原始研究的文章

前面。Urol。,22March 2023
秒。Neurourology、行为泌尿外科和尿动态
卷3 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fruro.2023.1079790

应激症状恶化:压力增加排尿频率、体细胞敏感性,和膀胱炎症时结合低浓度环磷酰胺治疗小鼠

比阿特丽斯·m·吉拉德,

苏珊·e·坎贝尔和

玛格丽特·a·Vizzard ^*

学医学院的佛蒙特大学神经科学系的,伯灵顿佛蒙特,美国

症状恶化由于压力是普遍在许多疾病,包括膀胱功能障碍(如膀胱过动症(OAB)、间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC / BPS));然而,机制强调排尿反射功能的影响尚不清楚。在这项研究中我们设计和评估应激症状恶化(SISE)小鼠模型,表明增加尿频和体细胞(骨盆和hindpaw)敏感。环磷酰胺(CYP)(35毫克/公斤;i.p。,every 48 hours for a total of 4 doses) or 7 days of repeated variate stress (RVS) did not alter urinary bladder function or somatic sensitivity; however, both CYP alone and RVS alone significantly (p ≤ 0.01) decreased weight gain and increased serum corticosterone. CYP treatment when combined with RVS for 7 days (CYP+RVS) significantly (p ≤ 0.01) increased serum corticosterone, urinary frequency and somatic sensitivity and decreased weight gain. CYP+RVS exposure in mice significantly (p ≤ 0.01) increased (2.6-fold) voiding frequency as we determined using conscious, open-outlet cystometry. CYP+RVS significantly (p ≤ 0.05) increased baseline, threshold, and peak micturition pressures. We also evaluated the expression of NGF, BDNF, CXC chemokines and IL-6 in urinary bladder in CYP alone, RVS alone and CYP+RVS mouse cohorts. Although all treatments or exposures increased urinary bladder NGF, BDNF, CXC and IL-6 content, CYP+RVS produced the largest increase in all inflammatory mediators examined. These results demonstrated that CYP alone or RVS alone creates a change in the inflammatory environment of the urinary bladder but does not result in a change in bladder function or somatic sensitivity until CYP is combined with RVS (CYP+RVS). The SISE model of CYP+RVS will be useful to develop testable hypotheses addressing underlying mechanisms where psychological stress exacerbates symptoms in functional bladder disorders leading to identification of targets and potential treatments.

1介绍

动物模型用于镜子间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC / BPS)病理生理学增加我们理解底层机制和识别潜在的治疗干预措施的目标。降低患者尿路(附近地区)疾病报告严重的症状在压力(1,2)。压力可能导致恶化和可能附近地区的发展障碍包括IC / BPS和膀胱过动症(OAB) (3- - - - - -6)。大部分IC / BPS恶化症状的患者报告的临床压力(6- - - - - -8),实验应力增加膀胱疼痛和紧迫性(9)。患者泌尿道的慢性骨盆疼痛综合征(UCPPS)一生方面表现出更大的压力和广泛的疼痛症状和更少的弹性和应对机制(10)。

动物模型的压力表明膀胱功能障碍的症状(例如,增加排尿频率,痛苦)以及焦虑行为(3部分),可能是由于肾上腺(HPA)轴的失调。患者膀胱功能障碍疾病可能HPA轴异常,和压力可能导致增加的膀胱症状(1,2)。虽然压力可能加剧附近地区症状,病理生理学的底层的开发和发展压力尿频和骨盆疼痛仍然是未知的。

症状恶化,通常被称为耀斑,患者IC / BPS承认,由于多个触发器,包括感染、饮食、身体活动、性活动,过敏,和压力(6,11- - - - - -13)。(15 - 95%)比例IC / BPS耀斑不同患者(6,11- - - - - -13)。尽管耀斑不同的持续时间、频率、强度和类型的症状,耀斑是麻烦的,颠覆性,增加骨盆疼痛和泌尿道的症状(6,11- - - - - -13)。很少有研究解决IC / BPS患者症状耀斑和基础研究调查的耀斑受阻缺乏动物模型,模拟症状耀斑对哪一个可以开发可测试的假设(6,11- - - - - -13)。

在这项研究中,我们描述了初步鉴定小鼠模型,管理环磷酰胺(CYP)(35毫克/公斤;i.p。,every 48 hours for a total of 4 doses) when combined with 7 days of stressor presentation results in increased voiding frequency and increased somatic sensitivity. Neither the administration of CYP or the 7 days of repeated variate stress (RVS) (14- - - - - -17)单独增加排尿频率或C57Bl / 6小鼠体细胞敏感性。我们称这只老鼠模型作为应激症状恶化(SISE)小鼠模型。在本文中,我们描述我们SISE模型的描述,包括膀胱功能和意识,开放出口连续cystometry与冯·弗雷丝体细胞敏感性测试。我们也检查了皮质甾酮表达式,和炎症介质的表达包括神经营养因子(神经生长因子(BDNF) (18- - - - - -20.),趋化因子(科学家)和白细胞介素- 6 (il - 6) (18,21- - - - - -34膀胱)表达式。这些初步结果表明CYP独自,或独自旅游房车中产生一个变化的炎性环境膀胱和系统性皮质甾酮增加表达但并不导致膀胱功能的改变或体细胞敏感性直到CYP结合旅游房车(CYP +旅游房车)。

2方法

2.1动物

女性C57BL / 6野生型小鼠(WT)用于本研究培育本地大学学医学院的佛蒙特州。保持多样性在这个殖民地,老鼠(C57BL / 6 j)也从杰克逊实验室和购买纳入繁殖。窝是平均大小(6 - 8小狗),体重,和活动(进食、饮酒、行为)和一致性在雄性和雌性小鼠的整体比例。UVM机构动物保健和使用委员会批准了所有实验动物的使用有关的协议(IACUC # x9 - 020)。动物保健的监督下UVM动物保健管理办公室按照实验动物保健的评估和认证协会(AAALAC)和美国国立卫生研究院(NIH)的指导方针。我们使用雌性老鼠因为IC / BPS(女性居多的24,35,36)。发情周期状态不确定在这些研究老鼠。所有的努力都是尽量减少潜在的动物痛苦,压力,或痛苦。单独的组同窝出生仔畜WT被用于以下实验。老鼠被随机分配到控制、CYP旅游房车或CYP +旅游房车组(N = 8)断奶后,体重每日(图1)。从3 - 5窝军团的老鼠。

图1

图1实验军团和实验结果。概述研究使用控制(C57Bl / 6)老鼠(处理和回到家里笼),老鼠用环磷酰胺治疗(CYP),小鼠暴露于重复变量压力(旅游房车),或小鼠暴露于CYP +旅游房车。主要措施以本研究结果:膀胱功能和被称为体细胞敏感性的骨盆和hindpaw。组织当前和未来的研究也收获。旅游房车协议(7天)由5个不同的压力与小说压力每天交付(见方法更多细节包括压力持续时间)(14,37- - - - - -39)。游泳和脚冲击压力是重复的最后两天的旅游房车。秒秒;DRG,背根神经节。

2.1.1 CYP-induced膀胱炎

老鼠每治疗组(N = 8日)收到环磷酰胺(CYP)(35毫克/公斤每48小时总共4注射)腹腔内(i.p)创建一个小鼠模型,并没有表现出膀胱或躯体的变化函数没有旅游房车(图1)(表1)。CYP丙烯醛代谢,刺激排出尿液中(40- - - - - -42)。小鼠注射进行麻醉与异氟烷(3%)。对照组没有收到CYP治疗。CYP单独和CYP +旅游房车组织收到的相同剂量和频率管理这里描述。

表1

表1时间表的剂量CYP时间表和接触压力,买房购车减税或CYP +旅游房车小鼠组。

2.1.2重复变量压力

老鼠分配给旅游房车集团(以下旅游房车老鼠)或CYP +旅游房车(以下简称CYP +旅游房车老鼠)集团暴露在7天一个压力源的压力之间在每天9如前所述am-12点(14,15,37,38)(图1)。控制老鼠(没有压力或CYP)处理日常和留在家里的笼子里的动物设施后称重。振荡压力:老鼠放在一个塑料箱25×16×13厘米(L×W×H),这是固定在一个临床旋转(费舍尔科学,莫里斯平原,新泽西),策略在低到中等速度30分钟(min)。强迫游泳:老鼠放在一个圆柱形容器29日×37厘米(D×H)充满了室温水深度,防止尾部触摸底部的容器。监控游泳5分钟后,老鼠放在一个控股室前30分钟回到家里笼。电电击:老鼠被放置在一个有机玻璃反射室(VT)的地中海Associates圣奥尔本斯30×25×35厘米(L×W×H)。5分钟后适应时期,两个0.2,5秒(s)炒足电击是通过网格地板1分钟inter-trial间隔。约束:老鼠放在一个圆柱形抑制设备30×115毫米(D×L) 60分钟。基座:老鼠放在一个高架(60厘米)平台20×20厘米(L×W) 30分钟。强迫游泳和电电击2压力重复6天(D)和D7 (表1;图1)。

2.1.3 CYP +旅游房车

老鼠每治疗组(N = 8日)收到环磷酰胺(CYP)(35毫克/公斤每48小时总共4注射)(天(D) 1 D3 D5和D7) (图1,表1)腹腔内(i.p)创建一个小鼠模型,并没有表现出的膀胱或躯体功能的变化缺乏旅游房车。CYP剂量时间表(表1)是结合每日(D1-D7)暴露在各种压力(图1上面描述)。在试验研究中,我们评估不同剂量的CYP(30日,15日,25日35毫克/公斤)在同一给药频率,当结合旅游房车将导致增加排尿的频率。CYP剂量的频率和持续时间的旅游房车协议改变。腹腔内注射CYP(35毫克/公斤;每48小时总共4剂量)结合7天旅游房车在雌性老鼠最一致的增加导致排尿的频率。

2.2意识,打开出口,不断填补cystometry

在D7,老鼠在所有治疗组(N = 8为每个:控制、CYP旅游房车,CYP +旅游房车)与异氟烷麻醉O (3 - 4%) 100%₂,较低的中线切口,聚乙烯管(PE-10,粘土亚当斯,日前,新泽西州)被插入膀胱圆顶和担保尼龙财政的缝合(6-zero) (14,43- - - - - -45)。结束的PE管材热爆发,但导管没有延伸到膀胱或颈部,并不是与炎症或改变cystometric函数(14,43- - - - - -45)。油管的远端密封,皮下隧道,和外部化的颈部(14,43- - - - - -45)。腹部和颈部切口关闭与尼龙缝线(6)。老鼠接受术后止痛剂(5.0毫克/公斤,皮下carprofen两天一天一次)和从生存中恢复手术执行cystometry前48小时。老鼠笼子回到家,没有压力或CYP政府发生剩余2天的协议(表1)。

cystometry,有意识的,放纵的老鼠被放置在一个树脂玻璃笼线底部。开始之前的录音,膀胱被清空,导管连接通过一个丁字管压力传感器(草模型PT300,西沃里克,RI)和显微镜下注射泵(哈佛装置22日南纳蒂克,MA)。小动物实验室Cystometry站(地中海Associates费尔法克斯VT)是用于尿动态测量(14,43- - - - - -45)。盐溶液在室温下注入到膀胱25µl /分钟的速度引起重复膀胱收缩。至少六个可再生的排尿周期记录后的初始稳定时间25 - 30分钟(14,43- - - - - -45)。以下cystometric参数记录在每只动物:基线压力(压力在膀胱充盈的开始),阈值压力(膀胱压力立即排尿前),排尿峰值压力,intercontraction间隔(ICI;时间排尿事件之间),注入体积(IV),孔隙体积(VV) (14,43- - - - - -45)。老鼠在这些研究中残余体积小于10μl。在实验的结论,老鼠是安乐死(5%异氟烷+胸廓切开术)。实验相似的时候一天(9点-12点),以避免昼夜变化的可能性是负责膀胱容量测量的变化(14,43- - - - - -45)。个体治疗失明或一组分析了cystometric数据;组解码后的数据分析。

2.3排除标准

老鼠从研究不良事件发生时,包括显著的术后事件,嗜睡,疼痛或痛苦不是由我们IACUC-approved方案缓解术后止痛剂(14,43- - - - - -45)。此外,行为动作等修饰,站立,行走,排便呈现膀胱压力记录这些事件期间无法使用。总数的大约10%的老鼠致力于这些研究被研究。

2.4机械敏感性测试

提到(二级)测量了痛觉过敏测试的频率戒断反应的应用校准·冯·弗雷单丝腹部(14,43- - - - - -45)区域覆盖膀胱+和hindpaw耻骨弓上的区域。老鼠回到家的笼子里,每天都重,但并没有压力或CYP政府发生剩余2天的协议(表1前体细胞敏感性测试。单独的组(N = 10)的老鼠进行评估:控制、CYP、旅游房车,CYP +旅游房车。执行机械敏感性评估使用·冯·弗雷单丝(Stoelting、木材Dale, IL)与0.1 4 g的力量应用于骨盆区域(14,43- - - - - -45)。后评估的机械灵敏度hindpaw以相同的方式如前所述(14,43- - - - - -45)。测试的足底hindpaw区域和下腹部区域是由垂直应用·冯·弗雷细丝,直到头发稍微弯曲。首先在老鼠的习惯在一个清晰的丙烯酸测试室为20分钟/天4天前开始CYP的旅游房车或CYP +旅游房车治疗或处理(控制),风机产生环境噪声。天的测试(D9) (表1),老鼠被放置在丙烯酸测试室的金属网地板(IITC生命科学公司,林地,CA)又习惯了10分钟之前冯·弗雷丝的应用在一个上下方法1 - 3 s和最低interstimulus间隔2分钟(14,43- - - - - -45)。以下行为被认为是积极的反应刺激骨盆:急剧的收缩腹部,跳跃,或直接舔或抓骨盆区(14,43- - - - - -45)。积极应对hindpaw刺激大幅撤军的爪子或者舔hindpaw测试(14,43- - - - - -46)。盲法的方式执行所有体细胞测试。组解码后的数据分析。单独的群老鼠用于cystometry和体细胞敏感性测试,以避免任何潜在的干扰事件的腹部切口。

2.5安乐死和组织收割

雌性老鼠深感与异氟烷麻醉(5%)的100%₂,从腹主动脉血收集(见下文),膀胱解剖小鼠安乐死通过开胸。膀胱很快snap-frozen在干冰前处理(47)。此外,一些老鼠尿膀胱被用来确定低浓度(35毫克/公斤)产生的CYP膀胱炎症变化。尿膀胱是收获,沿中线剪,打开了,钉在Sylgard-coated盘子和拍照。固定膀胱被准备组织切片(15µm)、H + E染色和brightfield显微镜(奥林巴斯BX40)如前所述20.,41)。

2.6测量膀胱神经生长因子、脑源性神经营养因子CXCL9, CXCL10, il - 6表达和血清皮质甾酮

我们确定血清皮质甾酮从控制、CYP旅游房车和CYP +旅游房车老鼠(N = 8)使用elisa (ADI高900还是097年在恩佐生命科学、法明岱尔,纽约)(14)。安乐死在D9(时表1),从腹主动脉血血清中收集管9 am-12点之间,允许为1小时在室温下凝结。样本在埃普多夫5415 r离心机离心10分钟10000 rpm。血清整除和冻结在−20°C到分析。我们确定神经生长因子、脑源性神经营养因子,il - 6和科学家(CXCL9 CXCL10)蛋白质含量的膀胱控制,CYP、旅游房车和CYP +旅游房车治疗组(N = 8)使用elisa (Promega,麦迪逊,WI和研发系统,明尼阿波利斯,MN)如前所述(18,19,31日,32,48)。根据制造商,神经生长因子E-max或BDNF E-max免疫分析系统(Promega,麦迪逊,WI)演示非常低的大与结构有关的生长因子。我们最近(20.)确定膀胱神经生长因子表达在不同的实验条件和比较结果与Promega Biosensis (Biosensis、Thebarton SA、澳大利亚)包,发现结果之间没有统计学差异。根据制造商,没有明显大或干扰观测与其他细胞因子和趋化因子与任何Quantikine M免疫(研发系统、明尼阿波利斯、MN)用于本研究il - 6或科学家检测。这些系统提供的标准生成的线性标准曲线(R²= 0.996 - -0.998,p≤0.001)。分标准和样品的吸光度值修正的背景值(吸光度由于非特异性结合)。没有稀释样品,所有样品吸光度值在标准曲线的线性部分。曲线拟合的标准和评价神经生长因子、脑源性神经营养因子,科学家,il - 6或皮质甾酮使用最小二乘匹配样本内容执行。

2.7统计分析

所有的值代表的意思是±SEM。正常的数据验证了使用D 'Agostino-Pearson正常测试(GraphPad棱镜)。比较实验人群都是采用方差分析(方差分析),重复测量方差分析,成对或未配对t测试在适当的地方。野生统计超过临界值时α= 0.05,Sidak的多个对比测试是用来比较的意思。

3的结果

3.1体重下降,血清皮质甾酮增加小鼠暴露于CYP,旅游房车或CYP +旅游房车

CYP、旅游房车或CYP +旅游房车显著(p≤0.01)减少体重仅在老鼠CYP的第四天,旅游房车单独或结合CYP +旅游房车协议(图2一个)。显著(p≤0.01)体重减少维护整个研究(9天)协议(图2一个)。CYP,房车旅游房车或CYP +旅游房车,房车可以显著增加(p≤0.01)血清皮质甾酮测量9天来控制老鼠相比(处理)(图2 b);然而,增加的大小随治疗。结合CYP +数量增加最多的旅游房车治疗导致血清皮质酮(4.5倍),其次是增加造成独自旅游房车(3.7倍)或单独CYP(2.1倍)(图2 b)。

图2

图2控制、CYP旅游房车或CYP +旅游房车影响血清皮质甾酮,和体重(一)小鼠体重的变化超过9天老鼠控制CYP、旅游房车或CYP +旅游房车军团。从第四天开始和持久的研究持续了9天,老鼠CYP的旅游房车,或CYP +旅游房车军团相比控制老鼠体重增加方面表现出显著的衰减。身体重量显著(p≤0.01)减少CYP、旅游房车或CYP +旅游房车小鼠组织从第4 - 9天。(B)血清皮质甾酮CYP显著增加(p≤0.01),旅游房车或CYP +旅游房车小鼠组接触测量研究的9天时间。CYP +旅游房车组的小鼠表现出最大的(4.5倍)增加血清皮质甾酮相比CYP(2.1倍)或旅游房车(3.7倍)单独组。B:样本大小n = 8。值意味着±SEM。* p≤0.01。

3.2移行细胞瘀斑的小鼠的出血和移行细胞侵蚀CYP对待

我们以前演示了膀胱炎症变化在啮齿动物中处理腹腔内CYP使用时的浓度为75毫克/公斤的频率的治疗每48 - 72小时(8 - 10天41,49)。在最近的研究中,我们对小鼠腹腔内CYP在降低浓度(35毫克/公斤)管理每48小时7天。尿膀胱是从小鼠治疗证据显示CYP瘀斑的出血移行细胞表面(图3 a - c移行细胞)以及地区水土流失和泌尿道上皮细胞脱落在组织部分控制老鼠相比。移行细胞的侵蚀和崩塌的膀胱上皮完整的地区也被观察到(图3 e)。相比之下,膀胱的控制整个的老鼠表现出完整的膀胱上皮组织部分(图3 d)。

图3

图3从老鼠尿膀胱处理低浓度CYP(35毫克/公斤,i.p。,every 48 hours for 7 days) exhibit urothelial petechial hemorrhages and erosion.(A, B)生产总值(gdp)从控制膀胱的图像(一)和CYP-treated老鼠(B)。从CYP-treated小鼠膀胱(B)移行细胞表面出现瘀斑的出血控制老鼠相比(一)。的矩形区域B扩大在C强调区域的瘀点(箭头)。控制膀胱(一),有一个垂直扩展、大血管(*)。(D, E)H + E染色在膀胱部分(10µm)控制(D)和CYP-treated老鼠(E)。在CYP-treated老鼠,膀胱尿道上皮部分展览地区侵蚀(E、支架)和移行细胞细胞脱落(E箭头)。控制老鼠,尿道上皮是完好无损(D)。校准酒吧里B代表:1.5毫米a - b,0.6毫米C100µmD、E。

3.3膀胱神经生长因子、脑源性神经营养因子表达增加小鼠暴露于CYP、旅游房车或CYP +旅游房车

CYP独自旅游房车单独或结合CYP +旅游房车显著(p≤0.01)增加整个膀胱神经生长因子在老鼠身上测试7天的旅游房车范例(图4)。虽然膀胱神经生长因子表达增加与CYP独自(2.8倍)和独自旅游房车(3.1倍)协议,最大的增加(8.1倍)膀胱神经生长因子表达了后结合CYP +旅游房车协议(图4)。类似的观察是由膀胱BDNF表达结合CYP +旅游房车生产最大的增加(3.3倍)表达相比单独CYP(1.8倍)或单独旅游房车(2.3倍)协议(图4)。基线BDNF膀胱表达式大于神经生长因子的表达,但膀胱神经生长因子表达明显(p≤0.01)大于BDNF CYP +旅游房车(后图4)。没有膀胱神经生长因子、脑源性神经营养因子表达之间的差异观察与CYP单独或旅游房车单独协议(图4)。

图4

图4增加神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达与CYP膀胱,旅游房车或CYP +旅游房车。基底膀胱BDNF的表达明显(p≤0.01)大于对照小鼠神经生长因子表达式。CYP、旅游房车和CYP +旅游房车显著(p≤0.01)增加神经生长因子和BDNF膀胱表达式。CYP +旅游房车诱导的神经生长因子、脑源性神经营养因子的增加膀胱的表情相比,CYP或独自旅游房车。膀胱神经生长因子表达明显(p≤0.01)大于BDNF膀胱表达小鼠暴露于CYP +旅游房车。样本大小n = 8。值意味着±SEM。*或#,p≤0.01。支架和*表示比较神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达。

3.4膀胱科学家和il - 6表达小鼠暴露于CYP增加,旅游房车或CYP +旅游房车

CYP独自旅游房车单独或结合CYP +旅游房车显著(p≤0.01)增加整个膀胱CXCL9 CXCL10表达式(图5一个)。虽然膀胱CXCL9和CXCL10增加表达CYP孤独(2.0 -2.1倍)和独自旅游房车(1.5 -1.8倍)协议,最大的增加,暴露出表达式(2.7 -3.5倍)联合CYP +旅游房车协议(图5一个)。基线(控制),CYP独自一人,独自旅游房车CXCL10膀胱表达明显(p≤0.01)大于CXCL-9表达式;然而,CXCL9之间没有观察到的差异和CXCL10表达式结合CYP +旅游房车治疗(图5一个)。膀胱与结合CYP + il - 6表达最大的旅游房车协议相比单独CYP(3.0倍)或单独旅游房车(2.5倍)治疗方案(图5 b)。

图5

图5增加科学家趋化因子的表达和il - 6与CYP膀胱,旅游房车或CYP +旅游房车。(一)CYP独自旅游房车单独或结合CYP +旅游房车显著(p≤0.01)增加整个膀胱CXCL9 (*, p≤0.01))和CXCL10小鼠(p≤0.01 #)表达式。虽然膀胱CXCL9和CXCL10增加表达CYP孤独(2.0 -2.1倍)和独自旅游房车(1.5 -1.8倍)协议,最大的表达增加(2.7 -3.5倍)证明了结合CYP +旅游房车(一)。基线(控制),CYP独自一人,独自旅游房车CXCL10膀胱表达明显(*,p≤0.01)大于CXCL-9表达式;然而,之间没有差异观察CXCL9 CXCL10表达式和CYP +旅游房车治疗相结合(一)。(B)膀胱il - 6表达明显(* p≤0.01)增加CYP独自一人,独自旅游房车,CYP +旅游房车。膀胱最大的增加il - 6表达了合并后的CYP +旅游房车协议相比单独CYP(3.0倍)或单独旅游房车(2.5倍)治疗方案(B)。样本大小n = 8。值意味着±SEM。*或#,p≤0.01。线,*表示对比CXCL9和CXCL10表达式。

3.5 CYP +旅游房车增加排尿频率和雌性小鼠的功能性膀胱容量减少

在这项研究中,我们选择一个集中的CYP(35毫克/公斤,i.p。)和单独管理,当给定的频率,在缺乏旅游房车,并不影响排尿频率(图6 b)与控制(图6)。C57Bl / 6雌性老鼠暴露在7天旅游房车,没有观察到排泄的变化频率与控制(处理)(图6 c)。CYP当加上7天旅游房车,显著增加排尿频率(图6 d)。总结数据证明CYP +旅游房车显著(p≤0.01)功能性膀胱容量减少(2.4倍vs。控制)(注入体积,诱发失效事件)(图7)和显著(p≤0.01)减少了intermicturition间隔(IMI)(2.4倍vs。控制)(增加排尿频率)(图7 b)。膀胱的容量的大小变化(2.2 -2.5倍),IMI(2.1 -2.6倍)CYP +旅游房车队列相似相比,每组(控制、CYP或旅游房车)。没有观察到变化仅在CYP单独或旅游房车军团相比,控制(图7 a, B)。

图6

图6代表膀胱体积录音显示函数注入和膀胱压力在有意识的记录,打开出口cystometry。从控制膀胱功能的录音(一)CYP(35毫克/公斤,i.p。,every 48 hours for 4 total doses),(B)旅游房车(7天),(C)或CYP +旅游房车(7天)。(一)控制老鼠(处理和回到家里笼)膀胱内的注射了生理盐水(0.9%)表现出一个注入体积(IV)引起排尿事件(即所必需的。,就像CYP功能性膀胱容量)(B)独自旅游房车(C)。(D)。CYP +旅游房车的老鼠表现出减少注入体积(IV)需要引起排尿,导致增加排尿频率控制相比,CYP或旅游房车老鼠。从记录cystometrogram时间表是250年代。

图7

图7摘要直方图的功能性膀胱容量(一)(毫升)和intercontraction区间(B)从膀胱功能测试(ICI)测量控制、CYP、旅游房车和CYP +旅游房车老鼠。CYP +旅游房车的老鼠表现出显著(* p≤0.01)减少静脉(一)和这里(B)控制(处理)相比,CYP独自一人,独自旅游房车老鼠。值意味着±SEM。样本大小n = 8;* p≤0.01与控制。秒,年代;毫升,毫升。

3.6 CYP +旅游房车暴露增加基线、阈值和峰值排尿的压力

C57Bl / 6雌性小鼠暴露于CYP +旅游房车显著增加(p≤0.05)基线,阈值和峰值排尿压力(图2)(表2)。在基本没有变化,观察阈值或排尿高峰压力仅在CYP单独或旅游房车军团相比,控制(图2,表2)。

表2

表2膀胱压力(基线阈值,峰值排尿)记录在控制意识cystometry期间,CYP、旅游房车或CYP +旅游房车老鼠。

3.7 CYP +旅游房车增加骨盆和hindpaw体细胞雌性小鼠的敏感性

雌性老鼠暴露在CYP +旅游房车表现出显著(p≤0.01)减少体细胞敏感性骨盆区域(图8)与所有单丝部队评估(0.1到4 g)。雌性老鼠暴露在CYP +旅游房车表现出显著(p≤0.01)减少体细胞敏感性与单丝hindpaw刺激更大的力(0.4 4 g)。控制,CYP单独或独自旅游房车老鼠群表现出类似的体细胞敏感性骨盆区域(图8)和hindpaw (图8 b),所有单丝力量评估(0.1到4 g)。

图8

图8CYP的影响,旅游房车或CYP +旅游房车在骨盆和hindpaw地区敏感性决定使用校准·冯·弗雷细丝。(一)盆腔刺激应用于下腹部区域,包括耻骨弓上的地区,上覆膀胱。CYP +旅游房车(n = 10)的小鼠表现出明显(*,p≤0.01)增加骨盆响应频率与所有·冯·弗雷丝(0.1 4 g)测试控制老鼠相比,CYP或独自旅游房车(n = 10)。(B)CYP +旅游房车(n = 10)的小鼠表现出明显(*,p≤0.01)增加hindpaw响应频率与冯·弗雷丝(0.1 4 g)测试控制老鼠相比,CYP或独自旅游房车(n = 10)。所有体细胞测试被执行。值意味着±SEM。样本大小n = 10;* p≤0.01。

4讨论

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC / BPS)是一种不愉快的感觉(疼痛、压力、不适)被认为是与膀胱、与附近地区的症状持续时间超过6周,如果没有感染或其他可识别的原因(50)。症状恶化(火炬)是常见的有多个,感知触发包括压力。BPS / IC的生活质量所带来的影响是巨大的(51)和太阳耀斑是麻烦的和破坏性的(6,11- - - - - -13)。基础研究调查的太阳耀斑是受到缺乏动物模型(11- - - - - -13)。有效的治疗方法和更大的理解压力的贡献BPS / IC是必要的。

多数(78.4%)的参与者进入一个多学科的方法来研究慢性骨盆疼痛(MAPP)研究(6),评估管理和patient-reported耀斑在IC / BPS表明压力是感知触发耀斑。其他贡献的原因包括特定的食物,身体活动,性交,感染(6)。有趣的是,女性参与者和躯体感觉过敏,各种非饮食因素来达到更有可能报告作为触发器比男性参与者和那些没有过敏(6)。女性参与者(32.1%)报告使用睡眠艾滋病管理IC / BSP耀斑(6)。尽管暗示的睡眠中断/干扰,参与者使用安眠药可能为抗焦虑药属性,符合参与者报告压力作为一个耀斑触发(6)。

很少有研究耀斑触发,解决潜在的机制,管理和治疗方案(6,11- - - - - -13)。当前的研究描述了一个新颖的小鼠模型,管理CYP加7天的压力表示(CYP +旅游房车)导致增加排尿频率和体细胞敏感性增加。然而,无论是CYP单独治疗或仅7天的旅游房车增加排尿频率或C57Bl / 6小鼠体细胞敏感性尽管增加炎症介质(如神经生长因子、脑源性神经营养因子,il - 6,科学家)在膀胱和组织学变化。我们称这只老鼠模型作为应激症状恶化(SISE)小鼠模型。我们的长期目标是使用这个老鼠模型来评估潜在的目标,管理和治疗干预措施当压力因素耀斑。雌性老鼠中的SISE模型演示增加排尿频率和骨盆和hindpaw敏感性增加。尽管在骨盆和hindpaw敏感性增加了之前在一些动物膀胱炎症模型和可能反映了重叠影响膀胱和hindpaw,并非所有膀胱炎症模型(例如,小鼠慢性移行细胞神经生长因子的过度表达,NGF-OE) (44)表现出盆腔和hindpaw敏感度。这将是未来的研究的兴趣评估上肢敏感性以及其他身体影响不同于膀胱的地区。

我们还证明了增加膀胱的炎症介质的表达包括神经营养因子(如神经生长因子、脑源性神经营养因子),趋化因子(科学家)和il - 6表达的膀胱符合大量的文学展示角色炎症介质在临床前动物模型和IC / BPS患者(18,21- - - - - -34)。膀胱神经营养因子(即。,NGF, BDNF), CXCL9, CXCL10 and IL-6 expression was increased in mice with CYP alone, RVS alone and CYP+RVS compared to control mice. In mice treated with CYP alone, the urinary bladders also exhibited physical signs of irritation/inflammation including urothelial erosion, urothelial cell sloughing and petechial hemorrhages. These studies demonstrate that despite no changes in urinary bladder function in mice treated with CYP alone or exposed to RVS (7-day) alone, changes in the urinary bladder inflammatory environment were present. This is consistent with the suggestion that low concentration (35 mg/kg) CYP treatment or RVS (7-day) exposure results in an underlying bladder inflammation that can be exacerbated when CYP and RVS are combined (CYP+RVS) producing changes in bladder function (i.e., increased voiding frequency) and enhanced somatic sensitivity. With the development of this SISE model, we have many follow-up questions that we wish to address including (1): How long do changes in bladder function and somatic sensitivity persist after cessation of CYP+RVS? (2) Can changes in bladder function and somatic sensation be reinstated with CYP or RVS alone? (3) Is 7-day RVS necessary when combined with CYP to elicit changes in bladder function and somatic sensation or can shorter duration RVS produce similar effects?

多种动物模型的压力(例如,包括社会压力(52- - - - - -55),固定压力(56- - - - - -59),避免水压力(60- - - - - -62年足底电击),(63年- - - - - -65年)生产形态、炎症和膀胱功能改变,内脏敏感性类似于IC / BPS的症状和体征。在不同类型的压力,心理社会应激可能是最相关的日常生活。心理社会应激的结果从一个威胁的认知评价(无论是真实的还是想象的),我们的决心,我们可能无法克服,调整或挑战的适应(35,66年- - - - - -71年)。经典,交感神经系统活动HPA轴坐标和皮质醇反应来维持体内平衡(35,66年- - - - - -71年);然而,重复挑战和逆境或无法适当减弱应激反应可能导致mal-adaptations和累积和持续的损害(即。、增加HPA和交感神经反应性;非稳态过载)可以表现各种疾病包括焦虑、抑郁和胃肠道和泌尿道疾病(35,36,66年- - - - - -78年)。

重复变量压力(旅游房车)范式(7天)的老鼠已经被用于研究神经化学表达式在床上核的条痕terminalis (15,17)。这个模型的旅游房车被发现anxiogenic,最有可能介导的神经回路BNST (15,79年- - - - - -82年)。其他动物模型与日常表现相同的压力,旅游房车范式可能更相关的人类日常生活的压力和缺乏适应性,因为小说压力接触。等离子体皮质类固醇激素参与HPA轴由肾上腺分泌的啮齿动物在应激源接触,显著增加(5.2倍)对小鼠(14)和肾上腺重量(37)在大鼠增加旅游房车。我们以前使用的旅游房车协议描述其影响膀胱功能和躯体敏感性大鼠(37,38),PACAP promoter-dependent EGFP BAC转基因小鼠应变(PACAP-EGFP) (14)。旅游房车下降(1)膀胱容量和孔隙体积和增加排尿频率在大鼠和小鼠PACAP-EGFP (14,37)(2);体细胞的敏感性增加hindpaw或骨盆区域在大鼠和小鼠PACAP-EGFP (14,37);和(3)产生炎性环境的变化(如组胺、髓过氧化酶、神经生长因子、趋化因子)在大鼠膀胱(37,38)。应该澄清的是,7天旅游房车协议在大鼠(15,17,82年在特定的转基因小鼠()和14)产生的焦虑行为和排泄功能的变化。然而,从我们的实验室(其他正在进行的研究83年)和其他实验室的研究(S.E. Hammack,个人通信)表明,使用两周旅游房车的协议在C57Bl / 6(野生型)小鼠诱导需要一致的焦虑行为和排泄功能的变化。

神经生长因子已被卷入痛觉受器的边缘敏感(84年- - - - - -86年),导致膀胱感觉功能和发展称为痛觉过敏在膀胱炎症反应(22,44,85年- - - - - -91年)。此外,神经生长因子水平升高已发现在女性的尿和尿膀胱BPS /集成电路(23,28)。静脉管理人性化的神经生长因子单克隆抗体中和(tanezumab) IC / BPS病人证明了概念证明通过提高全球反应评估和减少紧急事件(92年)。BDNF在排尿反射通路也是调节人类和啮齿动物与膀胱炎(93年,94年)由于增加神经生长因子的合成(95年- - - - - -98年)。集成电路/ BPS BDNF减少后患者症状的改善报告(99年)。药理封锁神经生长因子和BDNF在膀胱炎症模型产生互补改善膀胱功能(21,One hundred.,101年)。CYP +旅游房车的老鼠表现出显著的膀胱神经生长因子、脑源性神经营养因子表达。未来的研究是解决神经生长因子和/或BDNF封锁SISE模型来确定影响膀胱功能和躯体的敏感度。

潜在的神经基质,连接心理社会应激的机制和途径改变行为和生理障碍仍不清楚。我们之前用过PACAP-EGFP转基因老鼠地图特定旅游房车后中枢神经系统神经元PACAP人口和/或旅游房车和膀胱功能测试(102年)。膀胱功能测试小鼠暴露于旅游房车的PACAP-EGFP +细胞数量增加腰骶脊髓和背根神经节和脊椎上的位置包括蓝斑,巴林顿的核、延髓腹外侧的髓质PAG,中缝,杏仁核(103年)。这些脊椎上的区域相互连接的HPA轴可能代表一些解剖基质连接压力、膀胱功能和(下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能104年- - - - - -106年)。还需要更多的研究来了解压力或未能减弱压力信号会导致适应不良和累积长期损害,可以表现各种各样的障碍包括膀胱功能障碍(35,66年- - - - - -69年,71年,105年,106年)。之前我们有了改善膀胱功能后膀胱内的PAC1受体拮抗剂的滴剂,PACAP6-38,旅游房车暴露在老鼠身上。目前的研究正在评估的贡献PACAP SISE的模型和相关的受体。

IC / BPS患者表现出下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍和压力水平上升(1,107年)。不正常,或慢性HPA激活与压力和炎症反应,并可能导致特异表达异常交感激活(1,108年,109年),可能导致膀胱功能和躯体感觉的变化。例如,皮下苯肾上腺素诱导体细胞敏感性,增加c-Fos立即早期基因表达在脊髓排尿通路和膀胱过度活跃(110年)。这些变化被选择性α1A-adrenoceptor拮抗剂(即扭转。silodosin),并在TRPV1缺席^{- / -}老鼠。在未来的研究中,我们将评估交感激活当前SISE的参与模型和排尿功能障碍通过确定血清浓度的去甲肾上腺素和肾上腺素的反应。

总之,这些初步结果表明CYP(35毫克/公斤)单独或独自旅游房车中产生一个变化的炎性环境膀胱和系统性皮质甾酮增加表达但并不导致膀胱功能的改变或体细胞敏感性直到CYP结合旅游房车(CYP +旅游房车)。SISE的CYP模式+旅游房车将有用的开发解决根本的假设机制,导致压力的膀胱功能障碍的症状和体征恶化导致新靶点的识别、管理、和潜在的治疗方法。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步调查可以直接到通讯作者/ s。

道德声明

动物研究是审查和批准的佛蒙特大学IACUC。

作者的贡献

MV的构思和设计研究。SC、BG和MV进行实验。SC、BG和MV分析数据。BG和MV解释实验的结果。MV和BG准备数据,起草了手稿。BG、SC和MV编辑和修改手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助5 r01dk120108 1 r01dk124580 MV。

确认

作者欣然承认提供的额外支持细胞和分子的核心部门学医学院神经科学和佛蒙特州综合基因组资源。作者感谢问麦克林托克西莉亚女士的巨大援助与动物保健、处理和观察。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用

1。纳齐夫O,州的JM, Gebhart GF。神经upregulation在间质性膀胱炎。泌尿外科(2007)69 (4):33。doi: 10.1016 / j.urology.2006.08.1108