基于固定化酶活力测定激肽释放酶和质谱分析
丹妮娜·罗马诺·德·卡瓦略1
米菲巴博萨Laurentino
1
卡米拉Loreta罗查
1
珀斯库尔
2
Govert Somsen2
Erika Amstalden范霍夫2
__
卡门·卢西亚卡多佐
1*- 1Departamento de Quimica Grupo de Cromatografia de Bioafinidade e Produtos Naturais, Faculdade德所说,Ciencias e Letras de小溪Preto,圣保罗,小溪Preto,巴西
- 2分析化学,化学和制药科学系的,阿姆斯特丹分子研究所、医学、和系统,sccp阿姆斯特丹,荷兰阿姆斯特丹
管制活动和表达人类激肽释放酶(KLKs)可能参与各种病态,这些酶是一个有吸引力的生物识别分子的目标,可以调节KLK活动。这个识别包括应用快速、有效的筛选方法。这个作品描述了一个离线分析与质谱(MS)检测,使用KLK固定化Sepharose-NHS作为micro-column配置(IMER-KLK-Sepharose-NHS)。有一个使用的质谱离子阱分析仪和电喷雾电离(EIS)。HPLC-MS方法量化KLK活动了。酶反应条件进行了优化,IMER-KLK-Sepharose-NHS动力学参数(K宾州= 15.48±3μmol L−1)评估。最后,该方法验证通过使用亮抑酶肽抑制剂(IC作为参考50= 0.85±0.10μmol L−1)。发达的方法能够识别的参考抑制剂,可以替代筛查KLK抑制剂。
介绍
激肽释放酶(KLKs)是一群丝氨酸蛋白酶酶生物体液和组织中扮演重要角色。KLKs可分为两组:血浆激肽释放酶(KLK 1 b)和组织KLKs (KLK1-15) (Prassas et al ., 2015)。KLK 1 b是由肝细胞只表达了等离子kallikrein-kinin系统的一部分,而除此之外,参与纤维蛋白溶解的过程,凝血、炎症、癌症和疾病相关的心血管系统(Schmaier Mccrae, 2007;Costa-Neto et al ., 2008)。在生理条件下,等离子体激肽释放酶作为心血管酶。然而,其血浆浓度增加或多动症会使心血管疾病(CVD) (Kolte Shariat-Madar, 2016)。组织KLKs组成人体组织激肽释放酶(KLK1)和14 kallikrein-related肽酶(KLK2-15) (Prassas et al ., 2015基因和蛋白质结构相似的)。氨基酸的身份在人体组织KLKs范围从40到80% (尤瑟夫和比赛,2001年)。
组织KLKs出现在人类有机体的几个组织,和他们不受监管的表达可能与多种疾病相关(Costa-Neto et al ., 2008)。例如,在阿尔茨海默氏症和帕金森氏症,患者KLK6减少脑组织的表达(比赛et al ., 2000;Bayani和比赛,2012年)。人类kallikrein-related肽酶5 (hKLK5), 6 (hKLK), 7 (hKLK7) 8 (hKLK8), 14 (hKLK14)也参与炎症性皮肤疾病(迪保罗比赛和Prassas, 2020)与脱屑异常和炎症,如特应性皮炎(AD),牛皮癣,罕见疾病Netherton综合症(NS) (Zani et al ., 2022)。此外,KLKs特异表达在大多数实体肿瘤,特别是激素依赖性肿瘤(Kryza et al ., 2016)。KLK3也称为前列腺特异抗原(PSA)作为生物标志物用于前列腺癌,因为这种酶过表达在这些类型的癌症和KLK3礼物表达特异表达在乳腺癌肿瘤(Yu et al ., 1995)。KLK2过表达在前列腺肿瘤(Darson et al ., 1997)。KLK7超表达在结肠癌组织中参与癌症细胞增殖(沃克et al ., 2014)。
考虑到某些酶影响人类的病理基础,寻找分子可以抑制是一个相关的话题当寻找治疗或治愈这些疾病(科普兰,2013)。在这个场景中,KLKs是重要目标时开发的药物可以抑制他们的活动或恢复他们的表达式(Kolte Shariat-Madar, 2016;谢et al ., 2020)。尤其相关的上下文中的抗癌研究因为KLKs显示调节癌症细胞增殖(商et al ., 2014;沃克et al ., 2014)。PROSTVAC疫苗,为前列腺癌治疗,是治疗的一个例子资源目标KLK3和多个T细胞co-stimulatory分子(TRICOM) (马丹et al ., 2009)。
开发工具允许酶抑制剂被发现和发展是至关重要的。从这个意义上讲,固定化酶筛选配体的一个重要工具,可以抑制酶。化验与固定化酶提供优势的使用酶解决方案允许更好的处理和再利用,酶,增加酶的稳定性在不同条件下(Brena Gonzalez-Pombo Batista-Viera, 2013)。另外,固定化酶酶活性调制可以被监控在图书馆面前的分子(合成或自然)和复杂的矩阵,如原油提取(辛格et al ., 2014)。此外,固定化酶使大规模筛选的配体(高温超导)这样的矩阵(德西蒙et al ., 2019)。事实上,不同的酶固定协议(罗德里格斯et al ., 2021)和配体筛选分析,从在线(流)离线化验,开发(Wubshet et al ., 2019;Cieśla Moaddel, 2016;卓et al ., 2016;程和陈,2018;德·莫拉埃斯,卡多佐和卡斯,2019;Q。陈et al ., 2021;Trindade西曼乃斯et al ., 2021;de Oliveira et al ., 2022)。
同时在线检测,分析了配体和筛选(卓et al ., 2016)。这些化验基本上由一个固定化酶反应器(im)耦合到一个自动化系统,如高性能液体bib_Chen_et_al_2021buid色谱和毛细管电泳(程和陈,2018;g . Y。陈et al ., 2021),可以加上不同的检测技术,包括紫外线(UV) (da Silva et al ., 2013)、荧光(海et al ., 2011),电化学检测(太阳、高和金,2006年)和质谱(MS) (Vilela卡多佐,2017)。
HPLC-MS被认为是最强大的分析工具分析极性化合物,包括肽、酚类化合物、聚合物和生物分子(厕所,范Schepdael Cabooter, 2016)。HPLC-MS结合分离通过高效液相色谱法的广泛分析能力的优势女士HPLC-MS包括需要少量样品,高分辨率,高分子特异性和高检测灵敏度(Beccaria Cabooter, 2020)。电离模式来说是至关重要的性能HPLC-MS方法根据分析物目标,其他人之间的电喷雾电离源(ESI)是主要的电离模式分析对热不稳定,非易失性和极性化合物。(Beccaria Cabooter, 2020)。具体来说,ESI电离源和离子阱质量分析仪(IT)已经成功地用于im加上HPLC-MS。例如,βsecretase1和乙酰胆碱酯酶(疼痛)co-immobilized和用于dual-ligand筛查(纳西索dos Reis Vilela,卡多佐2021)AChE-IMER (Vanzolini et al ., 2013)用于筛查香豆素衍生物和butyrylcholinesterase BChE -IMER和AChE-IMER用于流动质谱双酶测定(Seidl et al ., 2019)。
另一方面,离线化验需要独立的筛选和分析步骤。然而,上述检测技术可用于离线化验,(卓et al ., 2016;Zhang et al ., 2018)。
许多支持,如磁性粒子(王et al ., 2018;Q。陈et al ., 2021),硅胶微球(施et al ., 2015)和琼脂糖(Zofair et al ., 2020),可用于构建生物反应器,可以应用于离线化验。以前,我们在KLK酶固定化Sepharose-NHS坚实的支持和使用它在配体筛选化验,我们用96孔的平底微型板块测量荧光(卡瓦略et al ., 2021)。固定化KLK显示优秀的操作和储存稳定性和被证明是一个有效的工具识别KLK抑制剂(卡瓦略et al ., 2021)。
固定化酶的优点和日益增长的搜索KLK抑制剂,我们提出一个离线分析基于KLK固定化Sepharose-NHS女士作为micro-column配置和检测。我们将表明,该生物反应器、IMER-KLK-Sepharose-NHS展品良好的稳定性、可重用,离线配体筛选是一个有用的工具,可以加上一个HPLC-MS方法。
材料和方法
化学试剂
猪胰激肽释放酶(KLK 250单位),N-hydroxysuccinimidyl-Sepharose®4快速流动,CBZ-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin盐酸盐(Z-Phe-Arg-AMC),亮抑酶肽hemisulfate盐(Acetyl-Leu-Leu-Arg-al)和7-amino-4-methylcoumarin (AMC)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。缓冲组件和其他化学物质从Sigma-Aldrich获得,默克公司(达姆施塔特,德国),Synth(巴西圣保罗),或在穿越(Geel、比利时)。水被用在所有的准备工作从MILLI-Q获得®系统(微孔®巴西圣保罗)。这里使用的化学品和溶剂都是分析或高效液相色谱级和就业没有任何进一步净化。
为分析仪器和系统配置
HPLC-MS分析NexeraXR高性能液相色谱系统上进行(日本岛津公司,日本京都)配备三个LC 20 adxr泵,一个SIL-20A自动注射器,一个DGU-20A脱气器,一个10-port两位高压开关阀(Valco仪器有限公司、休斯顿、美国),和一个CBM-20A系统控制器。高效液相色谱系统耦合离子阱质谱仪,亚马逊模型速度双离子漏斗,QIT技术(IT-MS)(力量Daltonics,不来梅,德国)配备一个电喷雾源(ESI)。系统控制的力量罗盘Hystar软件(版本4.5,力量Daltonics Inc . Billerica,美国)。数据获取和分析利用指南针DataAnalysis软件(版本4.3,力量Daltonics Inc . Billerica,美国)。
制备IMER-KLK-sepharose-NHS micro-column
从猪胰脏KLK(100μg毫升−1)共价固定化N-hydroxysuccinimidyl-Sepharose®4快流(Sepharose-NHS,坚实的支持)如前所述(卡瓦略et al ., 2021)。固定化酶的固定化后,80毫克放在micro-column设备(Mobitec、哥廷根、德国),给IMER-KLK-Sepharose-NHS。micro-column洗了50更易与L−1Tris-HCl缓冲区(pH值8.0),并存储在相同的缓冲溶液4 c控制列含有80毫克的Sepharose-NHS(没有酶)是如上所述。
IMER-KLK-sepharose-NHS micro-column离线分析
10 120整除µl更易与L−1醋酸铵溶液pH值(8.0),200年和50µlμmol L−1Z-Phe-Arg-AMC衬底被添加到micro-column和孵化温柔在室温下搅拌5分钟。孵化后,反应介质过滤和收集。然后,20-µL整除的反应混合物(过滤)转移到瓶,稀释80µl 10更易与L−1醋酸铵溶液pH值(8.0),由HPLC-MS和分析。在每个反应,IMER-KLK-Sepharose-NHS micro-column Milli-Q用5毫升水(三次),其次是5毫升的5更易与L−1醋酸铵溶液(pH值8.0)三次。在每个反应,固定化KLK micro-column Milli-Q用5毫升水(三次),其次是5毫升的5更易与L−1醋酸铵溶液pH值8.0(3次)。空白样品准备在相同的反应条件下通过控制micro-columns(没有酶)。所有的实验进行了一式三份。
IMER-KLK-Sepharose-NHS离线测定条件的优化包括反应时间的影响和醋酸铵溶液浓度的酶活性。醋酸铵溶液浓度的影响评估在浓度范围从2到15更易与L−1(pH值8.0)。为此,固定化KLK micro-column以前用5毫升的浓度的醋酸铵pH值8.0(三次),在每个浓度条件下10分钟。反应时间是评估孵化时间从5到40分钟。同等条件下的酶促反应进行了上面所描述的那样,和Z-Phe-Arg-AMC受雇为基质。IMER-KLK-Sepharose-NHS活动的再现性试验验证了实施连续5反应周期。
分析由HPLC-MS IMER-KLK-sepharose-NHS活动
通过使用一个Ascentis高效液相色谱进行分析®表达C18微米保护盒(5毫米×2.1毫米x 2.7µm Supelco, Bellefonte, PA,美国)连接到一个10-port /双位阀HPLC-MS系统(图1);流动相是由水(溶剂)和乙腈(溶剂B)。最初,阀门在位置1,酶反应产物从列筛选了初始流动相组成的30%溶剂B 0.2毫升的流量最小−1质谱仪进行分析。2.0分钟后,阀门切换到位置2;溶剂B增加到90%的流量0.5毫升分钟−1保持到5分钟,洗柱和去除多余的衬底。5.1分钟,阀门又转向位置1,流动相是返回到初始条件。总运行时间为6分钟。C(溶剂水)泵的流量0.2毫升分钟−1女士被用来提供的流动相在柱清洗步骤。所有的分析21 C(控制室温),和注射量是5µl。ESI电离参数如下:积极电离模式中,毛细管电压= 4500 V,终板电压= 550 V,干燥气流L = 7分钟−1,干燥温度= 270 C,喷雾器压力= 27 psi。酶促反应的产物,AMC,监控m / z176年[M + H]+。
图1。的示意图表示HPLC-MS IMER-KLK-Sepharose-NHS活动监测系统。资料来源:由作者设计的。
方法资格
方法资格标准的基础上进行文学2011 (FDA)。线性方法是评估通过构造一个标准曲线;AMC在以下使用浓度:50,70,100,200,300,400,500,600,800,1000 nmol L−1。为此,从标准的10更易与L−1AMC的解决方案(在DMSO)、“预付款采购保证”解决方案在浓度从50到1000 nmol L−1准备在10更易与L−1醋酸铵溶液。分析曲线,集中的解决方案准备一式三份股票的解决方案,和5-μL整除注入HPLC-MS系统如上所述。分析曲线是由线性回归的情节色谱面积提取的离子m / z176年[M + H]+浓度的函数。方法选择性评价通过缓冲区分析在相同条件下上面所描述的那样,但是没有添加“预付款采购保证”。量化和检测极限的极限浓度从注入AMC评估解决方案的50岁,30、10、5和2.5 nmol L−1。量化的限制被定义为产生信噪比的值的最低浓度高于十倍,响应分析获得的空白(缓冲区没有AMC),同时检测极限定义为中被测物能被定量测定的最低浓度,可以与规定的检测概率和基线可以可靠地区别开来。当基于信噪比建立最低浓度的分析物可以可靠地检测到。一般来说,接受信噪比率是2:1或3:1。2011年(FDA)。内部和inter-day精密度和准确度进行评估通过分析样品在三种不同浓度水平(500,和1000 nmol L−1);每个浓度水平制备和分析一式五份。
IMER-KLK-sepharose-NHS动力学常数(K宾州)
IMER-KLK-Sepharose-NHS动力学常数(K宾州(4)是由使用不同Z-Phe-Arg-AMC浓度- 1200μmol L−1在10更易与L)−1醋酸铵溶液pH值8.0。孵化后5分钟,反应介质过滤和收集,和20-µL整除的解决方案被转移到瓶,稀释80µl 10更易与L−1醋酸铵溶液pH值(8.0),由HPLC-MS如上描述和分析。酶活性是由量化监控成立的AMC (m / z176年[M + H]+)。数据拟合采用非线性回归到Michaelis-Menten情节,和K宾州价值观得到GraphPad Prism 8.0软件。
抑制作用的研究
抑制的研究是由使用亮抑酶肽作为标准的抑制剂。以确定其最大抑制浓度(IC的一半5010),110 -µl整除更易与L−1醋酸铵溶液pH值(8.0),10µl亮抑酶肽(1 - 2500μmol L−1),50的衬底Z-Phe-Arg-AMCµl 200μmol L−1被添加到micro-column和孵化温柔在室温下搅拌5分钟。孵化后,反应介质是过滤和收集,和20-µl整除的解决方案被转移到瓶,稀释80µl 10更易与L−1醋酸铵溶液pH值(8.0),由HPLC-MS如上描述和分析。酶活性是由量化监控成立的AMC (m / z176年[M + H]+)。(活动的存在我(一)和缺失0)的抑制剂相比,抑制的百分比计算表达式:% I = 100 - ((我/一个0)×100)。抑制曲线是由策划抑制百分比与相应的亮抑酶肽浓度,以及集成电路50价值是由情节s形曲线构建由日志(亮抑酶肽)与%抑制GraphPad Prism 5.0软件。
结果与讨论
分析基于固定化酶耦合HPLC-MS系统已成为一个有前途的替代在微型板块比色检测化验。女士,我们开发了一个离线化验检测通过KLK固定化Sepharose-NHS作为micro-column配置。我们准备了一批的固定化酶的方法。共价固定化KLK到Sepharose-NHS之后,我们包装成micro-column设备,获得IMER-KLK-Sepharose-NHS。
HPLC-MS分析方法开发
我们进行了色谱分析权力平等主义的洗脱方式与流动相组成的水/乙腈;C18微米警卫筒(5毫米×2.1毫米×2.7µm)使用。消除底物过量,避免可能出现的问题引起的电离抑制和/或污染的电离源女士,我们添加了一个清理步骤,所述图1。
图2显示相对应的色谱分析IMER-KLK-Sepharose-NHS酶反应的方法。在工作条件下,我们消除了干扰造成的多余的基质,但产品AMC和Z-Phe-Arg-OH co-eluted。在这种情况下,没有必要为高分辨率的色谱分离虽然分析物co-eluted因为我们后来发现他们各自的m / z比率。因此,该方法允许我们监视KLK活动快速分析,也只持续了6分钟。在常规分析,我们评估了IMER-Sepharose-NHS酶活性通过监测离子m / z176年[M + H]+,指的是AMC产品。
图2。重叠峰的提取离子色谱图IMER-KLK-Sepharose-NHS活动记录。看到HPLC-MS条件实验部分中描述来源:由作者设计的。
方法资格
我们评估方法通过构造一个线性校准曲线的AMC产品。线性响应和曲线显示R2= 0.99 (n= 3)AMC浓度从50到1000 nmol L−1(y = 5.07×107x + 8.85×105);相对标准偏差(RSD)值低于15%为一式三份。当我们只注入缓冲在相同的试验条件下,由于AMC出现没有信号,证明方法的选择性。检测和量化的限制了AMC 5和30 nmol L−1,分别。表达的内部和inter-day精度值是相对标准偏差,范围从5到15%。方法的盘中精度从110%到85不等。inter-day精度101%至87之间。因此,发达HPLC-MS方法可以应用于监控固定化KLK活动。
IMER-KLK-sepharose-NHS离线试验条件
我们评估的反应条件IMER-KLK-Sepharose-NHS活动分析,即反应时间、醋酸铵溶液浓度、和固定化KLK micro-column清洗步骤。我们评估了IMER-KLK-Sepharose-NHS活动在不同的孵化时间(图3一)。我们得到了一个线性响应AMC形成反应时间的函数,这表明,该分析模型可以用于监控IMER-KLK-Sepharose-NHS活动。在分析条件下,孵化5分钟足以测量酶活性,所以我们选择这个时间进一步的分析。
图3。反应时间的影响(一)和醋酸铵溶液浓度(B)IMER-KLK-Sepharose-NHS活动。资料来源:由作者设计的。
图3 b显示了醋酸铵溶液浓度、pH值8.0,影响固定化KLK活动。固定化酶仍然活跃2到10更易与L−1醋酸铵。相比之下,IMER-KLK-Sepharose-NHS显示低活动高乙酸铵浓度(15更易与L−1)。
因此,优化试验条件IMER-KLK-Sepharose-NHS活动离线化验的孵化时间5分钟和10更易与L−1醋酸铵溶液(pH值8.0)。
另一个重要的参数来评估是固定化的清理一步KLK micro-column,以确保它可以重用,结果是可再生的。KLK固定化在Sepharose-NHS曾被证明有良好的可重用性与洗涤缓冲(10更易与简单的清洗步骤后L−1Tris-HCl, pH值8.0)(卡瓦略et al ., 2021)。这里,我们调整了清理步骤的条件中使用MS检测,我们取代了洗涤缓冲5更易与L−1醋酸铵(pH值8.0)0。最后清理条件Milli-Q IMER-KLK-Sepharose-NHS 5毫升的水5毫升的5更易与L紧随其后−1醋酸铵溶液(pH值8.0)。洗涤过程被证明是适合清洗固定化KLK micro-column。在常规分析中,我们三次重复这个洗涤过程。
此外,我们测试了IMER-KLK-Sepharose-NHS重复反应周期(图4),显示良好的再现性五个连续反应(简历= 4.3%,n= 5),表明该模型分析适合IMER-KLK-Sepharose-NHS活动的监控。固定化酶显示出稳定性好,依然活跃在整个试验。
图4。IMER-KLK-Sepharose-NHS可重用性。资料来源:作者阐述的。
IMER-KLK-sepharose-NHS动力学常数(K宾州)
我们确定了动力学参数K宾州IMER-KLK-Sepharose-NHS Z-Phe-Arg-AMC水解的条件下建立了酶促反应和HPLC-MS分析方法。K宾州值为15.48±3μmol L−1(图5),确凿之前获得的荧光测定的值在微型板块10.3±0.9μmol L−1(卡瓦略et al ., 2021)。因此,我们选择40μmol L−1衬底(对应于K的两倍多宾州)抑制研究。
图5。Michaelis-Menten情节的产品领域获得IMER-KLK-Sepharose-NHS利用Z-Phe-Arg-AMC作为衬底。资料来源:作者阐述的。
抑制作用的研究
作为一个概念验证,我们使用了亮抑酶肽肽作为参考抑制剂验证离线分析用人IMER-KLK-Sepharose-NHS作为筛查工具配体。确定抑制效力,我们评估了IMER-KLK-Sepharose-NHS活动亮抑酶肽浓度的上升和获得IC的存在500.85±0.10μmol L−1(图6),这是在同一个数量级微型板块中获取的值的测定和荧光检测IC500.13±0.01μmol L−1和集成电路50获得自由酶解决方案(IC50= 1.62±0.18μmol L−1(卡瓦略et al ., 2021)。的集成电路50当测试条件修改值各不相同,因此它是一个相对比较参数(Holdgate、温顺和Grimley, 2018年)。一般来说,IMER-KLK-Sepharose-NHS能够识别参考抑制剂和被证明是有效的在决定集成电路50参数。
图6。剂量反应曲线的抑制百分比的IMER-KLK-Sepharose-NHS亮抑酶肽的存在。资料来源:由作者设计的。
结论
KLK固定化Sepharose-NHS作为micro-column配置是一个有用的方法来测量KLK活动;展品满意的稳定性;允许这种酶被重用;,可以加上一个HPLC-MS方法离线。我们确定KLK活动通过量化AMC产品提出HPLC-MS方法。发达化验也能够识别已知KLK抑制剂亮抑酶肽,证明它可以用于筛选抑制剂。因此,这里的离线试验与检测报告女士代表荧光酶标检测一个不错的选择。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
作者的贡献
DC:方法,验证,正式的分析,调查,原创作品,草案提单:正式的分析、验证。克雷格:原创作品形式分析草案。EA:软件,writing-review GS: writing-review。JK: writing-review。答:概念、融资并购、项目管理、资源、可视化、监督writing-review和编辑。
资金
这项研究受到了圣保罗州基金会(FAPESP拨款必须占州政府2019/05363-0 2014/50249-8,2014/50299-5和GSK),并由国家科学和技术发展委员会(CNPq) DCR和CLR承认FAPESP奖学金必须占州政府(大数字2016/14482-5 CNPq-Grants 141748/2017-6, 303723/2018-1,和311969/2019-4)。这项研究部分由Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,巴西(披肩)、财务代码001。意见,假设和表达这种材料标准或建议的责任作者(年代),不一定反映FAPESP,必须占州政府的观点
确认
CC和直流承认圣保罗州研究基金会(FAPESP)必须占州政府2016-14482-5和CNPq (307108-2021-0;141748/2017-6)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:固定化酶、HPLC-MS离线化验,kallikerin酶,配体筛选试验
引用:卡瓦略DRD Laurentino BB,罗查CL,库尔J, Somsen G, Amstalden范霍夫E和卡多佐CL(2022)基于固定化酶活力测定激肽释放酶和质谱分析。前面。肛交。科学。2:1018115。doi: 10.3389 / frans.2022.1018115
收到:2022年8月12日;接受:2022年10月05;
发表:2022年10月19日。
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*通信:卡门·卢西亚卡多佐,cccardoso@ffclrp.usp.br
__ORCID ID:Erika Amstalden范霍夫orcid.org/0000 - 0002 - 1150 - 3805