种变化在准备可能归因于它们派生的植物材料。此外,植物基因型对微生物的影响已经他处(54,55)。我们的研究提供了一个联系工厂微生物和植物的有机改良剂的微生物。我们建议,具体程序用于制造BD肥料可能会在很大程度上造成了BD产品的独特性。这是明显的明显的堆肥和BD同行之间的差异(图1 a, B分别为细菌和真菌社区)。然而,一个常见的微生物组成的Paenibacillus,纤维菌属,梭状芽胞杆菌所有BD肥料之间共享和堆肥。这些类群发挥重要作用作为精通植物生物量下降(56)。在家人的存在Clostridiaceae可以归因于使用牛粪BD准备。梭状芽胞杆菌与严重的牛羊,杆状的血红蛋白尿,建议可以减少其发病率每年接种牛群(57)。梭状芽胞杆菌在传统双相障碍的准备工作可以实现类似的功能。此外,固氮梭状芽胞杆菌(58,59),支撑有机改良剂的潜在影响在促进有益的土壤微生物特征。

生物动力肥料修改与制剂含有丰富的高放线菌一门以堆肥过程中的积极作用(60,61年)。证据表明放线菌的一个财团厚壁菌门,变形菌门,拟杆菌门木质纤维素的分解最近透露(56)。潜在plant-beneficial细菌的家庭假单胞菌科,Burkholderiaceae,芽胞杆菌科(62年)观察BD配方和植物制剂。这意味着一个潜在的贡献与BD肥料和植物相关的微生物制剂在农业系统。

有趣的是,一个常见的细菌属的微生物固氮菌和真菌属镰刀菌素和ArthrographisBD肥料和植物制剂之间的观察,进一步强调了潜在土壤丰富有益的细菌。属镰刀菌素主要包含植物病原物种(63年观察),主要是与BD植物制剂。然而,非致病性的和有益的镰刀菌素物种是众所周知的64年)支持种内微生物多样性可以抑制致病性(3)。真菌的家庭Ascosphaeracea观察的BD植物制剂,曾被发现与蜜蜂的微生物(65年)。我们认为这可能源自植物的花朵作为原料生产BD工厂准备。

独立的生产(存储效应),双相障碍的微生物肥料是不同地区之间的生产(奥地利和法国)。我们建议的各种因素,包括植物和动物原料,以及产品处理在两个区域,观察到微生物差异起到很大作用。我们的研究扩展了这一观点来解释观察到的区域差异的可能原因在BD肥料。此外,微生物一致性年表明,BD肥料也可以复制一个生产线。具体程序使BD准备BD已经实行了几十年的农业社区,也是标准化(10,15,20.再现性),它提供了一个解释。

使用液体提取物BD肥料领域喷雾剂是一种常见的实践在BD农业(15)。而这样的生化特征提取已经破译(66年,67年),我们的研究作为底漆,进一步了解双相障碍的微生物提取物。提取和前体材料的微生物堆肥和BD肥料不同,但有着共同的微生物。我们可能属性共享微生物提取物是派生的材料;过程材料也在发酵。此外,常见的微生物肥料,主要由厚壁菌门和放线菌最近被发现(68年)。细菌属包括假单胞菌,Paenibacillus,固氮菌,不明Sphingomonadaceae与标准有关堆肥中提取微生物强化堆肥提取以前发现基本在改善植物生长和营养(69年)。因此,微生物成分可能解释的影响归因于提取植物健康应用程序。

一些真菌属等镰刀菌素,曲霉属真菌青霉菌,Mortierella,Lecanicillium观察的提取不同的堆肥和BD肥料。有趣的是,Lecanicillium已经发现昆虫病原特性,导致其对蚜虫使用成生物药物(70年),以及phytoparasitic线虫和真菌(71年,72年)。的真菌属青霉菌多样化和广泛分布在土壤环境(73年- - - - - -75年)。它可以通过二次产品的生产(起到积极作用76年),以及在植物生长和国防扮演关键角色(77年- - - - - -79年)。在提取高微生物多样性被发现,前体相比标准堆肥和BD肥料。这可能是由于添加剂如糖蜜和石屑用来提取。此外,水作为溶剂提取生产过程中使用的可能是导致其微生物。最近的研究发现高微生物多样性在水中微生物(80年- - - - - -82年)。

总体而言,产生积极的影响的BD粪肥和堆肥修正案对土壤真菌多样性被发现,特别是在四个月post-inoculation,有机和集成的果园。浓缩BD配方对土壤微生物的影响被放弃的一项研究报告(27),通过当前的研究进一步证实。先前的研究表明,BD肥料的使用和相关提取葡萄栽培影响土壤生物多样性和生态系统功能(13,18,83年,84年),并在改善土壤质量(中扮演重要角色23);以及他们的潜在作用在生物动力学的葡萄栽培包括葡萄酒质量的提高(17,25,26)。在目前的研究中,治疗增加了Acidobacteria在有机和集成的果园。Acidobacteria是一个相当弱势门,但无处不在的土壤环境(85年,86年),并参与各种在生物地球化学循环过程,分解的生物聚合物,胞外分泌物,促进植物生长(85年,87年,88年)。的真菌属链格孢属被发现减少治疗比未经处理的根际在月post-inoculation有机果园。因此,我们建议一个潜在的治疗双相障碍的作用是减少植物致病真菌,其中还包括链格孢属。这属腐生的无处不在,内生,病原物种(普遍存在与各种植物,包括水果(89年- - - - - -91年)。此外,一些链格孢属在人类物种与过敏(92年,93年)。有趣的是,菌株的镰刀菌素和链格孢属最近发现与许多农作物的种子,他们垂直传播到根和根际(94年)。另一方面,属的细菌假单胞菌和分枝杆菌被发现是丰富的苹果根际集成提取物治疗双相障碍的果园肥料。因此,在BD农业的背景下,我们的研究结果提供了洞察BD产品的潜在作用尤其是增加了大量的有益的细菌属。此外,不同的土壤质量指标的测定表明较大的响应在BD系统,比传统的管理系统(95年,96年)。

我们试图从提取跟踪微生物根际透露,一个特定的比例提取微生物组是可转让的。与之前的一项研究(27),我们观察到一个更高比例的社区被转移到根际细菌和真菌在综合管理果园相比有机果园。这意味着使用BD提取不同影响当地土壤微生物。这可能是由于与土著微生物的竞争,存在于这些土壤。然而,微生物有机修正案原产地签名可以生存在土壤微生物生物量(97年,98年)。有趣的是,即使BD准备低适用率(即1 l: 10 l;精华:水)如图所示,Koepf等等。(99年)和国际生物动力农业指南“得墨忒耳”(https://demeter.net/),我们观察到的一个重要处理对微生物群落结构和多样性的影响,尤其是真菌多样性的增加在秋天的果园集成。因此,我们建议增加频率的治疗应用程序可以更有效地调节当地土壤微生物。此外,少量的应用(例如≥5%)的抑制土壤被发现诱导suppressiveness疾病有益的土壤One hundred.,101年)。低比例的苹果根际的微生物转移到有机而综合管理果园会产生高的居民微生物群的竞争。限制建立bioinoculant菌株在土壤环境中以前描述(102年,103年),并可能包括竞争,以及由于不同土壤理化参数限制在殖民。

结论

这项研究的结果提供了第一次洞察生物动力的微生物肥料及其应用液体提取。总体而言,我们的研究结果提供知识的方法来加强在农业土壤微生物多样性,特别是在集约管理的领域。此外,生物动力产品的深入评估果园受到不同领域的管理系统提供了有价值的信息与植物根际土壤微生物的贡献。有趣的是,堆肥的低标准化修正过去批评(104年),可以在未来的农业优势,这需要更多的各级多样化。我们发现潜在的有益微生物来自生物动力学的治疗可能是建立在不同农业系统的介绍;虽然,一致的应用程序将需要提供长期预期利益。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

作者的贡献

GB, PK, EO, RM设计研究。EO, PK, RM进行实验,把样品。EO图书馆进行准备和其他实验室工作。EO, PK和WW分析数据和解释它与TC某人,GB。EO,某人,PK写的手稿。所有作者读,纠正和批准了最终版本。

资金

我们感激地承认了亚瑟王的神剑研究的资助项目资助欧盟地平线2020研究和创新项目赠款协议817946号(GB)。

确认

我们真诚感谢罗伯特matz (Gleisdorf Steirmark-Austria)和约瑟夫·辛格(Gleisdorf Steirmark-Austria)分配我们实验果园应用治疗,进行采样,以及在维护实验情节。从他们的家庭和酒店的合作也是高度赞赏。

的利益冲突

作者RM是受雇于公司BODENmanagement.net。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fsoil.2022.1020869/full补充材料

引用