原始研究的文章

前面。疯狂的。,12September 2022
秒。痴呆的细胞和分子机制
卷1 - 2022 | https://doi.org/10.3389/frdem.2022.941879

Aβ播种的影响依赖于存在的基因敲入应用程序^问−G−F老鼠

肖恩·g·Lacoursiere ¹,

雅罗西克回历2月 ²,

大卫Westaway³,

马吉德·h·Mohajerani ¹和

罗伯特·j·萨瑟兰 ¹ ^*

¹行为神经科学中心加拿大莱斯布里奇大学莱斯布里奇,AB,加拿大
²病理学、神经病学、精神病学和国家朊病毒疾病病理学监测中心,医学院的哦,克利夫兰凯斯西储大学美国
³朊病毒蛋白质折叠中心疾病,阿尔伯塔大学,埃德蒙顿,加拿大AB

阿尔茨海默病(AD)的特点是prion-like amyloid-β传播(Aβ)。然而,Aβ在认知障碍的作用尚不清楚。确定因果Aβ在广告中的作用,我们鼠脑内播种内嗅皮层的第三只手应用程序^问−G−F小鼠模型的Aβ肽来源于病人死于迅速发展的广告。当老鼠3个月或1月播种后,莫里斯空间学习和记忆测试使用水的任务。免疫组织化学标记显示播种发现AβAβ斑块沉积和microgliosis加速应用程序^问−G−F老鼠,但这是依赖于把基因的存在。然而,我们没有发现病理之间的相关性和空间性能。本研究的结果显示,在播种的影响应用程序^问−G−F敲入模型,这些都依赖于一个人性化的存在应用程序基因。但这些病理变化最初没有因果的记忆障碍。

介绍

阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆症,影响到数以百万计的人们,社会和货币成本(高阿尔茨海默氏症协会,2019)。它的特点是典型的病理阶段amyloid-β(Aβ)聚合和神经原纤维缠结形成进步(Braak Braak, 1991;Ettcheto et al ., 2018)——蛋白质聚集被认为是广告的核心病机(弗瑞森和Meyer-Luehmann 2019;麦卡利斯特et al ., 2020)。的病理过程与记忆丧失有关,受损的思维能力,在日常生活的方方面面,最终,障碍(Matteson et al ., 1996;费理et al ., 2004;德•伍格特et al ., 2005)。广告的原因可能是prion-like Aβ蔓延,导致神经炎症,斑块沉积,hyperphosphorylationτ,最终导致突触损失和脑萎缩(哈珀·兰斯伯里,1997;布鲁姆2014;沃克et al ., 2018)。

颅内播种已经成为一种有效的工具来理解蛋白质聚合在神经退行性疾病的作用,因为它允许控制空间和时间的淀粉样变(弗瑞森和Meyer-Luehmann 2019)播种Aβ加速Aβ斑块的沉积在活的有机体内prion-like的方式(沃克et al ., 2016;奥尔森et al ., 2018),本机Aβ物种是错误折叠后的模板和构象性质播种Aβ(et al ., 1993;会怎样,2013)。播种的影响也依赖于宿主的基因型:没有突变的小鼠应用程序或者只拥有鼠应用程序没有显示出这种效果,或者,如果他们这样做,之前所需的孵化时间增加显著效果是(Meyer-Leuhmann et al ., 2006;会怎样et al ., 2009;弗瑞森和Meyer-Luehmann 2019)。

颅内播种的大部分工作已经完成使用第一代小鼠模型使用合成或小鼠Aβ(麦卡利斯特et al ., 2020);然而,由于存在应用程序工件在第一代小鼠模型,关于Aβ病理学的相关性的结论,播种的影响,和行为结果的问题(Sasaguri et al ., 2017,2022年)。最近,敲入应用程序^问−G−F小鼠模型已经开发(齐藤et al ., 2014)。开发第二代,敲入模型,小鼠Aβ序列首先是人性化的,和瑞典,Beyreuther /伊比利亚,北极插入突变。瑞典(NL)突变(KM670/671NL)增加生产APPβ和c端片段包含整个Aβ序列在神经细胞(Shin et al ., 2010)。Beyreuther /伊比利亚(F)突变(I716F)增加Aβ的比率₄₂对Aβ₄₀并应用c端片段也降低了应用胞内域生产;这被认为是由于减少应用γ-secretase由于蛋白水解作用的突变导致蛋白质缺乏处理γ-secretase (Guardia-Laguarta et al ., 2010)。北极突变(G)改变绑定属性的各种Aβ抗体免疫组织化学(齐藤et al ., 2014)。

几项研究病理学的发展,功能连接和行为这些老鼠在多种条件下的表型(贾法里et al ., 2018;Latif-Hernandez et al ., 2019,2020年;Mehla et al ., 2019;Upite et al ., 2020)。研究使用这种Aβ播种,播种加速Aβ沉积两项研究发现,但是没有测试播种后的小鼠的行为(Purro et al ., 2018;Ruiz-Riquelme et al ., 2018)。解决缺乏行为测试后立即播种,我们播种人类Aβ进入应用程序^问−G−F小鼠模型。

在这里,我们想确定播种Aβ会导致立即在空间学习和记忆障碍应用程序敲入小鼠模型,并进一步了解突变的存在如何影响播种在Aβ沉积的影响,还对小胶质细胞的反应。我们用年轻的老鼠来确定初始Aβ沉积引起的认知障碍没有任何其他内生生成的病理学和认知障碍。

首先,我们预测,老鼠播种与Aβ显示减少的空间学习和记忆;第二,据预测,把突变的存在和没有确定播种效果和认知障碍的程度。最后,我们预测,Aβ播种会增加活化的小胶质细胞。总的来说,我们发现,播种人类HPC组织的影响和Aβ包含组织依赖的存在问G F基因敲入。

方法

主题

53个敲入应用程序老鼠被播种在这项研究。同样数量的男性和女性使用老鼠(31岁男性,22岁女性)没有发现性别差异在之前的描述(Mehla et al ., 2019)。老鼠笼在标准住房,2 - 5每笼老鼠,并保持在12 h光/暗周期。给出的老鼠随意食物和水。前处理的小鼠行为测试,完成大约在同一时间在光周期由实验者蒙蔽的条件。

创建的老鼠穿越日本物理化学研究所和老鼠C57Bl / 6 j老鼠。老鼠分组基于基因型和种子。老鼠或纯合子的负面(应用程序^−−/),携带没有突变;杂合的(应用程序^{+ /−}),只有一个副本的瑞典,Beyreuther /伊比利亚,和北极突变;和纯合子的积极(应用程序^{+ / +}),携带两个打副本的突变。老鼠被随机分配与控制或rpAD播种种子。看到表1最后分组。

表1

表1。基因型和种子用于分组行为测试(和免疫组织化学分析)。

基因分型

打老鼠耳朵组织受到DNA提取、PCR循环使用Millipore-Sigma RedExtract-N-Amp组织PCR试剂盒(xnat - 100 rxn)。PCR循环条件:94°C 3分钟,94°C 30年代,57为45°C, 72°C x 1分钟35周期。储存在4°C。日本研究所的引物序列得到:E16WT: 5′atc TCggAAgTgAAgATg-3′;E16MT: 5′-ATCTCggAAgTgAAT CTA-3′;WT: 5′-TgTAgATgAgAA CTT AAC-3′;排气口loxP: 5′cgt ATA ATgTATgCT ATA Ag-3′。PCR产品装上琼脂糖凝胶电泳进行可视化,与野生型乐队在700年英国石油公司和突变乐队在400个基点。

Aβ种子

Aβ种子来自人类海马组织(国家朊病毒疾病病理学监测中心在凯斯西储大学医学院),评估纯度,stereotaxically注入。大学医院的机构审查委员会批准(IRB)是为所有解剖人体组织(“丢弃”),和所有样品都是匿名(编码)和处理符合国家卫生研究院政策来保护隐私。种子的类型取决于广告发展的速度。有效控制组织的生化分析显示零AβAβ(D / N)的比例₄₀或Aβ₄₂根据沉降速度,但Aβ%,校准蔗糖成分,显示Aβ~ 8至12%₄₀和Aβ₄₂控制(科恩et al ., 2015)。此外,AβrpAD种子表现出更高的水平₄₂粒子30至100单体几个粒子< 30单体;因此,高分子量的rpAD种子颗粒。正是这些单体引发Aβ播种的初始阶段(Katzmarski et al ., 2019)。所有脑组织匀浆与磷酸盐缓冲(PBS)的pH值7.4和保持在−80°C。种子10% w / v。之前的组织,组织经历了几个选择标准步骤。

1。推荐全国朊病毒疾病病理学监测中心对朊病毒疾病进行分类。

2。6个或更多的患者每年下降点。

3所示。没有常染色体显性广告模式。

4所示。没有突变在人类朊病毒蛋白质。

5。Aβ和τ蛋白类似零星的阿尔茨海默氏症。

6。没有其他神经病理疾病。

7所示。85%置信区间内的所有结果。

另外五个入选标准的古典阿尔茨海默病组织使用,如下:

1。明确临床诊断阿尔茨海默氏症。

2。没有痴呆的常染色体显性遗传模式。

3所示。阿尔茨海默病基于τ和Aβ蛋白质。

4所示。没有与其他神经病理疾病发病率。

5。结果在95%置信区间内。

颅内播种立体定位手术

老鼠皮下注射丁丙诺啡(Vetergesic;0.05毫克/公斤;浓度= 0.03毫克/毫升)麻醉诱导前30分钟(异氟烷)。氧气流量之间的感应是4和5 L / min,异氟烷是逐步地增加到最多5 L / min。氧气和麻醉流率降低到0.9和1.5 3 L / min,分别在手术期间。头被剃后,头皮被清理过4% stanhexidine (Omegalab),其次是70%异丙醇。利多卡因(0.1毫升的0.2%;头皮下Rafter8)皮下注射。前囱被用来寻找内侧的立体定位坐标内嗅皮层(艾伦脑科学研究所,2016年)。用于注射的坐标是美联社:−4.48 ML: 3.00, DV: 3.44目标内嗅皮层内侧。钻是一个直径0.5毫米的孔通过大脑在头骨坐标。

组织匀浆是涡30年代之前被加载到微量吸液管。每个老鼠收到2μL(1μL /半球)Aβ或控制组织匀浆。播种了Nanoject II(德拉蒙德科学公司,PA)将慢慢注入50.6问。在播种之前,注入测试是为了确保正确的流程,和微量吸液管和70%异丙醇清洗。微量吸液管插入大脑在描述的位置,并允许在第一次注射前休息2分钟,与所有注射后相隔20年代总共20注射。微量吸液管在地方呆了2分钟后,最后注入之前删除。测试注入又做了微量吸液管被删除后,和微量吸液管和70%异丙醇清洗之前下一个半球注入。老鼠一直在同一个12-h-light /黑暗周期在复苏。

灌注和切片

行为测试后,小鼠的腹腔内注射过量戊巴比妥钠和灌注transcardially 1 x磷酸盐(PBS)和4%多聚甲醛(PFA)。24小时的大脑被固定在4% PFA被转移到一个解决方案之前30%的蔗糖溶液至少3天。大脑被分段frozen-sliding切片机在40μm 1:6系列并存储在1 x PBS + 0.02%叠氮化钠溶液直到染色。染色之前,大脑部分安装在超级霜带正电的幻灯片,允许枯竭适合30分钟,并存储在一夜之间在4°C。

Aβ沉积和小胶质细胞免疫组织化学

幻灯片在PFA 4% 4分钟,冲洗洗1 x三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS),并接受了70%的甲酸清洗。幻灯片1 X TBS冲洗,TBS-A Triton X (1 X TBS + 0.1%),和TBS-B [TBS + 0.1% Triton X + 2%牛血清白蛋白(BSA)]。使用的初选是:反- 82 e1(一个Anti-β-amyloid (N), IBL, 10323年,鼠标]1:1,000和Anti-Iba1和光)(兔子,019 - 19741,kouichi−20 c 1:1,000, 1毫升/ TBS-B下滑了2天在黑暗潮湿的商会,RT密封在转子上的塑料包装50 rpm。初级孵化后,TBS, TBS-A TBS-B洗是重复的。辅助使用:反-鼠标- alexa - 488(免疫球蛋白(H + L)山羊,Abcam, ab150113] 1:1,000和反-兔子alexa - 594(免疫球蛋白(H + L)山羊,表达载体,A11037] 1:1,000(1毫升/幻灯片)TBS-B一夜之间在黑暗潮湿的室密封在转子上的塑料包装50 rpm。二次洗1 x TBS和封面与Vectashield + DAPI下滑。

成像

Full-slide成像完成数字幻灯片上扫描仪(NanoZoomer 2.0 - r、滨松、日本)20 x放大。使用民主党幻灯片图像导出。观点2。量化的Aβ斑块和microgliosis是由像素和对象分类使用iLastik (1.3.0-OSX版)(Berg et al ., 2019)和ImageJ(版本1.51)。ILastik训练分别段斑块和活化的小胶质细胞。阈值在0.3和0.4之间,大小过滤至少10像素。部分从~美联社1.7−4.77,加工和计数为每个部分在组平均。

装置

MWT池直径是1.55米与水温度保持在21±1°C,白色,12.5厘米水下目标平台和畅通无阻的远端边缘周围的线索。摄像机固定在天花板上连接到一台笔记本电脑2100年与HVS形象,用来追踪模式小鼠的游泳。

过程

在2个月大的时候,老鼠鼠脑内注入人体组织或rpAD种子。一个月播种后,使用参与者的老鼠进行测试来确定这播种导致空间学习和记忆的一个障碍。四30年代试验给出的老鼠每天6天。每天的起始位置是pseudo-randomized基于红衣主教开始位置,每个序列的起始位置是不同的每一天。7天,小鼠使用no-platform探针进行测试。池的温度保持在一个很酷的21°C到激励老鼠逃跑。测试后,组织收集评估Aβ沉积的程度和microgliosis。

统计数据

四个参数测量在MWT培训:鼠标隐藏平台的距离,时间找到平台,路径长度,游泳速度。培训后,老鼠no-platform探测器测试试验,并在目标象限的时间与对方象限,和两个相邻象限的平均值。的病理分析、数量和大小的整个大脑Aβ斑块测量以及小神经胶质细胞的数量。

双向重复测量方差分析Dunnett的多重比较检验被用于确定显著降低小鼠游泳参数从1日到最后一天的培训和确定目标象限中所花费的时间是影响种子和基因型,使用时间在目标象限作为因变量。探头检测性能也比机会性能使用single-tailed-paired样品(25%)t以及我们只是想知道如果性能比的机会。

播种rpAD种子的影响是未知的,很难指定感兴趣的影响大小。此外,我们当时是在测试播种是否会有影响,而不是一定的规模效应。因此,资源方程方法被用来确定样本容量是足够的。误差自由度测定47:六个治疗组的总数减去实验单位,53把误差自由度远高于所需的量来检测指定的效果(费斯汀et al ., 2002)。

所有数据都是通过使用棱镜9 (mac OS)。

结果

播种控制或rpAD种子进入应用程序^{+ / +}导致显著增加小鼠血小板计数(F₍₁₁₎= 136.1,p< 0.0001),斑块大小(F₍₁₁₎= 150.4,p< 0.0001)和活化的小胶质细胞细胞(F₍₁₁₎= 18.19,p= 0.0003)相比的应用程序^−−/和应用程序^{+ /−};这两个没有Aβ斑块病理或活化的小胶质细胞(图1一个和B)。种子被发现血小板计数无显著影响(F₍₁₁₎= 0.303,p= 0.593),斑块大小(F₍₁₁₎= 1.64,p= 0.227),或活化的小胶质细胞F₍₁₁₎= 0.472,p= 0.507)。看到补充图1病理学评估4个月后播种。

图1

图1。Aβ和小胶质细胞病理学分析播种后1个月。(一)代表免疫组织化学染色的显微照片Aβ斑块(82 e1,绿色)和小胶质细胞(Iba1、红色),播种后控制HPC的组织(蓝色)和rpAD种子(橙色)(B)。量化的牙菌斑和小胶质细胞(i)血小板计数(ii)斑块大小,和(3)小胶质细胞的显著增加应用程序^{+ / +}老鼠与C和rpAD种子播种后。比例尺= 1毫米。*p< 0.05;* *p< 0.01,* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。

虽然没有斑块的数量或大小的差异被发现之间的应用程序^{+ / +}C和rpAD-seeded老鼠,rpAD-seeded老鼠表现出显著相关性小神经胶质细胞的数量和斑块的数量,而应用程序^{+ / +}C小鼠并没有表现出显著相关性(图2)。负相关显著的活化的小胶质细胞和斑块的大小应用程序^{+ / +}C的老鼠,但这种相关性并不在rpAD老鼠。

图2

图2。相关的牙菌斑和小胶质细胞计数1个月后播种应用程序^{+ / +}老鼠播种的(一)控制(n= 2的大脑,)(B)rpAD种子(n= 3)之间的相关性是指血小板计数(i)或(ii)和斑块大小的数小胶质细胞数量完整的大脑部分抽样从1:6切片系列。围绕数据(Bi)和(Bii)插图所示。

从数据,很明显,一个应用程序^{+ / +}rpAD鼠标可比Aβ斑块数和大小但不超过50活化的小胶质细胞数。分别删除low-microglia数据和分析,血小板计数和小胶质细胞仍然显著正相关;然而,斑块大小和小胶质细胞计数成为显著正相关(p= 0.0047)。单独的应用程序^{+ / +}rpAD鼠标时小胶质细胞分析分别显示了较低血小板计数和小胶质细胞之间显著正相关(p= 0.004),但斑块的大小和小胶质细胞数之间的相关性被发现显著负相关(p= 0.0238),血小板计数和小胶质细胞数增加,但是,随着小胶质细胞增加,斑块大小的减少。

当训练和测试参与者(图3一- - - - - -F),小鼠表现出显著减少邻近在训练(F₍₂₃₅₎= 14.41,p< 0.0001)。虽然没有组织差异被发现(F₍₄₇₎= 0.901,p= 0.489),一个重要的组×天相互作用被发现(F₍₂₃₅₎= 1.690,p= 0.025)。的应用程序^−−/C和应用程序^−−/rpAD老鼠显示显著减少之间的距离第一和最后一天的培训(p< 0.01)也是如此应用程序^{+ /−}rpAD (p< 0.05)和应用程序^{+ / +}rpAD老鼠(p< 0.0001)—应用程序^{+ / +}rpAD-seeded老鼠显示显著减少邻近后1天的培训(p= 0.01)。的应用程序^{+ /−}C小鼠并没有显示出显著减少之间的第一和最后一天,也显示出由第五天显著减少;的应用程序^{+ / +}C小鼠没有任何明显的减少(图3一我)。

图3

图3。MWT播种后的性能。(两者)显示应用程序的性能^−−/、应用程序^{+ /−}和应用程序^{+ / +}老鼠,分别。(我)。接近目标,(ii),延迟逃离,(iii)游泳速度测量在六天的训练。d代表池设置的示意图。e .累计接近目标在探测器试验显示组间无显著差异。f代表游路径下面象限立即崩溃的时间(我)。应用程序^−−/(2)。应用程序^{+ /−},(iii)。应用程序^{+ / +}老鼠。

老鼠还显示显著减少延迟逃往培训(F₍₂₃₅₎= 15.19,p(< 0.0001),但没有组差异F₍₄₇₎= 1.190,p= 0.329)或一组x天互动(F₍₂₃₅₎= 0.969,p= 0.510)被发现。所有组的老鼠显示显著减少延迟逃跑。的应用程序^−−/C,应用程序^−−/rpAD,应用程序^{+ /−}C,应用程序^{+ / +}C,应用程序^{+ / +}rpAD所有显示显著减少延迟逃脱最后一天(p< 0.05),但应用程序^{+ /−}rpAD只显示显著减少5天(图3一(二)。

游泳的速度被发现在训练显著增加(F₍₂₃₅₎= 20.32,p< 0.0001),组间的显著差异被发现(F₍₄₇₎= 3.84,p= 0.005);没有发现组x天互动(F(235)= 1.23,p= 0.218)。所有的群体,除了应用程序^{+ /−}rpAD和应用程序^{+ / +}C显著增加了从1日游最后俊培训(p< 0.05)。的应用程序^{+ /−}C和rpAD老鼠都发现有一个总体显著更快的速度比游泳应用程序^{+ / +}rpAD老鼠(p< 0.05;图3一iii)。

no-platform探针试验中基因型,比较被用来确定小鼠花了更多时间在目标象限相比,平均两个相邻的象限和对方象限(反对象限是开始象限)。这两个应用程序^−−/C和rpAD老鼠花了更多时间在目标象限与非目标象限(F₍₅₆₎= 10.83,p= 0.0001),但种子没有影响(F₍₂₈₎= 0.0003,p= 0.985)。无论是应用程序^{+ /−}C或rpAD老鼠花了更多时间在目标象限(F₍₁₆₎= 1.98p= 0.170),但,种子对性能没有明显的影响(F₍₈₎= 0.556,p= 0.477)。在应用程序^{+ / +}老鼠,明显表现出对目标被发现(F_(2、22)= 5.59,p= 0.012),总体上倾向于目标象限比反对(p= 0.0479)和相邻(p= 0.0150)象限。的应用程序^{+ / +}rpAD小鼠表现出明显的偏好目标象限相比邻象限(p< 0.05),但不是对立的象限。的应用程序^{+ / +}C小鼠没有表现出明显的偏好为目标象限(图3 b我)。此外,不显著影响种子的F₍₄₇₎= 0.0283,p= 0.867)或基因型(F₍₄₇₎= 0.892,p= 0.417)被发现在累积到目标位置的距离。

当比较目标象限中所花费的时间和机会表现,应用程序^−−/C (t₍₁₄₎= 2.144,p= 0.025),应用程序^−−/rpAD [t₍₁₄₎= 3.191,p= 0.003),应用程序^{+ /−}rpAD [t₍₂₎= 2.925,p= 0.0498),应用程序^{+ / +}C (t₍₃₎= 2.769,p= 0.035)应用程序^{+ / +}rpAD [t₍₈₎= 2.732,p= 0.0129)的小鼠相比,花更多的时间在目标象限是什么预测的机会。的应用程序^{+ /−}C小鼠上面没有显示性能的机会(t₍₆₎= 1.244,p= 0.130)。此外,当看着老鼠穿过平台位置是否在调查试验中,83%的应用程序^−−/C小鼠,92%的应用程序^−−/rpAD, 83%的应用程序^{+ /−}C的100%应用程序^{+ /−}rpAD, 50%的应用程序^{+ / +}C和57%的应用程序^{+ / +}rpAD老鼠穿过至少一个平台。游泳也显示模式应用程序^−−/和应用程序^{+ / +}路径更直接在目标象限,而应用程序^{+ /−}老鼠更分散的模式游泳、路径跟踪池的边缘。

最后,准时性没有影响被发现在目标象限(F₍₄₁₎= 0.345,p= 0.560)。

尽管并不是所有的老鼠显示偏好目标象限与非目标象限相比,无显著影响的种子F₍₄₇₎= 0.0141,p= 0.906)或基因型(F₍₄₇₎= 0.692,p= 0.506)被发现在目标象限的时间。

总而言之,没有显著影响的基因型或种子或组间显著差异被发现在参与者的整体性能的老鼠,尽管并不是所有的组织表现出目标位置的重要学习或记忆。的应用程序^−−/小鼠学习和记忆,应用程序^{+ /−}老鼠没有,只有应用程序^{+ / +}rpAD老鼠显示偏好目标象限尽管应用程序^{+ / +}C小鼠显示出一些学习的证据,尽管所有的组织显示显著更大的性能相比,机会,除了应用程序^{+ /−}C小鼠。

给出的结果表明,1个月后播种人体组织和AβAβ斑块病理蛋白质增加,这是依赖问G F突变的存在应用程序基因。测试参与者时,老鼠显示他们能够学习和记忆的位置除了隐藏的平台应用程序^{+ /−}C小鼠。尽管最广泛的病理学,应用程序^{+ / +}老鼠能够成功地学习任务。然而,应用程序^{+ / +}老鼠老鼠的最小比例,显示至少一个平台,而应用程序^{+ /−}老鼠老鼠穿越平台的相对较高的出现至少一次。

讨论

在这里,我们表明,最初的病理学AD-microglia激活和Aβ斑块沉积是依赖的结合把基因和种子。每个组合导致独特的表型的表达行为,Aβ沉积,年轻的小胶质细胞的激活模式应用程序^问−G−F老鼠。颅内播种后,一个月前,当自然内生发展Aβ斑块沉积和microgliosis发生,我们发现Aβ斑块沉积和microgliosis增加应用程序^{+ / +}老鼠,但不是的应用程序^−−/和应用程序^{+ /−}老鼠。直到4个月后播种Aβ斑块沉积发生在最小应用程序^{+ /−}播种老鼠(补充图1)。但是没有Aβ斑块病理或microgliosis被发现的应用程序^−−/老鼠(补充图1)。之间的差异Aβ沉积和microgliosis老鼠测试可能是基因促进Aβ沉积或减少缓慢Aβ沉积的能力。这里我们提供证据表明病理的差异是由于减少了应用程序的能力^{+ / +}老鼠减缓Aβ沉积;可能由于朊病毒——比如Aβ的性质和小胶质细胞在扮演的角色Aβ斑块的发展和增长。

在测试使用的空间学习和记忆中,这两个应用程序^−−/和应用程序^{+ / +}老鼠学习隐藏目标的位置的证据。由于只使用30年代试验,学习曲线并不像那些见过使用60年代试验,但老鼠的性能的第六天训练是类似于使用更长的试验任务;然而,天的培训做导致更好的增加探头检测性能(Mehla et al ., 2019),这表明学习的任务参数导致类似的模式相比,年龄匹配,non-seeded控制,但是,由于减少了训练卷在测试之前,no-platform探测试验将变得更加困难。然而,没有发现显著差异在不同群体之间在目标象限的时间在我们的研究中,尽管应用程序^{+ /−}C老鼠,没有偏爱目标象限;这可能是由于小样本大小,但游路径表明这些老鼠没有学习任务。中的障碍应用程序^{+ /−}C老鼠是一个效果,必须进一步调查以及深入的描述应用程序^{+ /−}老鼠。

的应用程序敲入小鼠有人性化Aβ,但如果一个等位基因产生鼠Aβ,中断的处理和功能Aβ在开发过程中可能发生,特别是影响脑血管系统(卢娜et al ., 2013)。这可能不是只小鼠Aβ存在时发生(应用程序^−−/只有人类存在Aβ(时)或应用程序^{+ / +})。不幸的是,我们没有评估脑血管健康这些老鼠,但其它的研究表明,脑血管功能障碍是广告的一个因素(Esiri et al ., 1999;翟et al ., 2016)。但了解脑血管系统广告期间大脑的变化发展是很重要的对于理解广告病理学。

广告,还不容易理解的一个方面是致病的机制导致发展的差异和表型的表达广告(Schellenberg Montine, 2012;科恩et al ., 2015)。我们的结果和别人的表明,两个一般因素影响表型表达的差异:Aβ和底层遗传学的类型。底层机制导致这些表型差异可能是大脑中的小胶质细胞的激活模式。

在这里,我们表明,小胶质细胞的关系Aβ斑块病理是影响种子的类型和描述的三个基因敲入的存在。例如,在应用程序^{+ / +}C老鼠,没有发现显著相关性血小板计数和活化的小胶质细胞之间,但是,随着小神经胶质细胞的数量增加,相应减少斑块的平均大小。在应用程序^{+ / +}-rpAD老鼠,随着斑块数量的增加也小胶质细胞;然而,斑块大小没有与活化的小胶质细胞的数量。尽管差异之间的相关性大小的斑块和小神经胶质细胞的数量,小胶质细胞的总数没有发现控制和rpAD-seeded之间明显不同应用程序^{+ / +}老鼠。

的应用程序^−−/老鼠没有出现斑块或microgliosis seeding-or后7个月9个月大的时候(没有显示)。的应用程序^{+ /−}老鼠做开发斑块后4个月播种,但明显较小程度上比应用程序^{+ / +}老鼠在同一年龄(补充图1)。

尽管发现小胶质细胞和斑块的大小和计数显著相关,我们不能直接分辨这种关系的方向。但是,从别人的工作,消除小胶质细胞导致减少Aβ斑块生产在疾病的早期,但不是在以后的部分疾病(Spangenberg et al ., 2019;Saucken et al ., 2020)。小胶质细胞被认为内化神经元派生Aβ并开始的初始聚合阶段Aβ之前存入细胞外空间(Spangenberg et al ., 2019),这表明小胶质细胞的激活最初可能导致斑块沉积保护大脑免受体内引入了代理,如细菌,病毒,目前有关SARS-COV2病毒等外源Aβ(eim et al ., 2018;Dominy et al ., 2019;Montalvan et al ., 2020;吴et al ., 2020);然而,Aβ沉积也可能出现由于自身免疫反应(Meier-Stephenson et al ., 2022)。我们表明,该斑块/小胶质细胞反应是特别依赖大脑环境和这个表型遗传学基础,因为我们没有发现小胶质细胞激活的控制或rpAD-seeded应用程序^−−/老鼠。

小胶质细胞被认为是中枢神经系统的居民免疫细胞和已知与斑块创建一个障碍。这些先天免疫细胞(韦伯夫妇et al ., 2020)与菌斑控制增长,开发和斑块形态(Bolmont et al ., 2008;Baik et al ., 2016;Casali et al ., 2020),以防止Aβ的毒性作用₄₂(Condello et al ., 2015)。然而,过度摄入Aβ会导致小胶质死亡,导致累积Aβ释放到细胞外空间和导致斑块增长(Baik et al ., 2016)。小神经胶质细胞的活化与Aβ斑块病理可能解释为什么应用程序^{+ / +}老鼠没有障碍。

它并不少见周围炎症反应对中枢神经系统功能的影响(2019块,)。一个贫穷的微生物,这是与炎症有关,与认知得分越低(Frohlich et al ., 2016;Gareau 2016;Komanduri et al ., 2021),也会导致广告(泰国人et al ., 2016;施et al ., 2017;林et al ., 2018)。一个潜在的机制可以解释为什么一个贫穷的微生物相关认知较低可能是由于中断色氨酸代谢。色氨酸代谢是一个大脑先天免疫的关键调节器(Meier-Stephenson et al ., 2022)和一个贫穷的微生物群会导致色氨酸代谢受损和5 -羟色胺信号(詹金斯et al ., 2016;Dinan克莱恩,2017)。

进一步证明,病因可能是免疫反应来自粪便微生物群移植实验。6个月大的微生物群应用程序^问−G−F老鼠当移植到野生型控制导致疾病表型;这种效应也性和特定基因型(茶室et al ., 2022)。APP / PS1小鼠移植健康粪便微生物群被发现广告缓解症状,如减少Aβ生产和增加短链脂肪酸丁酸盐(太阳et al ., 2019)。岁的微生物群移植时发现加速年龄和驱动在年轻小鼠病理表型(帕克et al ., 2022)。

小胶质细胞的脂质代谢出现中央小胶质细胞的功能(穿et al ., 2021),这表明这些过程中断可能损害小神经胶质细胞功能,因此,他们的影响力在斑块形态和先天免疫系统。如上所述,微生物群影响免疫系统,这似乎是通过成熟,功能和脂质代谢的小胶质细胞在中枢神经系统(Erny et al ., 2015)。因此,肠道微生物组的损伤可能是一个中心点,广告开始。它的中断会导致增加了炎症,扰乱了小胶质细胞功能和成熟,,可能,小胶质细胞的代谢过程,如相关的流程管理Aβ斑块生长和毒性(Bolmont et al ., 2008;Condello et al ., 2015;Baik et al ., 2016)。

尽管小胶质细胞的描述作用在AD的病因,Aβ寡聚物的作用不容忽视。众所周知,Aβ寡聚物代替原纤维和斑块是最致病性Aβ物种(阿西娅,2020)。然而,毒性Aβ寡聚物似乎是依赖于时间,空间,淀粉样原纤维的结构关系和致密核心斑块(刘et al ., 2015)。刘et al。(2015)描述两类Aβ寡聚物:1型和2型。比1型2型,而更丰富,似乎仅限于附近的斑块和不损害认知水平相关的广告。1型低聚物,然而,与淀粉样原纤维,可能无关,因此,更有可能在大脑神经功能障碍。认为,由于控制2型低聚物Aβ斑块,2型低聚物呈现功能无害的。因此,由于颅内播种Aβ加快成核和Aβ沉积在大脑中,很大一部分的Aβ寡聚物在大脑中可能是斑块隔离,减少这些寡聚物的毒性作用,保护大脑的认知功能。然而小胶质细胞可能起作用包含2型Aβ寡聚物在斑块内部,和晚些时候直到疾病进展的2型Aβ寡聚物泄漏,并开始破坏神经元在大脑(刘et al ., 2015)。不幸的是,我们没有测量的水平这两种Aβ寡聚物,因此,不能确定播种改变这些寡聚物的空间或时间特性。然而,我们确实提供了进一步的证据表明,Aβ单体中发现可以启动Aβ聚合使用的种子应用程序^问−G−F老鼠。

我们承认这项研究的局限性。首先,我们只关注空间导航学习和记忆。仅在测试空间导航,我们无法做出结论的影响播种,或基因型在不同认知域。然而,参与者最初是用来测试的功能HPC在内存中,和广告最早的障碍之一是发现在HPC的记忆里。在未来的研究中,额外的行为测试应包括或一本小说回家cage-based评估的啮齿动物的行为(辛格et al ., 2019;孔特雷拉斯et al ., 2022)可以提供洞察表型表达的小鼠基因型和播种,在时间中没有传统的啮齿动物行为测试。此外,我们没有测量可溶性Aβ,相反,关注Aβ斑块负荷在整个大脑和特点以及这是如何与小胶质细胞有关。因此,我们不能做出任何结论播种可溶性Aβ带来了怎样的影响。最后,控制组织没有rpAD Aβ,Aβ从HPC组织收集可以诱导催化的反应,这就可以解释缺乏差异Aβ病理学播种后1个月。

鉴于最近的失败Aβ-targeted疗法治疗广告(哈·2021),很明显,AD的病因并不理解。免疫系统的作用在病因的广告已经获得利益(Jevtic et al ., 2017)。最近的假说提出了描述,初始Aβ斑块沉积,最终导致广告出现来保护大脑免受感染(Kumar et al ., 2016;eim et al ., 2018;Moir et al ., 2018)。虽然仍投机,我们的结果与别人的,表明潜在的遗传因素导致广告可能是先天免疫反应密切相关,具体地说,小胶质细胞的作用。这可能的免疫反应是由遗传和表观遗传易感性Aβ的发展₄₂和Aβ的比率₄₂和Aβ₄₀而且Aβ出现在大脑的类型,无论是内源性(科恩et al ., 2015,2016年)或体内。众所周知,遗传和环境因素影响AD的病因(麦当劳et al ., 2010),但是,具体地说,涉及免疫系统的因素可能是一个新颖的方法来治疗广告和与年龄相关的认知下降。未来的研究应该关注小胶质细胞的新陈代谢在健康和疾病,这是由微生物和免疫系统的影响。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。

道德声明

综述了动物研究和莱斯布里奇大学动物伦理委员会的批准。

作者的贡献

RS,毫米,JS、DW和SL:概念化。RS、SL和DW:方法。SL:软件,验证,正式的分析、调查、数据管理、原创作品准备,草案和可视化。RS,毫米,DW, JS:资源。SL, RS,毫米,DW: writing-review和编辑和资金收购。RS和MM:监督。SL和RS:项目管理。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

资金

这项研究是由一个CIHR授予RS (452424)。

确认

我们要感谢t .齐藤,t . c . Saido脑科学研究所提供的原件应用程序^问−G−F老鼠用于建立一个殖民地在我们机构,j .回历2月和d Westaway提供Aβ匀浆,b·麦卡利斯特的统计和数据分析援助,加拿大行为神经科学中心动物保健人员,d .邵和b Mirza大官实验的帮助,诉Lapointe免疫组织化学援助,智商测试Whishaw与行为分析j . Faraji寻求帮助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/frdem.2022.941879/full补充材料

引用

艾伦脑科学研究所。(2016)。注射部位和立体定位坐标为顺行projectome (brain-wide)。技术白皮书。网上:https://help.brain-map.org/download/attachments/2818171/InjectionSites_and_StereotaxicCoordinates.pdf

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