两级阀均质增强了乳蛋白浓缩物在重组过程中的颗粒分散，并减少了由此产生的分散物中热诱导的颗粒聚集
埃及Hebishy
玛丽安·勒·贝雷1，- 1爱尔兰科克大学科克学院食品与营养科学学院
- 2爱尔兰科克大学，乳品加工技术中心
- 3.联合王国霍尔比奇林肯大学科学学院国家食品制造中心农业食品技术卓越中心
牛奶蛋白浓缩物(MPCs)是一种高功能成分，其高蛋白变体越来越多地应用于众多领域。本研究的目的是确定作为复水化过程的一部分，均质化对MPC的溶解度和热稳定性的影响。80%蛋白质的MPC粉末(3%蛋白质，w/v)在50°C使用中试规模，两级，阀门均质器在不同的总压力0,5,10,15和20 MPa下进行均质。分析再水化样品的溶解度、粒径、蛋白质分布和热稳定性(在140°C的油浴中加热5分钟时粒径分布的变化)。结果表明，在5 MPa均匀化后，溶解度显著提高。在5-10 MPa压力下的均质化进一步降低了MPC分散体的粒径，进一步增加压力没有额外的影响。均匀化压力增加至10 MPa时，热稳定性增加。这项工作证明了均匀化对MPCs中粒子弥散的积极影响，并确定了改善弥散和热稳定性之间的可能联系。这将作为一种策略应用于乳制品厂，以减少热表面的污垢，这表明在乳制品加工中有重大的经济影响。
1介绍
浓缩牛奶蛋白粉(MPC)由脱脂牛奶经膜处理(超滤、超滤、可选滤、DF)、蒸发和干燥而成，含有所有酪蛋白和乳清蛋白，与原脱脂牛奶(马丁等人，2010年)．MPCs为牛奶固体提供蛋白质丰富的营养来源，并已被应用于许多食品的生产，如奶酪、口服营养补充剂和酸奶(帕特尔和帕特尔，2014)．MPC粉末通常在加工过程中被重新组合并经过各种热处理，而高蛋白MPC的一个缺陷是其补水性能差(Mimouni等人，2010b)．MPC粉末溶解性差的原因是粉末颗粒中酪蛋白胶束释放缓慢(克劳利等人，2015)．
在50°C - 60°C的高温下重组粉末可以帮助MPC粉末的溶解性(方等，2011)．这种方法被广泛使用，但由于成本原因，较低的重构温度可能更可取。
已经提出并评估了几种策略，通过在干燥前进行物理处理来生产具有更好溶解度的高蛋白mpc，例如将UF浓缩物置于高静水压力(HHP) (Udabage等人，2012)、高剪切混合(奥古斯丁等人，2012)、超声检查(麦卡锡等人，2014；闫军等，2014)、微流体化及高压均质化(奥古斯丁等人，2012)．虽然这些方法已经显示出一些前景，但高蛋白MPC粉末的溶解性差仍然是一个挑战。此外，这些策略大多应用于喷雾干燥前的MPC精矿;然而，提高成品粉体复水溶解度的方法研究较为有限。
在使用MPC成分的食品生产过程中，应用了各种加热处理，因此，MPC成分必须抵抗严重的热处理。然而，溶解性差，由于颗粒聚集可能导致加热过程中的热稳定性差。在热加工过程中不锈钢表面的污垢是牛奶蛋白热稳定性差的后果之一。这可能会对生产产生负面影响，影响产品质量并增加生产成本，因为需要额外的加热和泵送来维持产品所需的温度，并恢复过程中的压力下降。此外，清洁产生的沉积物需要能源和大量的水和化学品(古德，阿斯特里亚杜，罗宾斯和弗莱尔，2013年)．甘地等人(2017)报道了MPC80的溶解性差，由于粉末的储存温度高，导致大量污垢。该研究中的污垢实验是在板式换热器上的90°C下进行的，然而，没有使用灭菌温度的相关研究。
虽然多项技术已被应用于改善MPC成分的复水化，包括高压均质(钱德拉帕拉等人，2014)、超声(麦卡锡等人，2014)及水动力空化(Pathania等人，2018)，阀门均质化作为乳制品行业的成熟技术尚未得到充分研究。在阀门均质化中，压力下的流体被迫通过一个小阀门，导致阀门进口和出口之间的压力梯度很大(Grácia-Juliá等，2008)，并产生强烈的剪切力，这被认为是减小小球尺寸的主要力(桑德拉和达格利什，2005年)．Sikand等人(2012)报道称，在37°C时在牛奶渗透液中重组MPC粉，然后在13.8 MPa下均质，可获得更高的溶解度(使用基于离心的溶解度测定，样品被认为是完全可溶的)。据我们所知，到目前为止，还没有一项研究集中在阀门均匀化过程中粉末蛋白质结构变化、复水化溶解度和热稳定性(特别是在灭菌温度下，即UHT)之间的联系。
在本研究中，MPC80粉末分散体在不同的总均质压力(5、10、15和20 MPa)下进行了两级常规均质，一次通过，以研究均质压力对所得到分散体的蛋白质结构、溶解性和热稳定性的影响。一系列的物理化学分析，包括溶解度、粒径分布、使用凝胶电泳的蛋白质分析和在140°C使用油浴的热稳定性测试，用于对均匀化对溶解度和热稳定性的影响进行更基本的了解。
2材料与方法
2.1材料
牛奶蛋白浓缩物(MPC)是从一家爱尔兰乳制品原料制造商获得的。MPC每100克粉末含有95.45克干固体，在干基础上(w/w)， 83.4%的蛋白质，6.72%的灰分，1.07%的脂肪和1.6%的乳糖，由制造商提供。盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)为分析级，由Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易斯)供应。
2.2牛奶浓缩蛋白粉的复水
用Silverson L5RT实验室剪切搅拌机在5000转/分(图1)．使用实验室架空搅拌器低速无涡搅拌分散体2小时，之后使用1 M NaOH或1 M HCl将pH调整为pH 6.8，分散体在上述条件下进行磁混合2小时，之后如果需要，将pH重新调整为pH 6.8。然后将分散体在4°C下储存过夜，并进行低速磁搅拌，以促进矿物的完全复水化和平衡。复水过夜后，将样品平衡到22°C 2小时，之后检查pH值，并根据需要重新调整到pH 6.8。MPC分散体然后在水浴中加热至50°C，随后使用两级中试规模阀门均质器(APV GEA Niro-Soavi s.p.a.，帕尔马，意大利)均质。样品在不施加压力(0 MPa)的情况下通过均质器，或在不同的一级和二级压力组合(4:1、8:2、12:3和16:4 MPa)下进行处理，总压力分别为5,10,15和20mpa。均质条件适用于乳制品行业的正常实践(20 MPa)和更低的压力，以允许选择最低和最有效的压力。样品均质后立即收集并分析溶解度和热稳定性。
图1．作为再水化过程的一部分的重建和均质条件的流程图，以及牛奶浓缩蛋白分散的后续分析。
2.3溶解性的测定
用所描述的方法测定了MPC分散体的溶解度Sikand等人(2012)，做了一些修改。MPC分散制备后，每个样品(3% w/v蛋白质)放置在预先称重的水分盘中。记录含有散装分散样品的水分盘子的重量，之后将盘子放在烤箱中，在105°C下干燥3小时。干燥后，将盘子放在干燥器中大约30分钟，然后称重，并计算总固体含量。剩余分散液的一个子集在700 ×g下离心10分钟，之后去除上清液，按上述方法测定总固体含量。溶解度计算如下:
2.4粒径分布
采用激光衍射仪(Mastersizer 3000 S, Malvern Instruments Ltd.，伍斯特郡，英国)，配备300 RF(反傅里叶)透镜和He-Ne激光器(λ为633 nm)，测量MPC分散体的粒径分布(PSD)(140°C × 5 min加热前后，详见第2.6节)克劳利等人(2015)．样品以超纯水为分散剂引入分散单元，使遮蔽度达到14%(±1%)。采用广义多分散模型对PSD进行分析，粒子折射率为1.46，吸收为0.1，分散剂折射率为1.33。对每个样品进行重复测量。
2.5电泳蛋白谱分析
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在非还原和还原条件下进行Laemmli (1970)MPC分散体(2 mg/ml)孵育在含有0.3 M Tris-HCl (pH 6.8)、5% SDS、50%甘油和100 mM二硫苏糖醇的还原样品缓冲液中(Pierce, Rockford, IL，美国)，然后在95°C下加热5分钟，并将蛋白质加载到预铸的4%-20%丙烯酰胺，10 × 10厘米的tris -甘氨酸蛋白凝胶体系的孔中，使用AcquaTank迷你凝胶装置(Acquascience, Uckfield，英国)。在恒定电压下进行电泳分离(160 V, 35-45分钟)，凝胶从电泳单元中取出，固定，用考马斯亮蓝R-250进行蛋白染色(22°C, 18小时)，并染色(O'Regan和Mulvihill, 2009)．
2.6热稳定性
MPC分散体的热稳定性在140°C (pH 6.8)下测定，使用的热凝固时间(HCT)测定方法由戴维斯和怀特(1966)，做了一些修改。样品(2.5 ml)装入玻璃管(长度130mm;外径:10mm;壁厚2毫米)，置于140℃的油浴中5分钟，以约8分钟的速度轻轻摇晃−1．检索样本并对其稳定性进行目视评估;如果样品显示出任何可见的斑点、絮凝体或聚集蛋白颗粒，则将其归类为不稳定样品。样品的粒径分布也进行了分析，详见章节2.4。与加热前相比，加热后颗粒尺寸的任何增加也被用作热稳定性的衡量标准。
2.7统计数据分析
所有实验均使用同一批次牛奶浓缩蛋白粉进行。使用新制备的MPC分散体进行重复测量，结果以均值和标准差表示。采用R Commander程序V.2.15.0统计分析包(the R Foundation for statistical Computing, Vienna, Austria)，进行单向方差分析(One-way variance, One-way ANOVA)，然后进行Tukey 's mean comparison检验，找出均值之间差异的显著性。显著性水平确定为p< 0.05。
3的结果
研究牛奶蛋白粉的溶解度和热稳定性是非常有趣的，因为它们通常用于研究或工业应用，作为新鲜牛奶浓缩物的替代品。剪切混合法制备的MPC样品溶解度较低(87%;图2)过夜后再补充水分。均质化的应用提高了MPC的溶解度(图2)．在无压力(0 MPa)的均质器中，通过高剪切搅拌重组的MPC样品的溶解度从87%略微增加到88%，尽管溶解度的增加没有统计学意义。在5 MPa的均质压力下，溶解度显著提高，从87%提高到91%，但增加均质压力后，溶解度没有进一步提高。
图2．牛奶蛋白浓缩液分散体的溶解度指数(%)，在5,000 rpm下进行高剪切搅拌，并在0、5、10、15和20 MPa总压力下进行两级均质，作为复水过程的一部分。
均匀化在5 ~ 20 MPa之间进行，以确定达到酪蛋白胶束大小附近的单模态粒径分布所需的最低压力。在经过高剪切混合和均质化处理的样品中，粒径分布(PSD)的变化总结在表1而且图3．高剪切混合处理的MPC样品的PSD分析显示出双峰分布，第一个峰代表颗粒<1µm，第二个峰代表较大的颗粒，平均粒径为50µm (图3一)．在没有施加压力(0 MPa)的情况下，将MPC分散体通过均质器，颗粒尺寸显著减小，如图所示表1，但并未导致第二峰的完全消除(图3 b)．相比之下，MPC分散体在5 MPa均匀化后显著(p< 0.05)粒径变小，第二峰明显减小，表明原本未溶解的粉末颗粒破碎、解离、溶解。虽然当施加压力大于10 MPa时PSD中的第二个峰几乎完全消除(图3氟)，并没有观察到颗粒尺寸进一步明显减小(表1)．
表1．牛奶蛋白浓缩液分散体在(BH)加热前和(AH)加热后的粒径分布参数，以5000 rpm的高剪切搅拌，然后在0,5,10,15和20 MPa下进行两级均质，作为复水过程的一部分。
图3．前粒径分布(f)之后,(G-L)加热(140°C 5分钟)牛奶蛋白浓缩液分散，以5000转/分钟的速度进行高剪切搅拌(G)以及0点的2级均质化(B、H), 5(C I), 10(J D), 15(E、K)20 MPa(F、L)作为补水过程的一部分。
在非还原和还原条件下，使用SDS-PAGE对不同压力(0-20 MPa)下高剪切混合和均质处理制备的MPC分散体的蛋白质谱进行分析，以确定均质处理是否影响蛋白质-蛋白质相互作用的类型(图4)．在非还原性SDS-PAGE中，主要酪蛋白带(α年代-和β-CN)的含量略高于对照，尤其是在15和20 MPa的均质条件下，而在非还原条件下κ-CN对应的条带似乎不存在。与乳清蛋白(α-乳清蛋白和β-乳球蛋白)相对应的条带在对照组和处理样品之间显示出相同的强度，没有差异。
图4．十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在非还原和还原条件下，以5000 rpm(对照)的高剪切搅拌和在0、5、10、15和20 MPa总压力下的两级均质制备的牛奶蛋白浓缩样品，作为复水过程和后续处理的一部分。
在非还原条件下，所有样品均存在高分子量聚集物(>200 kDa)，且能带强度相似。当β-巯基乙醇被用作还原剂时，高MW聚集体被完全消除，对照和均质样品之间没有差异。此外，与非还原条件相比，所有样品中的乳清蛋白带强度都有所增加。此外，在还原条件下，κ-CN带明显，且在对照样品中强度最高。
通过在140℃、pH 6.8的油浴中加热5分钟，评估了均匀化前后MPC分散体的热稳定性。作为热稳定性的测量，PSD在每个样品加热后进行测量，并与未加热的样品进行比较(表1而且图3)．加热后，经过高剪切搅拌的样品呈双峰分布(即与加热前的PSD相似)，但与加热前的(50-60 μm)相比，第二峰的粒径(200-300 μm)明显增大;图3 a、G)．在没有施加压力(0 MPa)的情况下，将MPC分散体通过均质器，其PSD与对照未均质样品相似，但D90值更大(液滴大小位于分布的90%分位数)(表1而且图3 b、H)．虽然在5 MPa的均质作用下加热后的D90值较低，但与高剪切混合和0 MPa的样品相比，数据表明在5 MPa压力下的均质作用不足以提高MPC分散体的热稳定性;均匀化对热稳定性的影响只有在压力增加到10 MPa时才显现出来。然而，当施加压力大于10 MPa时，加热样品的D90值没有进一步下降。
4讨论
像MPC这样的高浓度蛋白粉的主要问题是它们的溶解度低，溶解能力不足(卡尔和戈尔丁，2016年)．目前的研究结果表明，在室温下使用剪切搅拌再水化时，MPC粉末的溶解度较差，这与先前报道的MPC80 (Eshpari等人，2014)．其他研究人员报告了这一点(Anema et al.， 2006)是由于在复水过程中酪蛋白溶解不良，许多因素都可能影响，包括水溶液的组成，粉末制造过程中的加工条件(Felix da Silva等，2018)、粉末贮存条件(Barbosa-Cánovas等，2005)，粒子结构(盖亚尼等人，2006)及补液条件(盖亚尼等人，2009)．Mimouni等人(2010a)而且麦肯纳(2000)报告了由非胶束蛋白的胶束交联引起的酪蛋白胶束之间的相互作用，这种相互作用在粉末储存期间增加，导致紧凑和紧密填充的胶束结构，这促进了低分散聚集物的形成。
仅用剪切搅拌作为分散体的处理，不能有效地溶解粉末颗粒和提高溶解度。然而，采用阀门均质技术显著提高了溶解度。据报道，当剪切混合器用于MPC粉再水化时，获得粒径减小和单模态分布是困难的(钱德拉帕拉等人，2014)．作者报告说，与低剪切相比，高剪切转子定子系统(Ultraturrax)不会显著减小MPC90和胶束酪蛋白(MC)的粒径分布(PSD)。他们还指出，尽管高压均质(12和20 MPa)使PSD朝着酪蛋白胶团大小方向移动，但不足以使MPC90和MC的粒径分别达到约0.2 μm的单模态分布。这也支持了目前研究中PSD的结果，PSD显示了第二个峰值的减少，但并不是完全消除。
应用均匀化处理后MPC分散体溶解度的增加可能是几种不同机制的结果，包括:(1)诱导现象，如剪切、湍流、空化和温度升高(Bouaouina等人，2006(2)酪蛋白胶束解体，增加钙和磷盐的溶解度(Kielczewska et al.， 2006)和/或(3)空化引起的氢键和疏水键断裂(Jambrak等人，2009年)．sds - page (图4)表明均质作用于蛋白粉颗粒之间物理联系的破坏，而不影响单个蛋白质成分或它们之间的相互作用。其他使用高压均质的研究亦报告了类似的结果(钱德拉帕拉等人，2014)及超声检查(Jambrak等人，2009年；Tang等，2009)．
本研究的结果与以往使用均质化的研究结果一致。在研究Sikand等人(2012)， MPC80分散体在37℃时在牛奶渗透液中重建，随后在14 MPa下均质，其溶解度最高(100%)，作者将其归因于颗粒尺寸的减小。高压均质(HPH)也被用于改善蛋白质的溶解度和其他功能特性，如甘氨酸(Luo等，2010)和乳清蛋白(Dissanayake和Vasiljevic, 2009)．
通过测量蛋白质分散体颗粒尺寸的减小，可以监测乳粉溶解的速率和程度(布维耶等人，2013)．其他研究人员(克劳利等人，2015；麦卡锡等人，2014；Pathania等人，2018)报告了与当前研究中发现的MPC80相似的PSD谱。克劳利等人(2015)定义两个峰为(1)<1µm的酪蛋白胶束和(2)˃10µm的初级粉末颗粒。第二个峰值可能与浓缩和干燥过程中(酪蛋白-酪蛋白和/或酪蛋白-乳清蛋白相互作用)由非共价相互作用形成的更大的粉末颗粒有关，形成聚集物(Zisu等，2010)．类似的PSD剖面报告钱德拉帕拉等人(2014)MPC90使用单级均质。作者报告说，使用均匀化会导致极端的剪切力，导致通过低速顶搅拌制备的原始颗粒(100微米)几乎完全破坏为直径1-10微米的更小颗粒。作者报告说，当所施加的压力从8 MPa增加到20 MPa时，颗粒尺寸没有进一步减小，这与本研究的结果一致。
结果表明，MPC80在加热时的热稳定性较差，这是由于其固有的高钙离子活性，高蛋白质含量和较差的溶解性。均质化处理导致热稳定性的改善，这可能归因于均质化处理能够破坏粉末颗粒之间的物理联系，如SDS-PAGE (图4)．类似的结果已被报道Koh et al. (2014)对乳清蛋白浓缩液(WPC80)分散体应用高剪切搅拌、超声和均质，提高了蛋白质分散体的热稳定性。
本研究显示了MPC80的溶解度、PSD和热稳定性之间的相互作用甘地等人(2017)．作者报告了MPC80的高度污垢(这与热稳定性直接相关)，这是在高温下储存粉末的溶解度显著降低的结果。在一项旨在了解脱脂牛奶UF前pH调整对MPC膜性能和物理功能影响的研究中，Luo et al. (2015)溶解度和热稳定性随饲料pH值的变化呈现相同的趋势。
在本研究中，溶解度和热稳定性之间的关系可能是由于MPC中未溶解的粉末颗粒充当种子或核，用于进一步聚集/凝固。向同一蛋白质的单体溶液中加入特定蛋白质的聚合种子，可通过外源播种实现高效聚合，从而加速聚合(Jarrett & Lansbury, 1993)．均质化可能增加了MPC分散体的热稳定性，通过(1)增加MPC中蛋白质的负表面电荷(zeta电位)，增加蛋白质颗粒之间的静电斥力，或(2)通过空化破坏氢键和疏水相互作用形成可溶性蛋白质聚集，抑制进一步聚集的形成(蒋等，2014)及改善热稳定性(Ryan等人，2013年)．
5的结论
均质化极大地提高了牛奶浓缩蛋白分散体的溶解度和热稳定性，热稳定性随溶解度的增加而增加。施加高达10兆帕的压力足以提高溶解度和热稳定性;然而，当施加更高的压力时，没有观察到进一步的改善。这项工作为利用均质化来改变MPC成分的复水化和热稳定性提供了新的见解。未来的工作需要考虑其他参数，以更好地理解均质化导致的结构变化，例如使用zeta电位的表面电荷和流变行为的变化。这也将考虑在不同的热制度下重组粉末的污垢行为。
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。
作者的贡献
EH:数据管理;正式的分析;调查;方法;写作-初稿，监督。ML:数据管理;正式的分析;调查。SC:调查;方法,监督。 JO: Conceptualization; funding acquisition; project administration; resources; supervision; validation; visualization.
资金
这项工作由爱尔兰国家通过技术中心计划(拨款号TC/2014/0016)的资金支持。
致谢
作者想要感谢乳制品加工技术中心(DPTC)，一个爱尔兰企业的倡议，为财政支持，并允许发表这项工作。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
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关键词:牛奶浓缩蛋白，溶解度，热稳定性，阀门均质，均质压力
引用:Hebishy E, Le Berre M, Crowley SV和O 'Mahony JA(2022)两级阀均质增强了乳蛋白浓缩物在重组过程中的颗粒分散，并减少了由此产生的分散物中热诱导的颗粒聚集。前面。食物。科学。抛光工艺。2:1032373。doi: 10.3389 / frfst.2022.1032373
收到:2022年8月30日;接受:2022年9月21日;
发表:2022年10月10日。
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