量化方法跟踪的催产素水平矩阵使用质/女士的食物
迪·库马尔
拉米兹Azad m . r .3,
Dasharath Oulkar
公元前通力
s . c . Sonkar- 1印度食品安全和标准管理局(FSSAI),新德里,印度
- 2国家卫生和家庭福利部(NIHFW),新德里,印度
- 3食品安全解决方案中心,NFL加济阿巴德,加济阿巴德,印度
- 4多学科研究中心(系统),Maulana Azad医学院和相关医院,新德里,印度
- 5生物化学系,Maulana Azad医学院和相关医院,新德里,印度
- 6新德里公共卫生学院(DSPH)研究所的隆起(埃克斯波特学院),德里大学德里,印度
背景:催产素是目前用于提高农产品除了使用在挤奶的牛主要农产品的污染与催产素和牛奶。监测准确催产素污染的食品有时需要保持质量标准。在这项研究中常用的催产素化验被食品基质干扰。有必要开发一个精确的和确认催产素在食品污染物监测方法。
摘要目的:试图开发一个精确的化验方法,催产素从牛奶和农业生产。
方法:酸化甲醇是用于催产素的提取目标食品/矩阵(农产品和牛奶)。质/女士是用于检测和量化。在色谱分离、催产素浓度进行优化使用选择性反应监测(SRM)加热电喷雾电离(HESI)积极的极性。用反相色谱分离进行了C18列与梯度洗脱流速0.4毫升/分钟。酸化甲醇是用于催产素在食品矩阵所有目标的提取。性能的方法验证了按照桑特2021指南。在方法验证,该方法应用在真正的食物样本分析评估/没有催产素。
结果:提供的校准曲线线性度好(R2与残差不到15% = 0.999)。所有目标的基体效应< 20%观察矩阵。平均回收率在70% -115%,RSD < 11%在四个不同的水平在牛奶和0.01毫克/公斤水果和蔬菜。优化方法应用于50个随机样本的牛奶、蔬菜和水果,从市场的目的建立质量控制方法。根据结果,我们观察了催产素的信号随机抽样因此,这种方法显示的实际适用性催产素的检测牛奶,水果,和蔬菜。
结论:提取催产素使用酸化甲醇紧随其后化验使用质/女士是一个简单的、敏感、准确、重现性好,几乎和适当的方法来检测和量化的催产素从牛奶,水果,和蔬菜。
1介绍
催产素是一种含有9个氨基酸和哺乳动物的神经肽扮演重要的角色在不同的生化功能,如出生、哺乳期、家教、社会认可,和关系键[(王et al ., 2019))((卡特et al ., 2007))((Uvnas-Moberg 1998))((Bakermans-Kranenburg Jzendoorn货车,2013))((罗斯和年轻,2009)]。因此就必须监控催产素浓度在食品样本。出生后叶催产素是一种激素显示子宫收缩剂和galactogenic活动自然发生在动物身上。催产素,当注入植物部分,如阀杆,它的功能作为生长促进剂。它刺激细胞分裂素等植物激素,总是导致细胞分裂导致过剩的生产力的水果和蔬菜(Chandravathi et al ., 2016)。催产素是非常便宜和容易获得在印度市场,据报道,农民使用催产素增加蔬菜的非凡增长像南瓜,西瓜,黄瓜茄子,葫芦,在更短的时间内满足其市场需求增加和生产获得一个更好的价值(普拉卡什et al ., 2009;王妃et al ., 2013)。催产素是利用奶农为提高牛奶产量。然而,催产素是危险和不安全的一个人当它进入食物链(Parra et al ., 2005)。目前,不同的技术如高性能薄层色谱分离法,酶联免疫吸附试验(ELISA),放射免疫检定法(RIA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱(质/ MS)已被用于催产素在不同的生物样品的分析(Szeto et al ., 2011;Zhang et al ., 2011;Mishra et al ., 2013;王妃et al ., 2013;罗宾逊et al ., 2014)。然而,传统HPLC-UV也有可怜的灵敏度和分辨率没有质谱(王et al ., 2019)。由于其他肽干扰,假阳性信号被观察到在ELISA和RIA技术(非特异性)。这就是所谓的基体效应,由于存在食品如水果、蔬菜、牛奶不同的矩阵,有可能干扰分析方法。然而,质/女士有许多优点的选择性,灵敏度,所需的最佳分辨率准确识别和构象的催产素定量紧随其后。
已经有一些研究文章发表在催产素使用质/ MS分析,但这些报道样品制备方法有不同的特定重要条件即提取其次是提取的蒸发、蛋白质沉淀其次是SPE清理、和/或提取其次是固相micro-extraction (SPME) (Zhang et al ., 2011;Mishra et al ., 2013;Brandtzaeg et al ., 2016;王et al ., 2019)。另一项研究构建一个平台包含自动过滤/过滤反冲(AFFL),在线SPE,纳米质系统(本森山Kataoka, 2015)。在线管固相micro-extraction (SPME)与质两测量唾催产素(Kataoka和中山,2022年)。
目前的工作重点是催产素的检测和定量,人为地在某些食品大宗商品上涨。本研究的目的是开发和验证基于质/女士催产素在食品商品的量化分析方法。
2材料和方法
2.1试剂和材料
催产素醋酸(≥96%)购买从费舍尔科学(印度孟买)。最适条件TM质级水、乙腈、甲醇和甲酸(≥85%)采购从费舍尔科学(印度孟买)。分析天平(ACZET CY2202)和精密天平(ACZET CY205C,圣地亚哥,CA)被用于称量的样品。旋涡混合器冷冻离心机(Sorvall™ST8通风台式离心机)和可变体积微量吸液管、离心管(2 15 50毫升)采购从热科学(印度孟买)。
2.2样品制备
牛奶(牛和水牛),黄瓜,南瓜,西瓜,茄子从当地农民收集的样本。所有的蔬菜样本均质直接使用搅拌机和研磨机统一大小除了茄子。茄子是均相的水(1:1)为了更好地统一和同质材料。牛奶是动摇和混合之前正确地进行测试。测试部分(5 g±0.05)提取使用10毫升酸化甲醇(1%甲酸)、涡为2分钟,其次是离心重5000克。上层清液是用酸化水稀释(1:2,v / v)和离心机在上层的是10000克0.2µm尼龙膜滤器过滤,然后注入质/女士。
2.3液相色谱串联质谱分析
所有的样品和校准标准进行了分析使用一个击败™UHPLC二进制Flex和TSQ Quantis串联四极质谱仪(热科学™圣何塞,美国)。色谱分离进行海泼斯尔合金金C18(100×2.1毫米,1.9µm粒子大小、热科学™,圣何塞美国),和流量为0.4毫升/分钟。流动相包含(A)和(B)甲醇:水乙腈,HCOOH为0.1%。梯度是0 - 0.5分钟,10% B;0.5 - 4分钟,10% - -90% b;4 - 6分钟,90% B;6 - 6.5分钟,90% - -10% B, 6.5 -10分钟,10% B autosampler托盘被设定为20°C,列温度设定在40°C,注入体积是固定在5µl。
选择反应监测(SRM)是用于加热电喷雾电离(H-ESI)积极的极性。根据保留时间,自动最优化停留时间(130毫秒),和色谱峰宽(10)用于1 s的目标扫描周期达到大于12扫描/数据分峰。源参数包括鞘气体(50 arb)、辅助气体(10 arb),尾气(arb)以及与离子喷雾碰撞气体(2毫托)设置在正极性电压为3500 V。H-ESI是操作的辅助气体加热器温度为350°C和离子转移管温度为275°C。识别和量化进行了SRM的质子化了的前体分子离子(M + H)+,几个片段/产品离子。催产素被用于定量的srm过渡(m / z 1007.5 > 723.5)和确认(m / z 1007.5 > 990.054, 1007.5 > 706.024)。仪器控制、数据采集、处理和报告跟踪仪4.1软件(热科学、圣何塞美国)使用。
2.4方法的性能
一个实验室方法验证了增加信心,确保检测结果的有效性通过优化后协议。校准曲线的性能评估方法,灵敏度、选择性、基体效应、复苏,精度和鲁棒性的标准中定义的健康和bio-analytical方法验证指导原则的美国食品和药物管理局(作者anonymus 2021))((作者anonymus 2018)]。
2.4.1线性和定量的极限
校准曲线的绘制使用峰面积对催产素的浓度上升在溶剂1 / x权重因子的线性回归。线性被监测评估相关系数(r2)的校准曲线。性能评估方法通过确定的极限灵敏度定量(定量限)。建立定量限,目标矩阵飙升在复制的最低浓度(n= 6)。最低峰值浓度是为了满足两种转换10:1的信噪比(定量转换)和可接受的复苏(70% - -120%),RSD < 20%。
2.4.2基体效应
基体效应的评估是基于信号抑制或增强。这是由催产素的比较面积提取矩阵与溶剂(Kittlaus et al ., 2011)和六个复制。
2.4.3复苏和精度
复苏和精度都估计在三个不同的层次即。定量限(低),中间,和更高的飙升牛奶矩阵。这是扩展到其他水果和蔬菜在0.01毫克/公斤飙升(默认最大残留限度)。复苏估计基于测量浓度的目标矩阵相比飙升的催产素。精度评估通过测量% RSD为复制/恢复浓度的结果。
2.5应用程序样本的方法
方法的效率是评价通过测量催产素浓度出现在市场从当地收集的样本。所有收集到的样本存储在4°8°C到分析,总之,如上所述的标准操作程序(SOP)。
2.6吞吐量和成本变化
催产素分析的其他方法从文献收集。催产素分析估计的成本从试剂的成本。
3标准操作程序和结果
3.1样品制备
催产素是一种极性分析物,由氨基酸。所以,提取从目标矩阵进行使用酸化甲醇、二氯甲烷、乙腈。二氯甲烷、乙腈萃取进行部分提取催产素在贫穷的萃取效率和结果。为了避免液-液分区,酸化甲醇提取是首选,没有单独的水和甲醇。甲醇和水的混合物产生一个放热反应,有助于获得t更好的提取效率和恢复。此外,粗提取液用水稀释,0.22µm尼龙膜过滤器,过滤和注射5µl质/女士。这种稀释方法最小化矩阵集中注射质/女士,清洁提取了ESI源清洁频率,增加系统的吞吐量。蛋白质沉淀和分散固相萃取的步骤(DSPE)被淘汰在样品制备和一个简单的稀释方法是首选,减少了样品制备的成本和总体方法吞吐量提高了50%比早些时候报道方法(Zhang et al ., 2011;Mishra et al ., 2013;Brandtzaeg et al ., 2016;王et al ., 2019)。
3.2液相色谱串联质谱分析
UHPLC-MS / MS条件和样品制备协议是批判性的改进实现优化和更好的性能。选择反应监测(SRM)参数优化注射5μl /分钟1μg /毫升溶液的催产素在0.1% (v/v甲酸(FA)水乙腈(1)为50%。通过这种方法,可以实现最好的父母和稳定信号以及碎片离子。最后,最好的过渡。,1007.5 > 723.07 (Quantitative), 1007.5 > 723.07 (Confirmatory), and 1007.5 > 723.07 (Confirmatory) were selected in this experiment in agreement with earlier studies (Zhang et al ., 2011;本森山Kataoka, 2015;Brandtzaeg et al ., 2016;Lopez-Arjona et al ., 2021)。
激烈的电喷雾电离(HESI)即源参数。,ion spray voltage, sheath gas, auxiliary gas, sweep gas, ion transfer tube temperature, and auxiliary gas heater temperature were optimized based on the composition and flow rate of the mobile phase which offered the best signal. A representation of oxytocin in a neat solution has shown the two transitions signal at the same retention (3.11 min) with a sufficient signal to noise ratio (78:1) at 0.5 ng/ml (图1)。
图1。代表提取离子色谱对催产素在0.5 ng / mL的解决方案。
色谱条件进行了优化使用0.1%甲酸作为流动相的流动相添加剂有助于提供最好的信号正极性的催产素。通常情况下,缓慢的梯度程序优先实现更好的记忆力好的峰的形状。在这种情况下,催产素等压干扰观测信号是蒙面的牛奶和很难识别和确认所示的信号在3.31分钟图2一个。因此,梯度程序修改了少量修改,包括10%乙腈在初始阶段逐渐增加到90%在4分钟提供更好的分离催产素信号和等压的干扰矩阵(图2 b)。等压干扰峰的催产素与高强度观察牛奶比其他目标矩阵。代表提取离子色谱的牛奶矩阵所示图2。这些优化的梯度色谱条件提供了一个一致的催产素和更好的响应比早些时候报道短方法(Zhang et al ., 2011;Mishra et al ., 2013;本森山Kataoka, 2015)。
图2。一个优化色谱条件,准确的识别、确认和定量的催产素在布法罗牛奶。催产素信号在3.31分钟掩饰了一般矩阵的干扰峰梯度(一)(3.11分钟),催产素信号分离等压干扰(B)和放大信号的催产素在3.11分钟(C)。
3.3方法的性能
3.3.1选择性和特异性
方法选择了通过优化梯度色谱法使优秀的催产素和潜在的等压干扰矩阵组件之间的分离。这有助于在一个精确的识别和确认的催产素与参考标准协议。这是进一步证实了飙升的催产素在所有下级目标矩阵(0.01毫克/公斤)其次是有效的选择性和特异性识别和定量显示了较好的方法。没有延滞或记忆效应观察在催产素方法验证以及实际样品分析。
3.3.2线性
校准曲线的绘制与区域针对不同浓度水平证明它们之间的关系。校准曲线绘制于-100年0.5 ng / ml的溶剂以及矩阵。提供的校准曲线线性度好(r2=≥0.999)和< 15%后残差的线性方程1 / x权重因子。复苏和精密研究校正曲线绘制在0.5 -50 ng / ml的复苏和精密的研究在所有目标矩阵。
3.3.3量化的限制
量化的极限(定量限)是建立在0.01毫克/公斤飙升提供最佳性能的识别、确认后,保留时间(±0.1 min),和离子比率(±30%)标准((Kataoka和中山,2022年))((作者anonymus 2021)]。基于信号噪声(> 10:1),观察复苏和精度在可接受标准。因此,即较低的峰值水平。,0.01 mg/kg (effective concentration is 0.0011 mg/kg) level is considered as LOQ for all target matrices which meets the European Union default MRL (补充图S1)。样品被稀释9倍的基体效应也最小化(< 20%)。因此,定量是由溶剂使用外部标准。
3.3.4基体效应
基体效应中起着重要的作用在食品分析中特别使用质/ MS。甲醇是用于提取哪些应该携带很多极地矩阵组件和催产素。这粗提取液直接注射可能导致离子抑制高达50%。为避免这样的事件,水性稀释方法首选通过最小化矩阵效应(< 20%),使用外部执行定量标准。
3.3.5复苏和精度
经济复苏的实验是由四个不同层面即飙升。,0.01,0.025,0.05和0.1 mg / L和野牛牛奶。意味着复苏和精度(重复性的%相对标准偏差)中观察到的范围84 - 92% <牛奶RSD为7%和74%分别与<牛奶RSD为5%,-91%。扩大范围的方法评估随机收集样本像黄瓜、西瓜、南瓜,茄子飙升至0.01毫克/公斤(n = 6)和证明补充图S1。平均%恢复和精度(重复性%相对标准偏差)的115%、9.9%;104%、11%;115%、5%;分别为115%,7%。此外,评估性能的常规检测方法注入托架标准。托架标准(0.01μg /毫升)注射后矩阵的每一个9注射(黄瓜、西瓜、南瓜、茄子)和评估区域变化%相对标准偏差。托架标准变异在4%没有应用任何内部标准校正(图3)。催产素好转稳定甲醇提取证明通过重复性报道。这些结果表明,该方法能够完成至少50多注射植物提取,没有任何问题。
图3。催产素托架标准性能在一系列的蔬菜。
3.4测量催产素在市场样本
优化和验证方法进一步申请中催产素含量的测定牛奶,和蔬菜样品(50)从市场上收集的。收集到的样本保存在控制条件(4°8°C)的分析。所有的样本处理(提取和分析)按照协议进行了优化。50个样品,没有单一样本显示任何痕迹的催产素含量。
3.5吞吐量和成本与其他方法的比较
多个分析可用于测量催产素的生物样品和方法一直在评估各种生物样本。而质/ MS方法是有效的和有能力在食品样本测量催产素污染的痕迹。但是,它不可用在许多设置由于其高成本低的资源设置的国家,它的成本是现有的近20倍化验(估计催产素污染的痕迹Tabak et al ., 2022)。
4讨论和结论
一个简单的、敏感的,具有成本效益的、准确的和健壮的催产素在食品矩阵分析方法开发和验证。酸化methanolic提取其次是质/ MS分析提供了出色的线性度(r2= 0.999)最好的定量限(0.01毫克/公斤)。意味着复苏和精密同步与可接受标准。拟议中的协议提供一个通用的方法来测量多元化商品即催产素浓度。高脂肪的牛奶和蔬菜,高含水量(南瓜、黄瓜、西瓜和茄子)。实验室化学/分析师(独自)可以处理超过50个样本8 h内有效。与之前相比即报告方法。,evaporation and reconstitution, protein precipitation, and SPE cleanup followed by special chromatographic requirements, the proposed method was able to increase the high throughput in terms of sample preparation and analysis and also by decreasing the cost of analysis by 50%. This indicates that the method developed and validated in the present study has practical significance and can be easily adapted for faster detection, quantifications and monitoring of oxytocin in Milk and vegetables in real samples.
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。
作者的贡献
DK、SJ和HO的构思和设计实验,DK,党卫军,风湿性关节炎,做,HO进行实验,DK, HO和SJ,分析了DK, SS, BK创作并完成手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
资金
本研究支持的团队FSSAI-Thermo费舍尔科学、食品安全解决方案中心,阿巴德,印度和使用设施系统的承认。
确认
我们承认t G Shrivastav教授、前元NIHFW支持和鼓励研究,也真诚地感谢首席执行官FSSAI,和导演NFL,加济阿巴德,和多学科研究单位,Maulana Azad医学院和相关医院,新德里印度允许我们使用设施成功完成了这项研究。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/frans.2022.1039606/full补充材料
补充图1|代表提取离子色谱(共同)连同确认转换功能使用户在相同保留时间的催产素上升0.01毫克/公斤的西瓜(一)、黄瓜(B),牛奶(C)、茄子(D)、南瓜(E)和牛奶(F)。
引用
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关键词:牛奶、水果和蔬菜,质谱,催产素,验证、质/女士
引用:Kumar D, Azad RMR, Oulkar D, Oberoi HS,雅各年代,公元前通力和Sonkar SC(2022)的催产素水平的量化方法跟踪矩阵使用质/女士的食物。前面。肛交。科学。2:1039606。doi: 10.3389 / frans.2022.1039606
收到:08年9月2022;接受:2022年11月18日;
发表:2022年12月08年。
编辑:
梁巧、复旦大学、中国版权©2022 Kumar Azad、Oulkar Oberoi,雅各,今敏和Sonkar。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:s . c . Sonkardrscsonkar@gmail.com;Dinesh Kumardrdinesh.fssai@gmail.com