补充侵蚀关节疾病的临床诊断与仿生比率计传感器
凯莉杨
卡特里娜Pavic
艾米·a·鲍耶
尼古拉斯Manolios2、3
伊丽莎白·j·新- 1化学学院,悉尼大学,悉尼,澳大利亚新南威尔士州
- 2风湿病,韦斯特米德医院,威斯特、新南威尔士、澳大利亚
- 3风湿病、医学院和健康,威斯特、新南威尔士、澳大利亚悉尼大学
- 4悉尼大学的纳米研究所(悉尼纳米),悉尼大学,悉尼,澳大利亚新南威尔士州
- 5澳大利亚研究理事会创新肽和蛋白质科学卓越中心,悉尼大学,悉尼,澳大利亚新南威尔士州
炎症性风湿病疾病通常的特点是改变基质金属蛋白酶含量水平关节液和关节膜。因此,监测滑液MMP的活动是至关重要的,使及时诊断,预后和有效的治疗。这里我们报告一个新颖的荧光分析方法来衡量吸气滑液中蛋白酶活性。我们的荧光记者包含可分裂的连接器蛋白酶底物肽序列的基础上,显示比率计输出在乳沟。我们验证了记者patient-derived滑液,并演示了他们描述疾病类型的能力。
介绍
侵蚀经常出现在类风湿性关节炎、银屑病关节炎和痛风在残疾的主要原因,由于关节破坏和进步的限制关节的功能。等炎性关节相关条件逐步侵蚀骨骼和软骨细胞,引起蛋白质结构和功能的破坏,如胶原蛋白和aggrecan (萨哈和科尔,2012)。如果任其发展,蛋白酶的作用会导致骨损伤和畸形的晚期疾病。因此,疾病的密切监测活动至关重要为了战斗腐蚀性疾病更严重形式的发展可能需要更积极的治疗(Heidari对伊朗伊斯兰共和国通讯社表示,2011年;楚et al ., 2012)。
几种诊断和预后方法在临床实践中经常使用监测腐蚀的联合条件,和各有特定的优势和缺点。这些包括成像方法(例如x射线和磁共振成像),和生化方法评估炎症标记物的水平(如。c反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)) (Crockson et al ., 1977)。虽然诊断成像可以提供特定的结构信息的骨头和软骨损伤,随着时间的推移这些结构畸形通常进展缓慢,需要很长时间才能发展(Alasaarela et al ., 1998;Døhn et al ., 2006)。短期波动可以通过测量炎症标记物监测疾病活动,通常是高灵敏度。然而,许多这些标记,如c反应蛋白和ESR,非特异性和缺乏识别疾病的细节,因为他们只报告系统性炎症的存在中观察到许多疾病(布雷et al ., 2016)。此外,抗炎药物可以直接影响生化测试的结果,如c反应蛋白(奥尔et al ., 2018)。
可靠的疾病生物标志物的鉴定是一个必要的一步提高诊断的准确性,监测疾病的发展和预后。为此,蛋白酶吸引了许多研究的兴趣,因为他们发挥重要作用的破坏线滑膜关节的结构蛋白。这些包括胶原蛋白、骨头和软骨的主要有机结构组件,和蛋白聚糖,形成水合凝胶保护软骨磨损。基质金属蛋白酶(MMPs)和adamalysins也认为是软骨破坏的主要介质(Rengel et al ., 2007)。由于他们在功能和形式的相似性,许多基质金属蛋白酶进行了调查的潜在生物标志物疾病:例如,MMP-3,金属蛋白酶- 1和MMP-13已知升高关节炎(Burrage et al ., 2006)。
整体蛋白水解活动现场的疾病可以衡量疾病活动的有效方法,因为持续支撑逐渐侵蚀和re-modelling蛋白质水解骨和软骨。蛋白酶水平一直在传统测量基于抗体的免疫印迹等技术和酶联免疫吸附试验(ELISA),但这些技术需要多个步骤和试剂,并必须特定数量的个体蛋白酶,而不是一般的蛋白酶活性。另一种方法是评估直接利用人工基质蛋白酶活性,通过此类反应的产品检测到光(Bisswanger 2014;罗宾逊,2015)。鉴于蛋白酶作为催化剂、光学产品可以建立在时间和后续的放大信号允许酶被发现在极低的水平,提高检测灵敏度。在光学读数,荧光灵敏度特别高。
我们报告三个新颖的设计和应用人工substrate-based调查评估滑液中蛋白酶活性。我们的结果表明,这种新的分析积极与疾病活动来衡量当前的黄金标准c反应蛋白和ESR等生化测试。线性判别分析(LDA)已经表明,我们的分析提供了有价值的诊断认识作为辅助疾病的标志。
方法
合成
4-amino-1 8-naphthalimide,通过染料都由标准的合成方法中描述补充材料。是由固相肽合成合成肽连接基团在王树脂(补充材料)。实验提供的细节补充材料。
临床研究
伦理批准授予了西悉尼当地的卫生区人类研究伦理委员会。所有患者呈现给威斯特或皇家王子阿尔弗雷德医院2017年5月到2018年9月,关节积液,关节滑液的愿望被认为是必要的诊断或治疗的目的被认为是包含在这个研究。每个关节滑液愿望进行使用无菌技术。标本储存在15分钟内−80°C的集合。滑液标本被解冻,用移液器吸取进入无菌96 -黑色清澈见底板块有0.2% w / v叠氮化钠作为防腐剂。他们储存在−20°C分析之前不超过14天。临床和实验室收集的参数描述补充材料。
光谱的研究
收集在激发和发射光谱PerkinElmer Enspire多模板读者平底的清晰和黑色96 -聚丙烯或聚苯乙烯板,或路径长1厘米的瓦里安卡里Eclipse荧光计石英比色皿。滑液分析提供的细节补充材料。
数据使用SPSS统计软件包进行分析,这是用来计算斯皮尔曼相关系数ρ和执行线性判别分析(LDA)中描述补充材料。
结果与讨论
探针的设计、合成和荧光
监控蛋白酶活动,我们设计了一组比率计substrate-based调查。总的来说,设计的探针有三个功能单元:1)两个荧光团提供比率荧光读数;2)可分裂的肽连接器所认可的基质金属蛋白酶;和3)增加水溶性带电集团(图1)。
图1。结构和正常化荧光光谱探针与蛋白酶在消化过程中。结构的NpCyC(一),NpCyP1(B),NpCyP2(C),NpCyP3(D)。期间NpCyC正常化荧光发射光谱和IV型胶原酶消化(E)。反应混合物含有探针(50μM)和IV型胶原酶(3.3μg /毫升)Krebs-Ringer缓冲区(pH值7.4)和监控在25°C采取1扫描使用405 nm激发每2分钟。正常化NpCyP1的荧光发射光谱(F),NpCyP2(G),NpCyP3(H)在patient-derived滑液炎性关节炎患者。荧光光谱代表变化每隔10分钟/ 2 h。箭头表示随着培养时间的变化。
使用两个荧光体两端的调查旨在提供一个比率荧光输出最小化等背景的影响,通常会影响整体强度的波动探针浓度,不同强度的激励源和浊度(新,2016)。在这种情况下,我们选择了一个green-emitting 4-amino-1, 8-naphthalimide和orange-emitting通过确保以最小的光谱重叠(两个截然不同的发射峰补充图S1)。此外,这种荧光团对以前已被证明是一个合适的施主-受主对福斯特的共振能量转移(FRET),一种机制通常用于制备比率计系统(沈钱,2019,2020年)。在整个工作中,激发波长405 nm和460 nm之间使用,因为这是供体荧光团激发的光谱区(补充图S1)。
肽链接器选择最大化MMP的敏感性检测。八个最优识别序列是从那些之前报道被选出来的MMP的活动(埃克哈特·et al ., 2016)。从发布的八个最优识别序列埃克哈特·et al。(2016),我们发现三个最明显的序列。我们预期这些底物一起使用时,应该从基质金属蛋白酶能够检测活动在一个广泛的MMP的类(埃克哈特·et al ., 2016)。每个肽还包括一个c端精氨酸残基,这样会增加水溶性两性离子的字符。探针的合成涉及初始制备荧光团functionalised羧酸的后续肽耦合,紧随其后的是王组装探针的树脂通过固相多肽合成(许可证)(补充材料)。
这种方法被用来合成四探针与不同的酶识别序列(图1):三个轴承上面描述的MMP识别肽(NpCyP1,NpCyP2和NpCyP3探针),模型,NpCyC。从基质金属蛋白酶无法购买的商业,NpCyC设计包含商用IV型胶原酶的识别序列(PLGP)。经胶原酶IV除了解决探针,观察发射从橙色变成绿色,这是符合乳沟肽连接器和破坏的烦恼。在未反应的形式会担心napthalimide捐赠者通过受体。在反应,乳沟创建供体和受体之间的物理距离,所以只有naphthalimide排放观察经naphthalimide激发。
有前途的研究后NpCyC孤立的酶,我们调查是否NpCyP1,NpCyP2和NpCyP3可以在滑液检测蛋白酶活性。Sinovial流体吸入收集患者呈现一系列关节的腐蚀性条件(补充表S1)。当我们观察胶原酶IV和NpCyC造成的滑液系统,除了改变MMP的橙色,绿色荧光发射的探测器,符合乳沟的链接器(图1)。为了确认这个颜色的变化是由于酶活性,控制在实验过程中,高度活跃的滑液标本被选择,一部分是使用热变性和十二烷基硫酸钠(SDS)。在这些变性的样品中,没有观察到荧光比率的变化(补充图S2)。总的来说,这些实验表明,MMP的探针,NpCyP1,NpCyP2和NpCyP3在生物学上,有足够的灵敏度检测蛋白酶活动相关的滑液的浓度,而控制实验证明完全折叠蛋白质需要催化这种荧光反应。
患者数据
证明了我们的传感器的灵敏度,我们应用它滑液,收集各种风湿病的患者中。从58例包括在这项研究中,66滑液样本收集。生化和血液学的标记和滑液显微镜的观察和文化也记录(补充表S1)。
蛋白酶活性变化很大在不同滑液标本,反应所代表的不同的配置文件(图2)。总的来说,这些反应资料不同主要在反应初始速率在第一个15分钟,最后荧光比率[绿色(535纳米):橙色(610海里)]120分钟后记录。因为NpCyP1,NpCyP2和NpCyP3可以成功区分滑液标本,我们旨在执行高通量分析获取相关研究数据,研究蛋白酶活动之间的关系和临床疾病的生物标记物的活动。
图2。荧光MMP的基质(NpCyP1、NpCyP2 NpCyP3)随着时间的推移,滑液-图代表NpCyP1的荧光比率(蓝色),NpCyP2(灰色)和NpCyP3(红色)随着时间的推移在滑液。四个代表图表显示不同的荧光反应在四个不同的滑液样本。患者伴有胫骨骨折(一)、骨关节炎(B)、类风湿性关节炎(C)和痛风(D)。错误禁止显示平均数标准误差值获得试验重复3次时,和误差太小在面板(一)。表显示了斯皮尔曼相关系数(ρ),双尾意义(P)和样本大小(N)(E)。变量有显著的相关性(p< 0.05)以粗体表示。(*星号标记重要的关联p< 0.05,* *p< 0.01)。细胞的颜色编码,蓝色的强度与弱(0.2 - -0.4),中等(0.4 - -0.6),强大的(0.6 - -0.8)或很强(0.8 - 1)相关性。
初始速率和最终的比例被用于随后的相关分析。总的来说,我们发现,初始速率可以更精细区分滑液标本,显示更大的动态范围比最后三个探针荧光比率(补充表S2)。这些差异的动态范围很可能因为初始速率可以更好的区分弱和高活性标本,而最后的比率反应的终点是相似的(图2 c, D)。
总体而言,单个探测器获得的结果高度相关(补充表S3)。NpCyP1和NpCyP3是最密切相关的,符合他们对MMP-3报道高反应活性(埃克哈特·et al ., 2016),这是最常见的生物标志物研究关节炎(所以et al ., 1999;埃克哈特·et al ., 2016;Lerner et al ., 2018)。
为了确定探测器能否区分轻微和严重形式的侵蚀性的疾病,我们检查了之间的相关性为对照的探针和生物标志物的疾病活动。主要观察之间具有很强的相关性之间的探针反应和局部炎症标记物,而主要是温和的探针反应之间的相关性观察和局部炎症标记物(图2 d)。NpCyP1和NpCyP3显示较强的相关性相比,炎症生物标记NpCyP2,MMP-3符合他们的高反应活性,研究生物标志物的关节炎(所以et al ., 1999;埃克哈特·et al ., 2016;Lerner et al ., 2018)。
最终,化验结果显著相关疾病活动的关键生物标志物包括滑膜白细胞和变形计算(ρ= 0.433 - -0.716),和c反应蛋白(NpCyP1ρ= 0.545,0.449,0.524,2,和3)。有趣的是,只有弱到中度炎症生化标记物的本身之间的相关性(补充表S4, S5),证实了我们的猜测,仅依赖炎症标记物诊断可能并不总是准确的,并证明需要探索替代生物标志物。我们使用线性判别分析(LDA)在我们的临床病人数据来决定是否添加数据从我们的MMP的探测可以提高诊断和预后的准确性。
LDA是一种多元统计方法,可以用来找到特征线性组合或单独的数据类:在这种情况下,风湿病的诊断条件。一个更小的子集的原始66标本用于LDA,这些情况下包含完整的临床数据。这些33标本,13个水晶关节炎的诊断条件(包括痛风和假性痛风),8类风湿性关节炎的诊断(包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎和类风湿性关节炎的原因不明),3有骨关节炎的诊断和9标本相结合的诊断或不确定的诊断。LDA的第一个应用程序旨在区分晶体关节炎、类风湿性关节炎和骨关节炎病例(组合和不确定诊断是不习惯在判别分析)仅使用临床血液测试数据。这给了79.2%的准确率,分析降至62.5%交叉验证测试(补充表S6)。
在下LDA测试,临床滑液数据(白细胞、红细胞、多晶型物,单核细胞,尿酸焦磷酸和钙沉积(CPPD))作为输入数据,而不是血液测试结果如c反应蛋白。这组输入数据产生一个非常相似的初始分类和诊断的准确性79.2% 75.0% leave-one-one交叉验证测试(图3 b,补充表S7)。令人鼓舞的是,当我们增加了利率和比率从MMP探针测定滑液临床测试数据集,分类精度(旨在70.8%)上升至91.7% (补充表S8)。此外,LDA分数对前三个判别函数的可视化显示了优越的集群相比,测试执行单独使用血液检测或临床滑液测试(图3)。
图3。LDA得分情节与诊断区分标本水晶关节炎(n= 13),炎症性关节炎(n= 8)和骨关节炎(n= 3)只使用血液检测的临床数据(一),滑液临床数据(B)和滑液的临床数据和MMP探针测定数据(C)。
在一般情况下,交叉验证精度,我们取得了LDA符合这些观察到的样本集的大小。LDA性能随样本容量,因此在未来更大的临床试验预计将给初始和交叉验证精度接近100% (米切尔et al ., 2021)。91.7%的准确率使用组合滑液的临床试验和MMP的调查分析结果超过原始使用c反应蛋白和其他血液检测结果的准确性。因此,蛋白质代理测量,如我们的MMP的调查分析,都是有用的工具,以提高诊断的准确性仅在滑液,阻碍了需要收集体液,如血液。
结论
我们有建立和展示设计,新颖的比率荧光探针的合成和应用程序测量和滑液MMP的活动进行调查。有潜力分析报告应用作为一个辅助疾病活动的标志,因为它能够区分轻微和严重的关节炎通过其传统疾病的生物标志物显著相关活动(CRP、ESR、“和滑膜多形核的细胞)。此外,LDA用于显示我们的分析可以提供有价值的诊断信息,特别是在标准的标记,如c反应蛋白的情况下缺席。探测器的设计灵敏度最大化的目标,这是通过reaction-based放大荧光信号的一个酶可以将许多基质。此外,定量比较样本是可能的,因为开花率提供了内部标准化控制变量,可以改变单一波长的荧光强度,如样品浊度、探针浓度和工具性变异。因此ratiometricity和reaction-based信号放大是可取的属性,和这样的调查可能的应用使快速的发展,高吞吐量和方便的化验,有可能被应用在临床诊断设置。由于MMP的活动是其他疾病如癌症的特性(Vihinen Kahari, 2002)、青光眼(刚刚et al ., 2017)、多发性硬化(基质金属蛋白酶9在多发性硬化疾病活动的标志,2006年)和酒精性肝病(Prystupa et al ., 2015),可以想象这些或衍生品的使用探针广泛的其他临床应用。
是功能蛋白质组学的发展进步,我们更有可能发现更广泛的enzyme-based疾病生物标志物,为后续设计合理的诊断工具展示的机会。同时介绍一个例子,新开发的探针应用于感觉蛋白酶活动侵蚀关节疾病的背景下,这是未来潜在的进一步研究和构建比率计基质为其他酶生物标志物。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
道德声明
研究涉及人类受试者进行审核和批准通过西悉尼当地卫生区人类研究伦理委员会。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。
作者的贡献
肯塔基州、纳米和概念化的研究。肯塔基州合成探针,进行光谱研究。KP收集患者样本,包括临床和实验室参数的集合。在进行相关分析,AB LDA执行。肯塔基州和KP写的手稿。AB、纳米和EN编辑了手稿。
确认
作者要感谢Westpac学者研究基金会奖学金(EN),飙升的悉尼大学奖学金(EN),悉尼大学的商业发展和产业合作发展格兰特(EN和海里),澳大利亚政府为研究训练计划奖学金(肯塔基州和AB),和悉尼大学纳米研究所研究生补充奖学金(肯塔基州),布鲁斯Veness钱德勒在食品化学研究支持奖学金(肯塔基州),副校长研究奖学金(肯塔基州)和亨利·伯蒂和佛罗伦萨梅布尔Gritton获得者颁奖(AB)。作者承认科学和技术援助的设施和悉尼分析,悉尼大学的一个核心研发中心。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fsens.2022.970921/full补充材料
参考
Alasaarela E。Suramo,我。,Tervonen, O., Lahde, S., Taklo, R., Hakala, M., et al. (1998). Evaluation of humeral head erosions in rheumatoid arthritis: A comparison of ultrasonography, magnetic resonance imaging, computed tomography and plain radiography’,英国风湿病学杂志》上的。Br。j . Rheumatol。37 (11),1152 - 1156。doi: 10.1093 /风湿病学/ 37.11.1152
布雷,C。,Bell, L. N., Liang, H., Haykal, R., Kaiksow, F., Mazza, J. J., et al. (2016). Erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein measurements and their relevance in clinical medicine.威斯康星州。地中海。J。115 (6),317 - 321。
Burrage, p S。混合,k . S。,和Brinckerhoff, C. E. (2006). Matrix metalloproteinases: Role in arthritis.前面。Biosci。11日,529 - 543。doi: 10.2741/1817
楚,c R。,Williams, A. A., Coyle, C. H., and Bowers, M. E. (2012). Early diagnosis to enable early treatment of pre-osteoarthritis.关节炎研究》。14(3),212年。doi: 10.1186 / ar3845
Crockson, r。,Crockson, A. P., and McConkey, B. (1977). Rheumatoid arthritis: Relation of serum C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rates to radiographic changes.Br地中海j . Br。地中海。j .出版。集团1 (6055),195 - 197。doi: 10.1136 / BMJ.1.6055.195
Døhn, M。,Ejbjerg, B. J., Court-Payen, M., Hasselquist, M., Narvestad, E., Szkudlarek, M., et al. (2006). Are bone erosions detected by magnetic resonance imaging and ultrasonography true erosions? A comparison with computed tomography in rheumatoid arthritis metacarpophalangeal joints.关节炎研究》。8 (4),R110。doi: 10.1186 / ar1995
埃克哈特·U。,Huesgen, P. F., Schilling, O., Bellac, C. L., Butler, G. S., Cox, J. H., et al. (2016). Active site specificity profiling of the matrix metalloproteinase family: Proteomic identification of 4300 cleavage sites by nine MMPs explored with structural and synthetic peptide cleavage analyses.矩阵杂志。49岁的37-60。doi: 10.1016 / j.matbio.2015.09.003
Heidari对伊朗伊斯兰共和国通讯社表示,b (2011)。类风湿性关节炎:早期诊断和治疗结果。比赛。j .实习生。地中海。2 (1),161 - 170。可以在:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24024009。
勒纳。,Neidhofer, S., Reuter, S., and Matthias, T. (2018). MMP3 is a reliable marker for disease activity, radiological monitoring, disease outcome predictability, and therapeutic response in rheumatoid arthritis’,临床风湿病学最佳实践与研究。最好的。Pract。中国>,Rheumatol。32 (4),550 - 562。doi: 10.1016 / J.BERH.2019.01.006
米切尔,L。沈,C。,Timmins, H. C., Park, S. B., and New, J. E. (2021). A versatile fluorescent sensor array for platinum anticancer drug detection in biological fluids.ACS传感器。点。化学。Soc。6 (3),1261 - 1269。doi: 10.1021 / ACSSENSORS.0C02553 / SUPPL_FILE / SE0C02553_SI_001.PDF
奥尔,c K。,Young, F., McGarry, T., Binickea, M., Fearon, U., Veale, D. J., et al. (2018). The utility and limitations of CRP, ESR and DAS28-CRP in appraising disease activity in rheumatoid arthritis.前面。地中海。5(6月),185。doi: 10.3389 / FMED.2018.00185 /助理
Prystupa,。,Boguszewska-Czubara, A., Bojarska-Junak, A., and Toruń-Jurkowska, A. (2015). Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland.安。阿格利司。环绕。地中海。22 (2),325 - 328。doi: 10.5604/12321966.1152088
Rengel Y。,Ospelt, C., and Gay, S. (2007). Proteinases in the joint: Clinical relevance of proteinases in joint destruction’,关节炎研究和治疗。关节炎研究》。9(5),221年。doi: 10.1186 / AR2304
萨哈,a K。,和Kohles, S. S. (2012). A cell-matrix model of anabolic and catabolic dynamics during cartilage biomolecule regulation’,国际计算机在医疗杂志》上。Int。j .第一版。Healthc。1 (3),214。doi: 10.1504 / ijcih.2012.046995
刚刚P。饶,。,Padhy, D., Sarangi, S., Das, G., Reddy, M. M., et al. (2017). Functional activity of matrix metalloproteinases 2 and 9 in tears of patients with glaucoma’,调查眼科及视觉科学。投资。角膜切削。粘度科学。BIO106-BIO113 58 (6)。doi: 10.1167 / iovs.17 - 21723
沈,R。,和Qian, Y. (2019). A mitochondria-oriented fluorescent probe for ultrafast and ratiometric detection of HSO3− based on naphthalimide–hemicyanine’,新化学杂志。新的j .化学。43 (20),7606 - 7612。doi: 10.1039 / C9NJ01467E
沈,R。,和Qian, Y. (2020). A novel ratiometric fluorescent probe for specific detection of HSO3- at nanomolar level through 1, 4-Michael addition.j . Photochem。Photobiol。一个化学。387年,112110年。doi: 10.1016 / J.JPHOTOCHEM.2019.112110
所以,一个。,Chamot, A. M., Peclat, V., and Gerster, J. C. (1999). Serum MMP-3 in rheumatoid arthritis: Correlation with systemic inflammation but not with erosive status.风湿病学38 (5),407 - 410。doi: 10.1093 /风湿病学/ 38.5.407
关键词:比率荧光传感器、人工基质、诊断数组,基质金属蛋白酶,风湿病的条件
引用:杨K, Pavic K,鲍耶AA, Manolios N和新EJ(2022)补充侵蚀关节疾病的临床诊断与仿生比率计传感器。前面。Sens。3:970921。doi: 10.3389 / fsens.2022.970921
收到:2022年6月17日;接受:2022年7月29日;
发表:2022年8月23日。
编辑:
俊杰朱、南京大学、中国版权©2022杨,Pavic,鲍耶,Manolios和新。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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