代谢工程gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168年前体供应和poly-γ-glutamic酸生产增加gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

Poly-γ-glutamic酸(γ-PGA)是一种工业相关的生物聚合物由几个gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba物种。γ-PGA由D -和/或L-glutamic酸单体gamma-amide挂钩的债券。水溶性,无毒,可食用,吸湿性聚合物,γ-PGA用于各种应用程序包括医学(gydF4y2Ba公园et al ., 2021gydF4y2Ba)、食品(gydF4y2BaYu et al ., 2018gydF4y2Ba)、废水处理(gydF4y2Ba李et al ., 2020gydF4y2Ba),农业(gydF4y2Ba佩雷拉et al ., 2017gydF4y2Ba)。γ-PGA生产菌株分为glutamate-dependent以及glutamate-independent生产商根据他们的能力产生γ-PGA只有甚至没有添加外源性谷氨酸。作为glutamate-dependent谷氨酸生产商占生产成本的50% (gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba),与glutamate-independentγ-PGA合成压力有利于划算γ-PGA生产。然而,到目前为止γ-PGA浓度得到glutamate-independent工业生产菌株不足(gydF4y2BaSirisansaneeyakul et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

最近,代谢工程方法旨在提高γ-PGA滴度与降低生产成本。增加γ-PGA效价尤其是谷氨酸独立的菌株,主要代谢工程的目标是增加谷氨酸前体供应,预防γ-PGA退化,删除副产品合成路线。方法提高沉默rna前体供应包括使用镇压的表达gydF4y2BarocGgydF4y2Ba编码谷氨酸脱氢酶。的压迫gydF4y2BarocGgydF4y2Ba成功地增加了细胞内谷氨酸供应,从而增强了γ-PGA生产(gydF4y2Ba冯et al ., 2014gydF4y2Ba)。灵感来源于谷氨酸生产gydF4y2Ba棒状杆菌属glutamicumgydF4y2Ba。更节能的谷氨酸合成没有ATP消费被引入启用gydF4y2Bac . glutamicumgydF4y2Ba谷氨酸合成机械。此外,代谢拨动开关控制的表达ɑ氧化戊二酸脱氢酶复合体是调查,因为这显示操纵子是完全压抑的谷氨酸合成中gydF4y2Bac . glutamicumgydF4y2Ba(gydF4y2Ba冯et al ., 2017gydF4y2Ba)。增加通量2-oxoglutarate谷氨酸,基因缺失gydF4y2BaodhABgydF4y2Ba或gydF4y2BasucCDgydF4y2Ba编码2-oxoglutarate脱氢酶和琥珀酰辅酶合成酶,分别进行了研究。删除成功引导对谷氨酸代谢通量,从而增加γ-PGA效价(gydF4y2BaMassaiu et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

除了前体供应的增加,删除γ-PGA解聚酶是优化γ-PGA合成报道。主要的三个基因gydF4y2BacwlO, ggtgydF4y2Ba,gydF4y2BapgdgydF4y2Ba编码D, L-endopeptidase CwlO, gamma-glutamyl转移酶Ggt,和gamma-D L-glutamyl水解酶pgd,分别研究了在不同gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba菌株,凸显毒株特异性差异基因缺失的影响。而的双重缺失gydF4y2BapgdgydF4y2Ba和gydF4y2BaggtgydF4y2Ba提高了γ-PGA合成的gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba应变(gydF4y2BaScoffone et al ., 2013gydF4y2Ba),同样的删除没有影响gydF4y2Baamyloliquefaciens。gydF4y2Ba然而,的双重缺失gydF4y2BapgdgydF4y2Ba和gydF4y2BacwlOgydF4y2Ba增加了产量gydF4y2Bab . amyloliquefaciensgydF4y2Ba(gydF4y2Ba冯et al ., 2014gydF4y2Ba)。详细的分析单,双,三删除突变的基因gydF4y2BacwlO, ggtgydF4y2Ba,gydF4y2BapgdgydF4y2Ba在gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba使用在线测量氧转移速率(OTR)和粘度最近确定了三重基因缺失作为γ-PGA合成葡萄糖的有益的修改基本培养基(gydF4y2Ba霍夫曼et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

期间的主要副产品γ-PGA合成gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba中含有葡萄糖,酵母提取物,谷氨酸是2,3-butanediol和乙偶姻。此外,少量的醋酸和乳酸形成(gydF4y2Ba朱et al ., 2013gydF4y2Ba)。为了防止合成,从而增加γ-PGA生产副产品,基因的删除2,3-butanediol和乙偶姻生产,gydF4y2BabdhAgydF4y2Ba和gydF4y2BaalsSDgydF4y2Ba分别是主要的工程目标。的删除gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba、编码的phosphotransacetylase参与合成醋酸的副产品,据报道,稍微增加γ-PGA生产gydF4y2Bab . amyloliquefaciensgydF4y2Ba(gydF4y2Ba冯et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba冯et al。(2015)gydF4y2Ba进一步的报告删除的有益影响gydF4y2Ba每股收益gydF4y2Ba和gydF4y2Ba有限合伙人gydF4y2Ba操纵子负责合成胞外多糖和脂多糖,分别。gydF4y2Ba

近年来,理性的设计方法使很大的进步全细胞生物催化剂(gydF4y2Ba林和道,2017年gydF4y2Ba)。这些理性的方法极大地加速通过集成的组学数据(gydF4y2BaAmer Baidoo, 2021gydF4y2Ba)。在这些组学技术,代谢组学领域的指导代谢工程方法(尤其有用gydF4y2BaPutri et al ., 2013gydF4y2Ba)。代谢组学研究结果成功地应用在各种生物和产品,包括,例如,氨基酸生产酵母(gydF4y2Ba黄金et al ., 2015gydF4y2Ba西红柿(),类黄酮生产gydF4y2BaBovy et al ., 2007gydF4y2Ba),生物燃料生产微藻和蓝藻(gydF4y2Ba加藤et al ., 2022gydF4y2Ba)。这些例子强调代谢物分析作为一种重要的工具来指导rational方法对代谢瓶颈和有前途的工程目标。这也可以应用于改善γ-PGA合成gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

这项研究集中在进一步改善γ-PGA glutamate-independent的合成gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168导数(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2019gydF4y2Ba)利用葡萄糖作为唯一的碳源。减少副产品形成在这里选为代谢工程目标,导致压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaΔBP(δ副产品)基因的缺失gydF4y2BabdhAgydF4y2Ba,gydF4y2BaalsSDgydF4y2Ba,gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba,gydF4y2BayvmC,gydF4y2Ba和gydF4y2BacypXgydF4y2Ba。深入的分析gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaΔBP PG3变体使用在线粘度测量和代谢物进行分析来确定应变特征和潜在的进一步代谢工程的目标。高效γ-PGA合成演示了使用改性中常用γ-PGA生产E。该研究凸显了价值相结合的代谢工程和深入的资源-应变特性和高效γ-PGA生产成本。gydF4y2Ba

2材料和方法gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba。葡萄糖,L-glutamic酸,在北半球gydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl, KgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·2gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, MnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba·HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, FeClgydF4y2Ba_3gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,那gydF4y2Ba_2gydF4y2Baedta, CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·5gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和CoClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿卡尔罗斯买来GmbH +有限公司KG(德国卡尔斯鲁厄)。LC / MS-grade超纯水,HPLC-grade氯仿,乙酸,HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba和NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba和光纯化学工业,买来kouichi有限公司(日本大阪)。10-Camphorsulfonic酸和tributylamine买来SigmaAldrich(密苏里州,美国)。gydF4y2Ba

菌株、质粒和增长的条件。gydF4y2Ba使用的菌株和质粒和建造在这项研究中列出gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。所有克隆步骤进行gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α。重组酶阳性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变JM101用于质粒传播转换之前gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba。之前报道的应变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaΔspo (gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2019gydF4y2Ba的导数)gydF4y2BamanPgydF4y2Ba一个负压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaIIG-Bs2 (gydF4y2Ba文策尔和Altenbuchner, 2015gydF4y2Ba)作为起始菌株代谢工程。gydF4y2Ba

质粒建设和计数器选择,菌株培养在磅中包含100μg 37°C /毫升壮观霉素或0.5% (w / v)甘露糖(当需要时)。γ-PGA生产和代谢物分析,gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba菌株生长在葡萄糖基本培养基。使用的菌株和质粒和创建在这个研究中列出gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

删除质粒结构。gydF4y2Ba基因的质粒用于删除和集成的启动子上游gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba操纵子装配使用内HiFi DNA组装工具包(内,法兰克福,德国)。集成的PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}或PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba启动子、启动子序列被放大gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168基因组DNA引物对bs - 019 / bs - 020或bs - 009 / bs - 010(见gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba)。两个目标序列(TS)的集成和随后的质粒被放大gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168基因组DNA,用引物对bs - 068 / bs - 069和bs - 070 / bs - 071 PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}集成或TS1_fwd / TS1_rev和TS2_fwd / TS2_rev PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba集成。壹空间和TS2地区缺失的基因gydF4y2BaalsSDgydF4y2Ba,gydF4y2BabdhAgydF4y2Ba,gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba,gydF4y2BayvmCgydF4y2Ba和gydF4y2BacypXgydF4y2Ba,gydF4y2BaxylAB,gydF4y2Ba和gydF4y2BaldhgydF4y2Ba是放大同样使用底漆对bs - 029 / bs - 030和bs - 031 / bs - 032 bs - 033 / bs - 034和bs - 035 / bs - 036 bs - 037 / bs - 038和bs - 039 / bs - 040 bs - 053 / bs - 054和bs - 055 / bs - 056 bs - 085 / bs - 086和bs - 087 / bs - 088 bs - 325 / bs - 326和bs - 327和bs - 328,分别。向量的碎片被组装骨干pjoe - 8739 bs - 020 / bs - 021线性化。向量组装与内HiFi DNA组装进行描述的制造商。与会的质粒转化为化学主管gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α细胞。正确地构建质粒经PCR测序,使变回原形gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaJM101获得的质粒gydF4y2BaB。gydF4y2Ba细小gydF4y2Ba转换。gydF4y2Ba

应变的发展。gydF4y2Ba压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaΔspo与质粒构建删除删除转换和集成启动子的基因。根据巴黎执行转换方法(gydF4y2Ba哈伍德,切割,1990gydF4y2Ba)。删除是由markerless基因删除系统从文策尔和Altenbuchner (gydF4y2Ba文策尔和Altenbuchner, 2015gydF4y2Ba)。简而言之,转化细胞包含壮观霉素磅平皿上选择。之后,counterselection甘露糖含有琼脂板被用来选择细胞失去了通过同源重组质粒在磅孵化期间没有选择压力。证实了质粒损失的壮观霉素敏感性细胞菌落PCR,虽然成功删除基因启动子上游的或集成gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba被测序证实。gydF4y2Ba

培养对代谢物的分析。gydF4y2Ba的主要文化gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba增长和代谢物的分析进行了葡萄糖基本培养基(如前所述)(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 bgydF4y2Ba)。基本培养基中含有每升:20克葡萄糖,41.9 g拖把缓冲区,7 g NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl, 0.5 g KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,0.5 g MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,0.15 g CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,0.1 g MnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,0.04 g FeClgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba和1毫升的微量元素的解决方案。微量元素的解决方案(修改后微量元素溶液文策尔et al。(gydF4y2Ba文策尔et al ., 2011gydF4y2Ba每公升)包含:0.54 g ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba×7 HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,30.15 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2Baedta、0.48 g CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2BaH·5gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和0.54 g CoClgydF4y2Ba_2gydF4y2BaH·6gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao .介质的pH值与氢氧化钠设置为6.8。两步precultures首先被种植在一夜之间LB培养基和第二介质与主要的培养基。磅介质包含每升:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物和10 g氯化钠在pH值7.4。主要的文化是接种ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}从preculture 0.1。文化是孕育在37°C旋转瓶用颤抖的在200 rpm(直径25毫米摇晃)葡萄糖实验基本培养基(家里Multitron, Bottmingen,瑞士)。如果不换句话说,查看都是一式三份,执行和报告数据代表平均值。gydF4y2Ba

培养在培养基E。gydF4y2Ba此外,在修改中Eγ-PGA生产调查,修改根据伦纳德et al。(gydF4y2Ba伦纳德et al ., 1958gydF4y2Ba),最终由每升:30克甘油、柠檬酸15克,20 g L-glutamate, 4 g NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaK Cl, 0.5 ggydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,0.5 g MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,0.04 g FeClgydF4y2Ba_3gydF4y2Bah·6gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,0.15 g CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·2gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,0.104 g MnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba·HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,41.9 g拖把缓冲区(gydF4y2BaMitsunaga et al ., 2016gydF4y2Ba)。30 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba木糖是添加到实验gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44和PG55培养诱导表达的开始gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba基于xylose-inducible子PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 bgydF4y2Ba)。介质的pH值E使用10 M氢氧化钠调整到7.2。Precultures进行如上表示。文化是孕育在37°C旋转瓶用颤抖的在300 rpm(50毫米摇晃直径)为实验介质E(家里Multitron, Bottmingen,瑞士)。查看全部进行了一式三份,报告数据代表平均值。gydF4y2Ba

生物监测。gydF4y2Ba生物量浓度由ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}测量样本的摇动烧瓶用细胞密度仪(Amersham生物科学,小都,英国)。此外,细胞生长细胞生长量词(在线监测CGQ;科学生物工艺(SBI), Baesweiler,德国)。生物量浓度作为细胞干重(CDW)计算从ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}使用下面的相关方程,确定经验:车损险(g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)= 0.5381 * ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}+ 0.0074。光密度和细胞干重的相关性确定参考应变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaΔspo。各种发酵肉汤稀释准备一式三份和ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}每个稀释测定。一定体积的调整生物量浓度的细胞悬液,离心获得细胞颗粒。0.9%的颗粒在100年resuspendedµL氯化钠溶液。集中细胞悬液应用于纤维素过滤已知重量的干60°C以上24 h。生物量干重确定干燥过滤器24 h后确定的相关性车损险和ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

培养对在线监测(OTR和粘度测量)。gydF4y2Ba在线监测的呼吸活动确定氧转移速率(OTR)呼吸活动监视系统(拉莫斯(gydF4y2BaAnderlei buch, 2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaAnderlei et al ., 2004gydF4y2Ba))进行了主要文化如前所述(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 agydF4y2Ba)。商业版本的该系统可从库恩AG) Birsfelden,瑞士或高科技的气力,Herzogenrath,德国。gydF4y2Ba

第一pre-culture LB培养基接种于200µL低温股票。5 h后文化是收获,离心机在11000 rpm, 4°C 5°min, resuspended在基本培养基,将ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}0.1和用于第二pre-culture。第二pre-culture收获培养24小时后,离心机在11000 rpm, 4°C 5°min, resuspended在基本培养基,将ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}0.1和用于启动的主要文化。主要的文化被转移到拉莫斯烧瓶为在线测量和离线的额外厄伦美厄烧瓶样本。pre-cultures和主要文化的文化条件如下:250毫升摇动烧瓶,充盈量20毫升,震动频率350 rpm,直径50毫米,温度37°C,初始ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}= 0.1。gydF4y2Ba

在线粘度测量进行了使用设备开发的gydF4y2BaSieben et al。(2019)gydF4y2Ba如前所述(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba霍夫曼et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

分批发酵。gydF4y2Ba分批发酵进行了搅拌釜生物反应器(BioFlo120;埃普多夫,德国汉堡)如前所述(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2019gydF4y2Ba)。细胞生长监测在线使用生物反应器细胞生长量词(CGQ BioR;科学生物工艺(SBI)),表示,无论文化与摇瓶实验条件保持不变:温度37°C和初始ODgydF4y2Ba_{600年gydF4y2Ba}0.1。酸度控制在七的2 M盐酸或2 M氢氧化钠。充盈量为0.5 L,曝气率设置为一个vvm,搅拌器的速度在每分钟800转。gydF4y2Ba

分析gydF4y2Baγ-gydF4y2BaPGA与CTABgydF4y2Ba。γ-PGA生产进行了分析使用cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB)试验(如前所述)(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2019gydF4y2Ba)。简单,细胞被离心分离(20分钟5000 g 4°C)。随后,三次的样品体积γ-PGA使用纯乙醇沉淀。沉淀γ-PGA resuspended在蒸馏水。测量,γ-PGA样本与CTAB溶液混合,和浊度测量在400 nm协同MX标仪(美国BioTek仪器,Winooski)。γ-PGA浓度计算基于校准曲线用标准的MDaγ-PGA(德国汉高AG)和有限公司、杜塞尔多夫)-10年0.1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

分析gydF4y2Baγ-gydF4y2BaPGA和GPCgydF4y2Ba。γ-PGA决心的浓度和分子量凝胶渗透色谱法(GPC)如前所述gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 bgydF4y2Ba)。GPC系统(hlc - 8320 - GPC)配有TSKgel GMPWxl列(300°×7.8毫米,Tosoh生物科学GmbH,斯图加特,德国)和TSKgel PWxl警卫队列(40×6毫米,Tosoh生物科学)。30毫米KNO使用的流动相gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba1毫升的流量最小gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。GPC系统的温度维持在40°C,和30µL净化、过滤γ-PGA样本注入。确定γ-PGA在样品的浓度,γ-PGA钠盐作为标准。分子量测定的校准曲线建立了用聚(苯乙烯磺酸盐)钠盐标准分子量峰值(Mp)在-976年4.21 kDa (PSS聚合物GmbH是一家现代化的标准服务,美因茨,德国)。gydF4y2Ba

分析的葡萄糖、乙偶姻、2,3-butanediol和醋酸。gydF4y2Ba葡萄糖的消费和生产的副产品如乙偶姻、2,3-butanediol和分析了醋酸HPLC-RI使用GL - 7400设备加上柱温箱GL - 7432 (GL科学,东京,日本)。高效液相色谱系统配备一个Aminex hpx - 87 h列(7.8×300毫米,Bio-Rad、钙、美国)。5毫米HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba作为流动相流速为0.6毫升最小gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba25分钟。柱温箱的温度保持在65°C。文化浮在表面的游离与Mini-Uni预科聚四氟乙烯过滤器过滤(孔径0.45毫米,英国通用电气医疗集团)。10μL滤液被注入到高效液相色谱系统。细胞外的浓度丙酮酸是量化使用Amplite®比色丙酮酸测定工具包(猫# 13821,AAT Bioquest,加利福尼亚,美国)根据制造商的指示。分析物的浓度被校准曲线建立了计算所有标准。gydF4y2Ba

样品制备的代谢组分析gydF4y2Ba。代谢组分析,文化样本期间收获指数的阶段。样本的准备(如前所述)(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 agydF4y2Ba)。简单地说,一个常数生物量浓度与PVDF过滤器过滤(孔隙大小,0.45毫米)使用真空。洗后样品NH 300毫米gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba,细胞的新陈代谢被浸泡在液体过滤N淬火gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。样本储存在−直到代谢物提取80°C。1.875毫升的代谢物提取萃取溶剂(1:2:2,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO:甲醇:氯仿,包括7海里每样10-camphorsulfonic酸作为内部标准)。提取的代谢物通过离心分离,上清液转移到清洁管、真空浓缩、冷冻干燥过夜。获得的颗粒是储存在−80°C到分析质。gydF4y2Ba

Ion-pair-LC / MS / MS分析。gydF4y2Ba提取的代谢物被ion-pair-liquid色谱分析样品加上串联质谱(LC / MS / MS)分析了用日本岛津公司Nexera UHPLC系统加上一个LCMS 8030 +设备(日本岛津公司有限公司日本京都)。如前所述(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 agydF4y2Ba),系统配有PE-capped赛L-column 2 ods柱(2.1毫米×150毫米,粒径3毫米;化学物质评估和研究所,日本东京)。为流动相,梯度溶剂a和B的混合物,其中溶剂是10毫米tributylamine和15毫米醋酸在超纯水和溶剂B是纯甲醇。mLmin流量设置为0.2gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。梯度洗脱的代谢物,B的浓度从0提高到15%,与30%的梯度最小1分钟gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba了1.5分钟,超过5分钟增加到50%,随后在2分钟增加到100%。100%的溶剂B浓度为1.5分钟,从11.5分钟下降到0%,然后举行这个浓度为8.5分钟。柱温箱温度设置为45°C。女士参数如下:探针位置,þ1.5°mm;反溶剂线温度,250°C;干燥气体流,15分钟gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;加热块温度、400°C;和喷雾气体流,2 L分钟gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。每样3µL注入ion-pair-LC / MS / MS对代谢物的分析。分析得到的样本resuspending干代谢物提取样品50µL超纯水。gydF4y2Ba

代谢物的数据处理和分析。gydF4y2Ba代谢物数据分析,峰面积计算使用MRMPROBS版本。2.38和手动检查。根据峰面积数据规范化的内部标准,10-camphorsulfonic酸。期刊SIMCA 13 (Umetrics,瑞典)是用于主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。使用MATLAB进行了t (MathWorks,妈,美国)。gydF4y2Ba

3的结果gydF4y2Ba

改善γ-PGA合成gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba以葡萄糖为唯一碳源,碳通量的方向必定是谷氨酸三羧酸循环,最终确保γ-PGA合成酶前体供应充足。由此产生的应变与受损的副产品综合详细分析了使用代谢组学方法和在线粘度测量。γ-PGA增产与葡萄糖为唯一碳源或γ-PGA生产中E和额外的代谢工程的目标。gydF4y2Ba

3.1预防形成副产品gydF4y2Ba

枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba生产2 3-butanediol乙偶姻,葡萄糖和乙酸在增长。条件下高γ-PGA生产乳酸形成另外观察到。在含铁最小的媒体也查看,pulcherriminic酸的合成报道(gydF4y2BaUffen罗伯特和Canale-Parola, 1972gydF4y2Ba)。以减少副产物形成和改变通量对谷氨酸的路线,2的形成,3-butanediol,乙偶姻,醋酸,pulcherriminic酸被删除了各自的基因gydF4y2BayvmC bdhA alsSD,家长会,gydF4y2Ba和gydF4y2BacypXgydF4y2Ba(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

的影响gydF4y2BayvmC bdhA alsSD,家长会,gydF4y2Ba和gydF4y2BacypXgydF4y2Ba删除γ-PGA生产研究通过比较两种,gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2(γ-PGA-producing引用没有基因删除)gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3(γ-PGA-producing删除突变)根据其生长行为和γ-PGA生产批量发酵葡萄糖作为碳源(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。的phosphate-starvation诱导启动子是用于PGA合成酶基因的表达gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba。启动子的使用PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}使增长和γ-PGA生产的解耦,从而允许的规定γ-PGA磷酸生产通过控制介质的可用性。由于使用phosphate-starvation诱导启动子PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}进行发酵,降低磷酸浓度的0.5 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2BaKgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba。在磷酸盐有限条件下,增长似乎是低于标准的媒介。此外,观察non-exponential增长。的最大生物量浓度7.1 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和2.8 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba为gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3分别。观察生物量浓度的大幅下降gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2车损险的下降从7.1 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba经过14 h到2.5 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba28 h后,生物量浓度gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba整个固定相PG3更稳定。为gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2,γ-PGA浓度低于检出限15 h的培养时间。从15 h,只有小γ-PGA浓度低于0.1 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba被GPC检测。γ-PGA生产缺失突变体gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3明显更高,最大效价达到0.26 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba最终培养相应的0.089 ggydF4y2Ba_{γ-PGAgydF4y2Ba}ggydF4y2Ba_CDWgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和0.028克gydF4y2Ba_{γ-PGAgydF4y2Ba}ggydF4y2Ba_CDWgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba删除突变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba分别PG3和参考PG2。五个基因的删除,以防止副产品综合导致γ-PGA生产增长了3.7倍,的确让重路由的葡萄糖分解代谢产物的形成。同样,绝对γ-PGA给定的栽培条件下的浓度很低。gydF4y2Ba

进一步研究生长动力学和γ-PGA生产的菌株gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3,深入调查与在线氧转移速率(OTR)测定细菌生长,在线粘度测量量化γ-PGA生产,和离线取样副产品生物量测定和高效液相色谱法测量的合成。摇动烧瓶的分析相同的介质磷酸钾浓度较低,在生物反应器用于批量查看。生产进行了四个独立的查看每一个与每个应变两种文化。在每四个查看,两个摇动烧瓶/应变从同一preculture接种。然而,对于缺失突变体gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3、大型增长行为的变化以及γ-PGA生产观察(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。而工程测量应变PG2(供参考gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)显示了一个高度可再生的低偏差趋势滞后时间和达到最大值,大变化观察到删除突变PG3副产品(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。为gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3 8 h不同滞后阶段观察,防止代表抽样之间独立的文化。此外,强大的变异最大OTR值高达36更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba查看1和2的观察,与参考应变和获得的值只有24.6更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba强调增长差异独立查看。gydF4y2Ba图3 c, DgydF4y2Ba显示离线的生物量浓度样品gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba分别PG2和PG3中被查看2 - 4所示。可视化生长行为,指定的采样点gydF4y2Ba图3 c, DgydF4y2Ba转移到补偿变化的滞后阶段。参考应变PG2,所有数据点从独立查看适合对方,导致与生物反应器培养的生长曲线(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。删除突变PG3,高变异之间的查看发现是符合最大PG3 OTR值的差异。在培养2,最大OTR达成高,高生物量浓度的4 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba与生物量的测定得到的参考。相比之下,培养3和4的生物量测定,降低OTR值达到最大,导致只值1.6 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。增长的行为是观察到的这两个查看与观察到的行为的生物反应器培养(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。最终,栽培条件多个基因敲除突变体使用低磷酸盐浓度扰动非常敏感。gydF4y2Ba

在线测量两种gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2 PG3进行了总结gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba。平均值和标准偏差计算的七个独立的OTR每应变测量和三个独立的粘度测量,每个实验的时间轴是规范化获得OTR超过20 mmolLgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在培养24小时运行时间。较低的使用这些转移OTR曲线,可重复的结果标准偏差的呼吸活动。参考应变PG2,观察OTR曲线急剧下降约28.5 h后最大的工程。33更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba只有5更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba后34.5 h。这下降可能对应于葡萄糖的消耗。从34.5 h - 38.5 h, OTR增加再次达到一个高点9.5更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,最有可能指示溢出的吸收代谢产物如乙酸、2,3-butanediol,乳酸产生葡萄糖在第一个增长阶段。OTR匹配的确定过程中副产品的最高浓度的醋酸和乳酸约后确定。30 h和葡萄糖才发现30 h (gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。重要的是,副产物浓度达到最高的3 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba是乳酸。副产品的乳酸合成还没有阻止删除突变。此外,乙偶姻的生产不能探测到由于分辨率的不足采用高效液相色谱法与拖把查看缓冲区。从50 h开始,没有调查代谢物的检测和呼吸活动接近0更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba指示的分批培养(gydF4y2Ba补充图S1, 2gydF4y2Ba)。删除突变PG3,最初的OTR与参考应变的增加。然而,最大OTR较低,只有30更易与LgydF4y2Ba^1gydF4y2BahgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba并表现出更高的标准偏差是由于不同的增长如上所述gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。此外,OTR后下降的斜率最大OTR PG2相比更低,导致一个更广泛的工程曲线的肩膀之间有一个较小的第二峰值34.5 h和38.5 h。这些研究结果对应于一个较低的副产品合成。醋酸生产观察PG3 (gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)尽管删除gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba基因,其基因产物催化带注释的醋酸合成通路的第一步gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba。的醋酸酯激酶可能是一个有益的目标,以避免形成,虽然我们没有建议Pta提供acetyl-P以外的其他酶活性。的生产和后续消费0.9 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba醋酸由PG3 OTR信号匹配。gydF4y2Ba

γ-PGA合成被在线粘度测量监控(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。PG2供参考,最高粘度后获得了33 h达到7.7 mPa·s。此时间点对应的过渡消费,从葡萄糖到副产品OTR推导。从33 h,而常数粘度都观察应变PG2减少到7.2 mPa·s的最后发酵。结果表明,压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2不会产生γ-PGA期间增长溢出代谢物。值得注意的是,低标准偏差与应变PG2观察在线粘度测量。相比之下,删除的粘度测量应变PG3之间显著不同的三个测量从高极大值11 mPa·降低最大价值为7.1 mPa·年代应变范围内的参考。不过,在线粘度测量参考PG2和删除应变PG3导致更高的粘度PG3对应与GPC和CTAB测量获得的结果(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。至于参考,最高的粘度增加PG3观察葡萄糖在增长,导致高粘度曲线的斜率33 h。由于应变PG3的细长的增长阶段,略有粘度进一步增加,直到结束的测量,最大达到8.8 mPa·s。虽然高γ-PGA PG3生产的基本培养基与磷酸盐限制可以证实,低再现性暗示,phosphate-starvation启动子的使用,因此,应该避免磷酸盐限制稳定γ-PGA生产。gydF4y2Ba

3.2胞内代谢物的分析gydF4y2Ba

参考应变的代谢物的概要文件gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba∆热点,缺失突变体gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba∆BPγ-PGA-producing参考gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2,γ-PGA-producing删除突变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3比较(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。删除这两个菌株的代谢数据gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba∆BP和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3非常相似,表明γ-PGA生产代谢物浓度有轻微影响。这个观察可能是因为γ-PGA效价低,达到控制γ-PGA合成酶的表达菌株phosphate-starvation诱导启动子PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}。不过,浓度的差异直接γ-PGA前体(iso)柠檬酸,2-oxoglutarate,谷氨酸。这些前体浓度略有减少为两个γ-PGA生产菌株,而这些代谢物的浓度增加删除突变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG3相比gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG2。因此,基因缺失导致增加前体供应的预期效果。测量浓度的糖酵解中间体乙酰辅酶a的积累和丙酮酸的缺失突变体。这些发现表明,柠檬酸合成酶的活动可能是流量的限制步骤向谷氨酸。从柠檬酸直接γ-PGA前体的浓度,2-OG和谷氨酸几乎是高在γ-PGA删除应变PG3γ-PGA-negative应变ΔBP, PGA合成酶的表达或活动的限制因素最有可能删除应变PG3γ-PGA生产。因此,研究基因删除必须结合PGA合成酶的表达水平更高优化γ-PGA生产工程缺失突变体以葡萄糖为唯一碳源。gydF4y2Ba

3.3γ-PGA生产gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba∆BP使用动力的组成型启动子gydF4y2Ba

最大化的利益缺失突变体的前体供应增加,弱启动子PgydF4y2Ba_{太平洋标准时间gydF4y2Ba}取而代之的是强者,本构合成启动子PV35.26 (gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 bgydF4y2Ba)。至于phosphate-starvation启动子的使用,两个菌株,参考应变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG32和副产品删除应变gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG33都表达了gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba基因启动子的控制下PV35.26,追究增长和葡萄糖γ-PGA生产批量发酵(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。独立于启动子用于PGA合成酶表达,更高γ-PGA效价达到了副产物合成途径的缺失突变体阻塞。的γ-PGA效价高出三倍gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG33相比参考,达到0.57 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Baγ-PGA。有趣的是,更高的增长率的缺失突变体观察0.47 hgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba相比,增长率为0.3 hgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba为gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG32。phosphate-starvation介质相比,一个显著提高生物量浓度获得新品种的基本培养基含有磷酸的浓度增加。较高的生物量浓度和γ-PGA效价突出更强大的利益,组成型启动子在基本培养基γ-PGA生产葡萄糖为唯一碳源。gydF4y2Ba

3.4删除乳酸脱氢酶和生产中EgydF4y2Ba

即使本构子PV35.26 (gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 bgydF4y2Ba与删除),γ-PGA生产获得压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG33低于1 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。的一种变体xylose-inducible启动子PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba导致γ-PGA最高浓度与葡萄糖或木糖作为碳源。此外,与启动子在线粘度测定PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba导致高粘度的40 mPa·s基本培养基以木糖为唯一碳源,突显出木糖诱导启动子的高潜力(gydF4y2BaHalmschlag et al ., 2020 agydF4y2Ba)。重要的是,启动子是由木糖诱导但与本机PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba启动子的gydF4y2BaxylABgydF4y2Ba操纵子,它不是由葡萄糖压抑CcpA绑定网站负责镇压失踪。除了先前基因缺失菌株ΔBP,乳酸脱氢酶的基因gydF4y2BaldhgydF4y2Ba被删除,以防止生产乳酸的观察作为主要副产品的菌株。此外,gydF4y2BaxylABgydF4y2Ba操纵子负责木糖代谢被删除Δspo和ΔBP背景,防止损耗的启动子诱导代理人在培养期间,最终导致的建设gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG4 PG5。集成到木糖诱导启动子gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG4 PG5,产生γ-PGA-producing菌株gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44和gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55。确定最大γ-PGA生产能力的工程菌株,葡萄糖基本培养基取代已知γ-PGA生产介质,介质E,据报道,使γ-PGA生产的53 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba地衣芽。gydF4y2BaATCC9945 (gydF4y2BaMitsunaga et al ., 2016gydF4y2Ba)。然而,只有30 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba甘油被用于实验相比80 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba报道了gydF4y2BaMitsunaga et al。(2016)gydF4y2Ba,旨在达到一个更高的产品收益率在文献中报道。这些修改的gydF4y2Ba动力gydF4y2Ba表达系统和栽培介质,我们旨在利用的理论潜力增加γ-PGA合成的副产物缺乏应变尽管到目前为止平庸的生产浓度。gydF4y2Ba

只有细微差别,生物量的形成gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44培养中观察和PG55修改中EgydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44最终达到一个更高的光密度比PG55 (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。而中接种的pH值gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44开始增加温和的第一个24小时培养后,观察pH值的急剧下降gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba当时PG55点。在24 h,培养介质的pH值gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55从6.8下降到5.3和41.9 g L。尽管最初缓冲gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba拖把(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。甘油是用来代替葡萄糖作为主要碳源中大肠根据修改gydF4y2BaMitsunaga et al。(2016)gydF4y2Baγ-PGA合成增加gydF4y2Ba地衣芽。gydF4y2BaATCC9945栽培与甘油中E,相比与葡萄糖培养。gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44消耗可用30 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba甘油的培养48 h内,而在介质栽培gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55, 1.7 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba甘油检测培养48 h后即使72 h。类似于碳源枯竭的地步gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44γ-PGA效价为9.9 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba分子量2125 kDa达成了在这个紧张的背景。然而,γ-PGA效价为13.2 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba分子量3027 kDa删除应变检测gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55 48 h后,进一步增加到14.5 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba培养72小时后(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。值得注意的是,γ-PGA由的分子量gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44达到最大的4905 kDa培养24小时后,逐步减少在接下来的48 h。相比之下,γ-PGA提供的分子量gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba培养期间PG55在很大程度上影响(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。自gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55γ-PGA效价比更高gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44即使没有甘油消耗,绕过pH值下降和潜在的代谢负担产生的酸性环境可能进一步提高γ-PGA生产。gydF4y2Ba马et al。(2018)gydF4y2Ba报道类似文化的pH值下降gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba应变与减少溢出的新陈代谢。作者得出结论,乙偶姻的预防生产丙酮酸积累细胞,因此加速乙酸的形成。因为在gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55乙酰磷酸的合成,因此通过删除乙酸前体形成受阻gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba,多余的丙酮酸可能不是重新分配,因此可能积累有毒水平。事实上,细胞外的丙酮酸在细胞水平显著高于自由文化的上层清液gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55相比gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44。培养72小时后,细胞外的丙酮酸浓度的8.7 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba丙酮酸是副产品达到缺乏应变比0.4 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在文化的上层的父母的压力,像22倍浓度的增加。这么高的丙酮酸浓度结合14.4 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Baγ-PGA可以解释产生的甘油是伴随着柠檬酸和谷氨酸作为碳源在修改中e .值得注意的是,文化的pH值gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55已经降低了培养48 h后,与细胞外的丙酮酸浓度的0.85 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba相对于0.4 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba父母的文化压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44。细胞外的急剧增加丙酮酸在未来12 h与删除相关突变也可能被解释成细胞溶菌作用和随后的细胞积累代谢产物的释放。gydF4y2Ba

呈现的结果证明设计的高潜力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba与减少副产品综合改善γ-PGA生产甘油或葡萄糖为唯一碳源在基本培养基。gydF4y2Ba

4讨论gydF4y2Ba

合算γ-PGA生产没有添加柠檬酸γ-PGA前兆如谷氨酸或需要重路由对谷氨酸的代谢通量。的gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba谷氨酸合成报道作为γ-PGA生产瓶颈没有添加外源性谷氨酸正如一些研究报道显著增加γ-PGA添加外源性谷氨酸浓度(gydF4y2Ba林et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaMitsunaga et al ., 2016gydF4y2Ba)。姚等人研究了碳的起源在γ-PGA使用13 c-labeled L-glutamate和葡萄糖作为碳源gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba生产商,表明只有9%的γ-PGA来自葡萄糖(gydF4y2Ba姚明et al ., 2010gydF4y2Ba)。在这里,我们工程γ-PGA生产gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168衍生株有或没有删除副产物合成途径的有效直接的碳通量对γ-PGA葡萄糖。代谢通量的结果表明高潜力提供重路由增加3.7倍或1.5倍γ-PGA生产葡萄糖缺失突变体的基本培养基或修改中E。集成的工程菌株优化PGA生产过程有可能降低基质成本PGA合成。gydF4y2Ba冯et al。(2015)gydF4y2Ba之前报道改进γ-PGA合成设计gydF4y2Bab . amyloliquefaciensgydF4y2Ba紧张,缺乏基因gydF4y2Ba每股收益gydF4y2Ba,gydF4y2Ba囊gydF4y2Ba,gydF4y2Ba有限合伙人gydF4y2Ba,gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba。报道的γ-PGA生产应变略从3.8增加到4.15 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。作者观察到一个更大的增加到9.18 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba通过额外的删除基因编码γ-PGA降解酶。此外,有益的影响基因的删除gydF4y2BaodhABgydF4y2Ba或gydF4y2BasucCDgydF4y2Ba编码2-oxoglutarate脱氢酶和琥珀酰辅酶合成酶,分别被报道(gydF4y2BaMassaiu et al ., 2019gydF4y2Ba)。删除成功引导代谢通量对谷氨酸和增加了γ-PGA效价与柠檬酸和葡萄糖作为碳源。这里的代谢物进行分析确定柠檬酸合成酶的主要瓶颈查看以葡萄糖为唯一碳源。调查工程的影响策略的变化在不同的研究强调,基因缺失的影响强烈依赖于研究应变和文化条件。gydF4y2Ba

改进γ-PGA合成与副产品缺失突变体不仅展示了以葡萄糖为碳源,还在修改中大肠的修改版本中,只有30 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba甘油作为比较常用的80 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,目标增加γ-PGA收益率由于流线型的碳代谢和预期增强gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba谷氨酸合成。使用xylose-inducible子PgydF4y2Ba_xylgydF4y2Ba,γ-PGA效价在修改中E的副产品生产不足的压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55增加了41% (14.46 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和10.24 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba后72 h)相比,父母的压力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG44。此外,提高了产品产量从0.33 ggydF4y2Ba_{γ-PGAgydF4y2Ba}/ ggydF4y2Ba_{甘油gydF4y2Ba}0.51 ggydF4y2Ba_{γ-PGAgydF4y2Ba}/ ggydF4y2Ba_{甘油gydF4y2Ba}提供的新生成的基因敲除菌株gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55这个媒介强调改善合成能力的缺失突变即使降低了底物浓度。有限的可用甘油的代谢可能表明代谢逮捕gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55诱导的著名文化pH值下降,这也是描述最大光密度减少的压力。积累细胞外丙酮酸对这种现象提出了一个可能的解释。虽然介质的酸化可能通过使用生物反应器设置主动pH值控制,这没有影响代谢失衡出现在缺失突变体。未来的研究方法将把重点放在稳定文化pH值的重路由碳通量在瓶颈识别这项工作,从而避免潜在的酸性代谢产物的积累。值得注意的是,γ-PGA滴度这一研究获得的从小于1 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在葡萄糖基本培养基14.46 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在修改中E浓度低于报道超过40 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba赵et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2019gydF4y2Ba),表明潜在的生产菌株培养条件进一步优化。尽管降低生产,碳代谢的遗传优化通过删除副产品形成途径改善γ-PGA产量和效价合成酶基因的缺失突变体独立于催化剂和介质用于聚合物的合成。此外,代谢瓶颈识别这项工作将引导未来压力优化,将结合优化培养条件。gydF4y2Ba

详细的代谢物分析以及缺失突变体的检测积累丙酮酸介质E确定柠檬酸合成酶作为重要的代谢工程目标,进一步优化γ-PGA生产副产品缺失突变体。这个溢出代谢物的转换成三羧酸循环中间可以进一步通道代谢通量对γ-PGA前体分子。加强通量的丙酮酸进入三羧酸循环,因此对γ-PGA生产将是未来的研究的对象。γ-PGA进步产品效价和收益率甚至缺失突变体在酸性环境中突出工程菌株利用的潜力已经增加前体供应减少溢出引起的新陈代谢。有趣的是,副产物的形成并不是完全被删除各自的途径。乳酸,乙酸乙偶姻和继续生产gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55修改中E由于未知的代谢途径。这个观察是一致的朱et al .,谁发现醋酸形成gydF4y2Ba棒状杆菌属glutamicumgydF4y2Ba即使没有相关的代谢合成途径(gydF4y2Ba朱et al ., 2013gydF4y2Ba)。在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,两电子黄素蛋白丙酮酸氧化酶PoxB催化丙酮酸进行脱羧反应的酶醋酸和有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba独立的经典合成路线涉及Pta和Ack (gydF4y2Ba李et al ., 2007gydF4y2Ba)。在的情况下gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba,类似的丙酮酸氧化酶SpxB催化作用的合成乙酰磷酸丙酮酸,然后进一步转化为乙酸(gydF4y2BaEchlin et al ., 2016gydF4y2Ba)。基于这些例子可以假设存在一个相似的系统工程gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168年,尽管到目前为止只略微调查。根据乙酰磷酸NCBI基因数据库,生成丙酮酸氧化酶确实出现在gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168年在位置NC_000963.3(938239年英国石油公司488830年到490554年,基因身份证)。基因组的位置被标注为假定的丙酮酸氧化酶YdaPgydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba168年SubtiWiki数据库(gydF4y2BaPedreira et al ., 2022gydF4y2Ba)。YdaP已经被确认为一种醋酸形成丙酮酸氧化酶gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2Ba9,凸显其潜在作用醋酸或乙酰磷酸合成构建缺失突变体gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55 (gydF4y2Ba万尼Lako et al ., 2018gydF4y2Ba)。自gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55只是缺乏gydF4y2Ba家长会gydF4y2Ba负责转化乙酰磷酸乙酰辅酶a,醋酸形成通过AckA可能发生基于Pta-independent乙酰磷酸源提供的吗gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba丙酮酸氧化酶。假定的丙酮酸氧化酶基因的缺失或醋酸激酶基因gydF4y2BaackAgydF4y2Ba对醋酸生产与各自的影响gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaPG55将是未来研究的对象。gydF4y2Ba

乙偶姻的存在所产生的gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba缺乏gydF4y2BaalsSDgydF4y2Ba可能表示一种新颖的合成路线。以前,一个成功的预防乙偶姻删除后形成gydF4y2BaalsSDgydF4y2Ba操纵子报告(gydF4y2Ba马et al ., 2018gydF4y2Ba)。溢出的代谢gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba不仅提供了可能性重定向积累丙酮酸转化为中性发酵产品但还使再生NAD +通过乳酸的合成和2,3-butanediol (gydF4y2BaNakano et al ., 1997gydF4y2Ba)。删除这些合成路线可能因此导致氧化还原代谢失衡,阻碍细胞生长并最终γ-PGA生产。事实上,氧化还原状态变更gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba已经被证明能够加速NAD +端依赖产品的生产,如乙偶姻(gydF4y2BaZhang et al ., 2014gydF4y2Ba)。然而,引入一个NADH氧化酶缺乏副产品gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba在合成显示没有影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖(gydF4y2Ba顾et al ., 2019gydF4y2Ba)。调查是否NADH氧化酶的引入到工程gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba突变体在本研究报告影响增长或γ-PGA生产将受到我们的未来的工作。gydF4y2Ba

针对一个有成本效益的和可持续的γ-PGA生产,提出了代谢工程结果表明高的潜力gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba生产主机。所提供的信息将被用于指导代谢工程策略进一步研究优化γ-PGA生产葡萄糖为唯一碳源或γ-PGA生产介质E。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以直接到相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

BH阵线,磅的构思和设计研究。BH阵线,RH进行实验和起草了手稿。RH和JB导致了在线测量的设计和数据分析。SP和EF导致了代谢组学实验的设计和数据分析。所有作者阅读和批准最终的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作由德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)在国际研究培训集团1628年“选择性化疗和生物催化(SeleCa)”和德国联邦环境基金会的博士奖学金项目(德意志Bundesstiftung客观世界DBU)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/frfst.2023.1111571/full补充材料gydF4y2Ba

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