生物膜生长和微生物污染的牙科单位水线科威特大学牙科中心
贾比尔Hussain阿克巴1,
Maribasappa Karched- 1恢复学系、牙科学院、科威特大学的科威特城,科威特
- 2Bioclinical学系、牙科学院、科威特,科威特,科威特
生物膜的形成在牙科单位水线和由此产生的微生物污染的水系统中已成为一个重要的问题。受污染的水在牙科单位是一个主要的担忧在牙科诊所由于引起感染的潜在风险尤其是老年人和免疫功能低下的患者。本研究的目的是在第一次来确定微生物污染的牙科单位倾斜,然后研究全面消毒协议的效力降低微生物负载。消毒前后水样收集过程从机头和蓄水瓶牙科单位,一个小1厘米油管从每个单元和受到微生物文化在不同的媒体增长。识别主要是通过16 s rRNA基因测序的物种。微生物增长是观察到的所有牙科单位收集的样本中。在消毒过程中,微生物污染水样和油管表面显著降低(P> 0.05)。16 s rRNA基因测序显示属于属的几个物种的存在葡萄球菌,棒状杆菌属和Roseomonas,其中一些涉及人类感染。加重油管表面上的生物膜生长的微生物污染水可以有效地实施适当的控制和常规消毒协议。这可以帮助保护牙科单位工作人员和病人接触感染的风险。
背景
医疗设备内部或表面的生物膜的形成是一个严重的公共卫生问题。几项研究显示,牙科单位水线(DUWL)港口细菌生物膜(1- - - - - -3)。牙科椅相关工具,如3-in-1注射器、空气转子,标量等可能会收到大量的微生物,从而提供一个潜在的感染源将两个实践工作人员和患者处于危险之中。微生物增长multispecies油管生物膜内表面的水。生物膜的基本特性,是他们抵抗渗透通过抗菌药物和生物膜内的细菌比浮游细胞抵抗抗菌素(4,5)。尽管DUWL经常使用消毒剂,生物膜已报告坚持和增殖(6)。因此,一个全面的水和生物膜的微生物分析DUWL DUWL微生物污染的管理至关重要。
微生物附着表面的能力是生物膜的起始和发展的一个关键因素。微生物生长和繁衍在DUWL管的内表面。一旦形成一个成熟的生物膜,它是极其困难的驱逐它由于生物膜耐抗菌素。浮游细菌不断释放这些成熟的生物膜DUWL的水流。殖民DUWL一般非致病性微生物的有氧和异养细菌的环境。然而,有时候,致病性和/或机会性病原体等假单胞菌,军团菌和分枝杆菌物种被发现(7,8)。
牙科单位通常提供制造商建议保持DUWL 3。鲜为人知的文献对这些建议的有效性。此外,没有标准以证据为基础的指导方针,防止DUWL污染。本研究的目的是研究微生物生物膜的内表面上形成DUWL油管,微生物污染的水线,随后评估全面消毒的功效DUWL协议控制微生物的增长。
方法
抽样方法DUWL和随后的微生物分析改编自之前发表的文献(9,10)。
抽样的DUWL
共有12个牙科单位,从12 6,6 KaVo的调查。两个水和生物膜样品收集各单位治疗前后用消毒剂:(1)水线样本一块高速的手送水到病人的口腔治疗期间,(2)样本从源水提供给DUWL,和3)生物膜分析,一块5厘米的DUWL油管。
水样处理使用以下方法:一百毫升水样“(1)”和“(2)”上被收集在无菌烧瓶内含有0.1克硫代硫酸钠(任何残留消毒剂灭活)和运送到口腔微生物实验室立即在冰上。样本过滤Sterifil®无菌系统,0.2µm无菌真空过滤机(微孔)。膜然后用无菌钳取出,放置在一个无菌螺钉帽管包含10毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。生物绑定到膜被大力收集到PBS涡流在最大速度为1 - 2分钟。
生物膜样品收集如下:外部表面DUWL油管与70%乙醇擦拭,大约5厘米的油管使用无菌剪刀剪。油管部分被置于无菌螺钉帽管包含一个小体积的无菌水的标本。样本立即运往实验室在冰上。在无菌条件下油管被切割垂直暴露内表面。浮游细菌non-adherent在PBS被清洗油管部分。使用无菌牙科探针,生物膜形成表面的标本收集在microfuge管1毫升无菌PBS。
完全可行的计数(TVC)水和生物膜样品
水和生物膜微生物文化样本处理30分钟内集合。系列10倍稀释(10−5样本的准备在无菌PBS和镀各种选择性和非选择性培养基。下面的媒体使用:(1)布鲁氏菌血琼脂放线菌spp,链球菌和其他口腔厌氧菌。孵化厌氧(80%的氮、10%的有限公司2在37°C和10%氢)7 - 10天。(2)环境细菌R2A琼脂(11)。有氧孵化在37°C 2 - 3天。(3)与氯氟化碳补充假单胞菌琼脂。在37°C有氧孵化2天。(4)MacConkey II肠道菌的琼脂。在37°C有氧孵化2天。(4)Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)念珠菌。有氧孵化在37°C 2天。
文化控制菌株
确保各种文化媒体和孵化条件合适,大肠杆菌EC49,铜绿假单胞菌PS52,变形链球菌国家反恐怖主义中心的10449年,放线菌naeslundii写明ATCC 12104,白色念珠菌ae - 112培养各自的增长媒体每次当牙科单位样本讲究的。
治疗方案
美国牙科协会建议牙齿的细菌计数单位倾斜的不应超过200 CFU /毫升(12)。的数量高于这个KUDC牙科单位实施综合治疗的水线发表文献中基于建议与一些修改(13)。水在牙科单位存储瓶完全移除和对待Oxygenal 10分钟。牙科单位套管和注射器也泛着红晕Oxygenal根据用户指令。提供每日新鲜蒸馏水,每天剩下的水都被丢弃。剩下的水在倾斜的排水在一天结束的时候。手,一分之三注射器和其他仪器连接到牙科单位水线刷新了5分钟开始每天水线油管中删除任何剩余的细菌。2周后“后处理”样本收集。
扫描电子显微镜
大约1厘米的长度已经纵向切成两半的油管加工了扫描电子显微镜。作品起初固定在3%戊二醛3 1/2 h在室温下,然后转移到缓冲区并将其保持在4°C,直到进一步的处理。油管样本从缓冲区中删除,用纯化水彻底清洗。管被安装在样品持有人。样本然后干完全在一个临界点干燥器,安装在存根与碳双胶带,金色涂布,并存储在一个干燥器直到观察。扫描电子显微镜上的样本检查房子200 (JEOL、日本)。
DNA纯化
基因组DNA从细菌菌落纯化用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA)制造商的指示。短暂,细菌悬浮液处理缓冲和蛋白酶k裂解56°C 1 h。细胞溶解的DNA样本应用到一个旋转列,用洗脱缓冲或无菌水清洗和筛选了对所有样本。这在PCR扩增DNA作为模板。
识别16 s rRNA基因测序的物种
从微生物培养物,两到三个殖民地代表每个群落类型在所有增长媒体选择的菌落PCR鉴定完成16 s rRNA基因测序V4地区紧随其后(描述14)。完成16 s rDNA序列∼1500个基点是使用通用放大转发底漆D88 (5′-GAGAGTTTGATYMTGGCTCAG)和反向引物E94 (5′-GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA)。准备好®PCR珠子被用于PCR扩增。在95°C初始变性后10分钟,30 95°C的周期为1分钟,50°C 30年代和72°C运行30年代之后,最后一个伸长的72°C 5分钟。小整除的PCR产品首次证实1%的琼脂糖凝胶和其余纯化使用QiaQuick®PCR净化旋转列(试剂盒)。纯化扩增子被使用primersF17测序和B34 BigDye终结者®工具在贝克曼库尔特CEQ8000音序器。获得序列数据被用于在NCBI BLAST相似性搜索。
统计分析
细菌数量是对数转换后所有数据处理加1 0。正常的测试的数据偏态和峰态值,夏皮罗威尔金斯P值和直方图。非参数曼Whitney U测试是用来比较的组。一个P值< 0.05被认为是显著的。
结果
细菌污染的DUWL
在两种不同类型的细菌污染评估DUWL, 12和KaVo。微生物分析水样的机头和蓄水瓶之前和之后进行去污过程。扫描电子显微镜图像的明显图1,观察生物膜密度的腔的表面DUWL油管,揭示各种棒和球菌生物膜的矩阵。
图1。内表面的扫描电子显微图DUWL油管。生物膜厚质量管的内表面上。
水线机头的污染
均值(SD) CFU计数R2A介质的最高12和KaVo单位。从12 CFU计数,6.38×104(5.7×102),这明显(P< 0.05)减少到4.41×102(2.2×102消毒处理过程(后)图2)。同样,从KaVo,意味着(SD)从8.8×10 CFU计数减少3(1.3×1032.5×102(2.2×101)。
图2。完全可行的计算从水样收集牙科单位手碎片。样本收集之前和之后的治疗,连续稀释10倍到10−5和镀在不同的培养基。板块被孵化在不同大气条件下对不同孵化倍中所描述的“方法”。P< 0.05曼Whitney U。
从MacConkey琼脂,意味着(SD)从1.1×10 CFU计数减少3(1.14×1022.2×102(2×10212),从5.18×103(1.0×1022.7×102(2.2×101)在KaVo的情况下。观察细菌生长在假单胞菌琼脂的只有一个牙科单位从每个12 [5×102(2.8×101),减少到3.2×101(2.54×101)。KaVo的意思(SD)从假单胞菌琼脂[1×10 CFU计数2(1.4×101),治疗后计数下降到零。
水线存储水瓶的污染
类似于机头,最高CFU计数观察从R2A介质的水样本存储在每个单元(瓶图3)。12,意味着从7.78×10 (SD)数量减少3(8.2×102)8.6×101(3.4×101)。MacConkey琼脂:3.1×10 CFU计数3(3.8×102)降低为5.8×102(5.3×10212)。KaVo的数量高出约日志,即。,1.3×104(1.9×103)降低为2.6×101(7.42×100)(P< 0.05)。大部分的水储存瓶(4 - 5)12和假单胞菌琼脂KaVo显示殖民地。12,意味着(SD)对假单胞菌琼脂cfu 1.8×102(2.21×101),下降到3.5×101(3.6×101),而计数的平均值是7.75×101(4.6×101在所有单位)下降到零计数。
图3。完全可行的计算从水样收集牙科单位蓄水瓶。样本收集之前和之后的治疗,连续稀释10倍到10−5和镀在不同的培养基。板块被孵化在不同大气条件下对不同孵化倍中所描述的“方法”。P< 0.05曼Whitney U。
生物膜生长在套管上
生物膜中的细菌负荷增长的牙科水线套管的内表面也由微生物文化(图4)。均值(SD)是1.64×10 CFU计数4(1.1×104),下降到1.2×103(7.8×102)R2A介质,MacConkey琼脂:1.15×104(1.5×104)降低为1.4×102(1.9×102);假单胞菌琼脂:8×102(6.3×102)降低为2×102(3×102)。没有观察到生长在SDA媒介。
图4。从生物膜细菌计数从DUWL油管之前和之后的治疗。生物膜是刮掉油管表面使用无菌牙科探针和悬浮在无菌PBS。系列10倍稀释(10−5镀)准备和在不同的培养基。P< 0.05曼Whitney U。
KaVo的单位,在所有文化媒体观察微生物的增长。均值(SD) 5.6×10 CFU计数4(6.85×104)和显示明显降低9.4×102(2.78×102)(P< 0.05);MacConkey琼脂:1.06×104(6.3×103)降低为5.95×102(2.6×102);假单胞菌琼脂:1.9×103(1.3×103)降低为1.7×102(2×102)。殖民地的念珠菌属物种观察SDA介质,1.6×103(1×103)降低为1.3×102(7.4×101)。
识别的主要细菌物种从牙科单位水线16 s rRNA基因测序
16 s rRNA基因测序是用来识别最经常被colony-types发生在所有增长媒体(表1)。大多数物种识别是革兰氏阳性只有5是革兰氏阴性。Gram-positives,重要的物种葡萄球菌属,pasteuri葡萄球菌、葡萄球菌warneri hominis葡萄球菌,葡萄球菌和葡萄球菌captis被确定。其他革兰氏阳性的物种微球菌危害,棒状杆菌aurimucosum、棒状杆菌奇异、棒状杆菌amycolaturm,和枯草芽孢杆菌。有趣的是,口头的物种唾液链球菌也出现在确定物种。不动杆菌indicus, Paenibacillus lactis, Roseomonas粘膜Roseomonas aerofrigidensis是革兰氏阴性物种鉴定的水线的样本。
表1。主要微生物物种DUWL被16 s rRNA基因测序。基因库提交身份证:2641990。
讨论
样品的微生物评估之前和之后的治疗干预牙科单位倾斜显示显著减少治疗过程后的微生物菌落计数。重要的是,16 s rRNA的基于基因的识别主要colony-types透露,水线是有潜在危险的细菌种类繁多。
我们使用四种不同类型的微生物培养基、R2A环境细菌培养和枚举的饮用水在实验室设置,革兰氏阴性细菌的选择性生长MacConkey媒介,假单胞菌琼脂与氯氟化碳补充用于选择性隔离假单胞菌物种(15)。SDA与氯霉素用于介质假丝酵母物种(16)。本研究的一个重要限制是,我们没有试图文化军团菌spp。,一个重要的人类病原体,经常发生在DUWL (17,18)。从所有类型的样本,从机头和存储瓶水,从套管、R2A中紧随其后的是MacConkey媒介,展示了最多数量的cfu。治疗后15天,CFU计数显著降低约102-10年3cfu。细菌菌落生长在假单胞菌琼脂不属于假单胞菌按f16战斗机核糖体rna基因测序物种。可能是我们使用的假单胞菌琼脂不是选择性和其他一些物种的生长。殖民地从SDA媒介似乎是念珠菌属的物种,这是进一步的特点是革兰氏染色法。
重要的是,支架表面的水线套管存在密集的生物膜的扫描电镜图像。在培养的生物膜刮油管,沉重的观察细菌生长R2A琼脂和MacConkey介质,而较小的增长被认为在其他文化媒体。相信一旦大分子在水中坚持腔的套管和调节膜表面形成,这种表面微生物附着。随后,附着细菌分裂和在水中浮游细胞开始附着在表面,导致生物膜的形成的起始(19)。随着生物膜的成熟,他们打开导致自由的释放细菌细胞内生物膜到流水(20.)。在缺乏一个有效的消毒过程中,细菌细胞从成熟生物膜找到新的表面遵守并开始新的生物膜的殖民地。在我们的研究中,消毒治疗导致的微生物数量显著减少所有媒体增长,证明我们使用的治疗方法的疗效。
在牙科诊所,各种消毒剂用于DUWL维护。大多数是基于次氯酸钠(NaOCl)、过氧化氢(H2O2)——有或没有银离子和助教(tetra-acetylethylenediamine)制定过乙酸(21)。他们可以使用,定期(高度集中的休克疗法)或连续(少集中处理)。两种方法都是没有缺点的。而周期性治疗结果在治疗停止后2 - 3周内开拓殖民地,连续不间断治疗可能暴露病人和工作人员意外接触杀虫剂(22)。更重要的是,长期使用的消毒剂可能导致宽容或耐药的出现物种在DUWL生物膜(23)。在我们的研究中,即使我们使用化学消毒剂在断断续续的基础上,我们实现了代孕行为可能帮助防止开拓殖民地水线的微生物。在一天结束的时候,所有的水所累积的倾斜的排水。在每一天的开始,手,一分之三的注射器和其他仪器连接到牙科单位水线刷新了5分钟,以消除任何细菌在油管仍然存在。类似的研究在几年前在政府多科诊所被证明是非常有效的控制在DUWL微生物污染(13)。
16 s rRNA基于基因的识别最常见的colony-types所有媒体透露可能潜在的致病细菌物种的数量。菌株的葡萄球菌物种如金黄色葡萄球菌,美国warneri,美国hominis,美国haemolyticus据报道是耐甲氧西林(24)。Roseomonas粘膜(25),Paenibacillusspp (26),Kocuria rhizophila(27),不动杆菌indicus(28),枯草芽孢杆菌(29日)。值得注意的是,一些鉴定物种被认为是病原体的免疫功能不全的患者。此外,一些物种识别也被报道称发生在牙科单位水线在先前的研究(30.)。最近的文献综合分析微生物群的DUWL解释DUWL生物膜的微生物多样性。
结论
总之,我们的研究表明,定期消毒的牙科单位水线仅根据制造商的指导可能是不够的在保持低微生物计数。水线的综合治疗是有效地降低微生物计数水平允许的ADA:冲洗消毒的水线套管,丢弃剩饭存储瓶水,排水套管日报,冲洗机头和其他仪器连接到牙科单位每日一开始。这可能减少感染的风险为牙科单位工作人员和病人。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/,2641990。
作者的贡献
是:研究设计、实验、数据解释,手稿写;JB:数据解释,手稿写;马克:研究设计、实验、数据解释,数据分析,写作手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项研究是由大学授予# SRUL01/14科威特。
确认
这项研究是由口腔微生物学研究实验室(KU格兰特# SRUL 01/14),科威特大学牙科学院。作者感谢Asma哈尼夫女士和克里希纳Girija女士在口腔微生物学研究实验室(SRUL01/14),牙科学院,他们的技术帮助。此外,我们还要感谢杰西女士马修在电镜设施,医学院和扫描电子显微镜对她的帮助。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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收到:2022年10月15日;接受:2022年12月5日;
发表:2023年1月9日。
编辑:
Prasanna Neelakantan香港大学,香港特别行政区,中国©2023 Hussain阿克巴Behbehani Karched。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*函授:Maribasappa Karchedmaribasappa.karched@ku.edu.kw
专业:本文提交口腔感染和微生物的口腔健康科学前沿》杂志上雷竞技rebat