系统的生理年龄的估计在体外与年龄有关的标记细胞培养系统的面板
克丽丝汀哈特曼
露意丝假蝇
亚历山大·哈特曼2,
Georg Fuellen
迈克尔•沃尔特
安德烈亚斯•赫尔曼- 1转化神经退化节“Albrecht-Kossel”,神经学部门,德国罗斯托克罗斯托克大学医学中心
- 2临床化学和实验室医学研究所、德国罗斯托克罗斯托克大学医学中心
- 3生物统计学与医学信息学研究所和老化研究,罗斯托克大学医学中心,德国罗斯托克
- 4神经科学中心跨学科的罗斯托克(CTNR),德国罗斯托克罗斯托克大学医学中心
- 5德国中心的皮毛神经退行性Erkrankungen罗斯托克(DZNE) /格赖夫斯瓦尔德,德国罗斯托克
老龄化是一个过程,影响几乎所有的多细胞生物,因为我们的人口老龄化日益流行的与年龄相关的疾病,是很重要的在老化研究的基本过程。许多研究已发表到目前为止使用不同的年龄,通常单标记评估生物体的生理年龄或不同的细胞培养系统。然而,可比性的研究往往是由于缺乏一个统一的面板的标记。因此,我们在这里提出一个易于使用的biomarker-based面板古典时代的标记来估计细胞培养的生物年龄标准系统,可用于细胞培养实验室。这个面板显示在各种老化条件下敏感。我们使用不同供体年龄和另外的主要人类皮肤成纤维细胞诱导复制衰老或人工老化的progerin超表达。使用这个面板中,最高的生理年龄被发现的人工老化progerin超表达。我们的数据显示,衰老变化根据细胞系和个体与个体衰老模型,甚至显示需要全面分析。
1介绍
老化,通常被描述为一个时间功能下降(Lopez-otin et al ., 2013),是一个生理过程,影响几乎所有的多细胞生物。然而,最重要的危险因素的发展与年龄有关的疾病(罗杰斯et al ., 2019)。一般来说,包括老化过程降低个体的健康和生存(Fuellen et al ., 2019)。然而,一个人的时间(年出生的数量)和生理年龄(反映实际生理健康状态)可以显著不同(她Jylhava Hagg, 2017;Kudryashova et al ., 2020)。在在体外细胞培养条件下,后者的主要有两个主要的贡献者,供体的年龄的活检以及复制衰老/衰老,各自的细胞经历了到目前为止。如果我们希望考虑生理健康状态,供体的年龄在活检应估计他或她的生理年龄。然而在实践中,这种生理年龄很少可用,它必须被捐赠者的实足年龄,我们称之为“供体年龄”。原则上,这两个主要贡献者不容易区分对他们的影响生理细胞的“健康”状态。因此,本文的目的,我们定义细胞细胞培养时(也就是说,他们的生物年龄)供者年龄+继续培养的影响表示为一个时间段的供体的年龄。这个生理年龄估计通过生物标志物(我们称之为年龄标记)和它对应于一个生理上的“健康”状态的细胞是预测未来的行为。这提供一个更精确的描述各自的细胞模型用于科学研究关于他们的生理年龄,他们用于实验之前,推荐一个更好的特性的细胞。
衰老过程研究了各种模型系统。除了各种小鼠模型,在体外细胞培养是最常用的系统。有各种各样的细胞衰老模型和所有类型的(老年性)疾病,包括简单的细胞模型与异构表达系统(海拉、HEK等等),patient-derived主要细胞(如成纤维细胞)以及诱导多功能干细胞(iPSC)模型。因为后者的发现,疾病和/或衰老的细胞模型已成为更大的利益。虽然这些技术使调查patient-derived细胞模型到目前为止没有起源(例如,神经元),这些似乎大大改变细胞生理学的方方面面包括它们的生理年龄。尤其是对衰老相关疾病的研究,因此还需要考虑这种复兴的影响,例如,iPSC生成过程,在不同时代的标记。
一个标志时代来说是一个重大的特点估计生理年龄或相关条件(阿特金森et al ., 2001)在生物系统/生物。在过去,许多建议年龄标记了生理年龄的估计及其偏离实足年龄。
有不同的老化特征,其中一些有建立标记”来形容的生理年龄。例如,Lopez-Otin衰老的9个特征描述主要在三个不同的类别(Lopez-otin et al ., 2013)。老化的主要特点(基因组不稳定性,端粒摩擦,表观遗传改变,受损proteostasis)被认为是细胞损伤的主要原因与年龄增长。这些主要特征导致对抗衰老的标志(管制营养传感、线粒体功能异常和细胞衰老),最初反应减轻损害但如果长期存在变得有害。最后,还有综合老化的标志(干细胞疲惫,改变细胞间通信),这是前两组的结果最终负责的损失函数与衰老有关。这些老化的特征可以通过各种标记和方法(调查总结补充表S1)。
许多公认的时代标志因此被描述和标记研究的时代不同的研究通常显著差异(哈特曼et al ., 2021)。出于这个原因,比较彼此之间的这些研究往往是困难的和特定的比较如不同细胞系和条件(新生细胞和老化细胞)是更加困难。因为后者也可以影响年龄标记不同,似乎有意义依赖于更广泛的光谱的标记,以更好地检查各种组件的老化过程尤其是在体外细胞培养系统。
表观基因组,尤其是DNA甲基化,因此是最经常报道奇异因子量化个体的年龄。DNA甲基化标记是所谓的“老化时钟”的基础,通常与相关的捐助组织的实足年龄是派生的。此外,有证据表明,它们可以用来估计生理年龄。2013年,Hovarth开发的第一个“老化时钟”,允许估计DNA甲基化标记的实足年龄,许多组织和细胞类型。在这项研究中,一组可用的DNA甲基化数据集被用来定义和评估一个特定的年龄预测,基于CpG岛的DNA甲基化水平与个人的实足年龄,称为DNAm年龄。预测实足年龄之间的差异和实际实足年龄被认为是生理年龄的估计。因此,DNAm年龄估计实足年龄显示精度高(阅读2013)。然而,值得注意的是,报告例外:在别人,高精度不存在一般真皮成纤维细胞和B细胞的患者患有早衰症症状。问题解决在跟踪的一项研究中,由所谓的“皮肤和血液钟”(霍et al ., 2018)。另一个甲基化时钟,预测人类的年龄使用Illumina公司英飞纳姆HumanMethylation450化验人体全血样品另外显示性和遗传变异对DNAm时代的影响,而且老龄化率是不同的在不同的组织(所有et al ., 2013)。
使用所谓的“CultureAge”得分,这是显示在体外细胞衰老与组织衰老在活的有机体内。本研究建立了一个算法使用复制的年龄小鼠胚胎成纤维细胞,随后验证它在多个小鼠组织。有趣的是,这是敏感的检测在细胞重新编程复兴,但据了解,这种进步的细胞老化不同于non-replicative衰老引起的(例如,依托泊苷治疗或γ辐照)和缺乏相关报道SA-β-Galactosidase CultureAge分数(Minteer et al ., 2022)。Kabacik和他的同事们也报告说,表观遗传aging-using皮肤和血液细胞衰老时间不同,端粒磨损和基因组不稳定,但受营养传感和线粒体活动(Kabacik et al ., 2022)。基于单个细胞甲基化数据,特拉普和他的同事建立了表观遗传时钟“scAge”使用不同的小鼠组织和细胞,能够代表实足年龄在单个细胞水平,及其算法是独立的论文认定覆盖在每一个细胞。然而,研究显示显著的细胞之间的异质性。使用这种表观遗传时钟是否适用于培养细胞,在进一步的研究需要阐明(特拉普,Kerepesi Gladyshev, 2021年)。弗莱舍等人声称能够预测生物年龄人类成纤维细胞转录组的分析。他们生成一个大数据集的全基因组RNA-seq概要的人类成纤维细胞来估计这些细胞的生理年龄。预测的年龄与先后顺序供者年龄(弗莱舍et al ., 2018)。
虽然这些“使”的方法是非常有用的在生成假说,他们缺乏信息在细胞培养中细胞的行为,因此缺乏相应的生物学意义的变化。此外,这些调查往往不一定昂贵,需要特定的设备可用。此外,这些报道很重要的衰老和衰老过程的多样性,在一定程度上缺乏相关性SA-β-galactosidase等古典时代的标记。
因此,我们的总体目标是让衰老的不同方面的比较在体外细胞培养模型与不同的捐赠者背景,不同供体年龄和加速年龄疾病,包括不同的老化模式例如,复制和人工老化。因此,我们首先做了一个广泛的文献检索识别建立标记细胞老化过程中最可能相关。我们选择常用标记从主和对抗衰老的标志是可以量化的在体外化验调查他们是否可以清楚地描绘了衰老的不同方面。随后,我们开发了一个小说biomarker-based面板组成的完善的古典时期标记,来估计不同的细胞培养的生物年龄老化系统,另外可用于标准的细胞培养实验室(图1)。我们假设这个面板的标记会更好的个人细胞系和衰老模型之间的差异和个人比单一的标记。确认后aging-relevance单身时代的标记我们选择,我们提出一个评分系统,称为AgeScore,计算个体绝对值作为生理年龄的估计不同的人类成纤维细胞。进一步验证这一提议评分系统发生在人类成纤维细胞复制衰老和人工老化progerin的过度。最后,我们测试了我们的老化板是否适用于典型的老化疾病(早衰症状Hutchinson-Gilford-Progeria综合症、计画和沃纳综合症,WS)。组成不同的结论,我们提出一个分数时代良好的标记代表衰老和衰老的后果如下:1)标记的老化的主要特点(组蛋白的化学修饰DNA损伤、端粒磨损)显示细胞损伤、细胞分裂和细胞的甲基化状态,2)标记的对抗衰老的特征(细胞衰老(细胞周期阻滞,SA-β-Gal表情,激活SASP),形态学的变化,减少核纤层蛋白B1表达)显示多少的主要伤害已经影响细胞内稳态一起显示基本AgeScore估计细胞在细胞培养系统的生理年龄。
图1。年龄的标记AgeScore求婚。这里提出面板包含以下年龄标志:主要衰老标记(DNA损伤、组蛋白修饰、端粒摩擦)和对抗衰老标记(细胞周期阻滞,senescence-associatedβGalactosidase (SA-βGAL) senescence-associated分泌表型(SASP),核纤层蛋白B1表达,形态),包括细胞衰老的典型标记(绿色栏)。
2材料和方法
2.1细胞培养
人类皮肤成纤维细胞从看似健康的年轻人,中年人和老年人以及病变(早衰症)捐赠者从柯瑞尔研究所或准备购买像之前描述的那样在我们的实验室(瑙曼et al ., 2018;朋友et al ., 2018,2021年)。Dulbecco-modified鹰的培养基培养细胞(DMEM-Glutamax ThermoFisher科学,# 10569010)补充15%胎牛血清(的边后卫优越,ThermoFisher科学、# 10270106)和青霉素和链霉素(100μg /毫升,费舍尔科学,# 15140 - 122)通风培养瓶(75厘米2费舍尔科学,# 658175)37°C和5%有限公司2。成纤维细胞后被亚文化trypsinisation (0.25% trypsine-EDTA ThermoFisher科学,# 25200 - 056)。培养基是改变每3 - 4天。
2.2人口翻番水平测定(PDL)
PDL的决心,人类成纤维细胞被播种到6-well-plates (Sarstedt # 833.920)的密度2 x105每口井。成纤维细胞达到confluency时,细胞数和再次播种密度2 x105。这是继续在75 - 150天。PDL被计算为PDL = 3.2 *(日志收获细胞日志种子细胞)+实际通道数。
2.3免疫荧光染色
成纤维细胞被播种的密度2.5 x104每在一个8-wellµ-Slide (ibidi # 80806)和培养48 h。细胞被固定为4% PFA 37°C 20分钟后跟透化作用与0.2%的TritonX和阻塞阻止缓冲区(皮尔斯无蛋白T20 (TBS)阻断缓冲区,ThermoFisher科学、# 37571)RT对1 h。主要抗体(Anti-phospho-Histone H2A。X (Ser139) # 05 - 636 - 25 - ug, 1:50 0,微孔;甲基K9 Anti-Histone H3 (di), # ab1220, 1:50 0, abcam;abcam Anti-Lamin B1, # ab16048, 1:50 0;Anti-Vimentin # pa1 - 16759年施用,热费希尔科学)孵化一夜之间在4°C。洗后,二次抗体(山羊anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)高度Cross-Adsorbed二级抗体,表达载体;山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L)高度Cross-Adsorbed二级抗体,英杰公司)孵化90分钟。最后,反复洗涤后,细胞被安装4.6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI) Fluoromount-G(南方生物技术,# 0100 - 20)和图像拍摄LSM900共焦显微镜(蔡司)。分析了斐济的软件。γH2A。X焦点被数/核(阈值:20 - 200;尺寸:5)。纠正总细胞荧光(CTCF)计算如下:(CTCF) =集成密度——(选择细胞面积/地区*平均灰度值背景阅读)。 Nucleus size was determined with area (pixel units) of nucleus with Fiji software.
2.4端粒长度测量通过monochromal多元qPCR (MM-qPCR)
一个标准提取工具包(DNeasy血液和组织装备,试剂盒,猫。# 69504)是用于DNA提取。端粒长度是决定使用先前描述的修改MM-qPCR (Cawthon 2009)。DNA样本DNA (20 ng /μL)和一个参考标准(0.137 -100 ng /μL)在一式三份化验在不同的盘子和三个测量被用于报告的平均每个样本平均端粒长度。non-template控制(水)和积极的控制(1301年人类白血病细胞株DNA)准备在重复,每板上运行。标准包括DNA样本352健康的捐赠者,平均年龄为40.14岁(18 - 70岁;38.35%的男性和61.65%的女性)。执行试验使用BioRad CFX384实时C1000热循环与以下资料:1周期15分钟在95°C;2周期15 s在94°C, 1周期15 s 49°C;40 15秒的周期在94°C, 1周期10 s在62°C, 1周期15 s在72°C T信号采集,10 s在85°C, 15秒与信号采集89°C。PCR试剂在使用以下最终浓度:1 U与提供钛Taq Taq DNA聚合酶/钛反应PCR缓冲(猫。# 639208),SYBR绿色我(表达载体,# S7563),每个核苷酸的0.2毫米,1毫米德勤,1 M甜菜碱,每个端粒底漆(900海里Telg, Telc)和300海里每单拷贝基因引物(ALBu, ALBd)。使用引物序列:Telg 5′ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT′3;Telc 5′TGTTAGGTATCCCT ATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA′3;Albu 5′CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGA ATCCTTG′3;Albd 5′GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAAAAGCATGGTCGCCTGTT′3。端粒比单份基因内容(TLR)被认为是相对测量端粒长度和表达任意单位。的intra-assay所有样本变异系数< 0.3。
2.5 p21和p16表达水平的量化
总RNA分离使用“快速RNA Miniprep”工具包(Zymo研究# R1054)根据制造商的协议和200 ng与世隔绝的互补脱氧核糖核酸生成RNA与高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学,# 4368814)。信使rna表达水平测定使用转子基因(试剂盒)Rotor-Gene SYBR®绿色PCR试剂盒(试剂盒,# 204074)使用以下引物:p21 CDKN1A ()前轮驱动5′-GACACCACTGGAGGGTGACT-3′, CDKN1A (p21)牧师5′-CAGGTCCACATGGTCT TCCT-3′, CDKN2A (p16)前轮驱动5′-CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA-3′, CDKN2A (p16)牧师5′-GGTCGGCGCAGTT GGGCTCC-3′。qPCRs在每个样本重复执行(n= 1对应于2复制)。归一化相对于数据集GAPDH(GAPDH前轮驱动5′- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′, GAPDH牧师5′- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′使用delta-delta-CT方法)。
2.6 Senescence-associatedβ-galactosidase (SA-βGAL)测定
活动SA-β-Gal决心使用“衰老β-Galaktosidase染色”工具包(细胞信号,# 9860)根据制造商的协议和数据称为半乳糖苷染色。细胞胞质染色得分为正数。相对细胞总数是量化。
2.7 il - 6和引发剂浓度
ELISA从细胞培养上清液进行了使用“人类il - 6 /白细胞介素- 6酶联免疫试剂盒PicoKine™”(BosterBio # EK0410)或“人类引发/ Interleukin-8酶联免疫试剂盒PicoKine™”(BosterBio # EK0413)根据制造商的推荐程序。在每个样本重复ELISA进行(n= 1对应于2复制)。
2.8统计
统计分析使用GraphPad棱镜8 (LaJolla)。实验小组使用一维方差分析比较(其次是Dunnett多重比较的测试)。统计学意义是建立在p值< 0.05 (∗)< 0.01 (∗∗),< 0.001 (∗∗∗)。数据绘制使用GraphPad棱镜8 (LaJolla)显示出平均值和标准错误的意思。
3的结果
3.1单年龄标志人类成纤维细胞产生不同的结果与不同年龄健康的捐赠者
我们首先要分析选定的标记与实足年龄供体的年龄。因此,我们进行了系统的比较选择时代的标记,考虑这些一个接一个单一的标记,在人类成纤维细胞从14个捐助者看似健康的年轻(2 - 9年),中年人(34-48年),和旧的个人(78 - 96年)(图2一个;表1)。男性和女性捐赠者都包括在内。此外,我们研究了最小的细胞培养成纤维细胞每一行的段落。观察细胞的增长,我们调查了人口翻番水平(PDL)在稳定条件下(37°C, 5%的公司2)(图2 b)。主细胞年轻年轻(1 - 5)和中年人(Midage 1 - 3)捐助者显示健康指数增长。相比之下,从老旧(3)和成纤维细胞非常古老的捐助者(老4、5和6)显示经济增长放缓,除了成纤维细胞老1和2,仿佛年轻供者细胞的增长(图2 b)。
图2。建立的年龄概略介绍面板在人类成纤维细胞年轻,中年人和老年人。(一)细胞模型。首次实验中,成纤维细胞与不同供体年龄使用。(B)人类成纤维细胞的复制的潜力。细胞培养在稳定条件下(37°C, 5%的公司2在DMEM培养基(15%的边后卫,1% Pen-Strep)。PDL观察为马克斯。150天。年轻年轻的成纤维细胞(1 - 5)和中年人(Midage 1 - 3)捐助者显示健康成长。相比之下,成纤维细胞从旧捐助者(老3老4,老5和6)显示经济增长放缓,除了老旧1和2。(ck)X̅=平均值的年轻供体成纤维细胞。(C)γH2A。X每细胞检查如果染色疫源地调查双边带人类成纤维细胞。很老的个体细胞(老4和5)显示γH2A的增加。X疫源地的均值相比,所有年轻的捐助者。中年人和老年人(旧旧旧1,2,3,6)供体成纤维细胞没有双边带。(nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0001, p值均< 0.0001,单向方差分析)(D)CTCF的H3K9Me3人类成纤维细胞。供体成纤维细胞从旧个人(老2,老4,旧5和6)显示减少CTCF的H3K9Me3相比意味着年轻的捐助者。没有改变H3K9Me3 CTCF的中年人细胞(Midage 1 - 3)。(nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(E)端粒长度是衡量MM-qPCR相比,一个标准的健康混合年龄的人。分组年轻供者细胞相比,老6显示一个缩短的端粒长度。(n= 3,意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(G)RNA表达水平衡量存在p21和p16检查调查激活细胞周期阻滞。老4和老5显示RNA p21的表达水平的增加。所有其他细胞并没有显示改变RNA表达水平。(n= 3 - 4,意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(F)量化的SA-βGAL由半乳糖苷染色阳性细胞。分组年轻供者细胞相比,Midage 3和旧人类成纤维细胞(1 - 6)显示的SA -βGAL阳性细胞显著增加。(nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(H)CTCF的核纤层蛋白B1表达。显著减少核纤层蛋白B1表达可以观察到在中年人(Midage 1和Midage 3)老旧(1 - 5)细胞相比,意味着年轻的供体成纤维细胞。(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(I, J)测定细胞因子分泌il - 6,引发在ELISA条件培养基。分组年轻供者细胞相比,老供体成纤维细胞(老1 Old2老3老4,老6)显示il - 6水平的增加。浓度的增加对引发Midage 1中可以观察到老4相比,分组控制。(n= 3 - 4,意味着±SEM, *p< 0.05,* *p < 0001年,* * * p < 0.0001单向方差分析)(K)细胞核的形态变化表现为人类成纤维细胞细胞核面积(像素单元)。在非常古老的供体成纤维细胞细胞核面积显著增加(老4和5)而年轻的控制分组。(nn = 6 - 8(每个测试> 15细胞),意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001、单因子变异数分析。
表1。人类成纤维细胞用于本研究的特点。
接下来,老化的主要特点(DNA损伤,端粒磨损和组蛋白修饰)检查。DNA损伤是衰老的驱动力,因为它有很多分子的后果,也是衰老的标志,如基因组不稳定性、端粒摩擦,表观遗传变化,和/或线粒体功能受损(舒马赫et al ., 2021)。分析的DNA双链断裂(双边带),我们检查了γH2A的数量。X焦点通过免疫荧光染色(图2 c)。人类成纤维细胞从很古老的个人(老4和5)显示重要的大量的双边带与双边带的平均数量在年轻的人。我们下一个组蛋白的化学修饰研究通过免疫荧光染色和量化修正总细胞荧光H3K9Me3 (CTCF) (图2 d)。老化的异染色质损失模型假定异染色质域形成早期的胚胎发生在衰老和减少导致全球亏损heterochromatin-induced基因沉默,从而导致异常的基因表达模式(Villeponteau 1997)。在我们的研究中,我们观察到中年人没有变化(Midage 1 - 3),但降低H3K9Me3表达老供体成纤维细胞(老2,老4,老5,老6)。此外,我们测量端粒长度由单色多路复用qPCR (MM-qPCR) (图2 e)。端粒是专门的染色质结构的真核染色体为保护染色体末端。端粒缩短与衰老是人类观察到在大多数组织中,它已经被测试(兰格,2005),是一个最好的理解机制限制了正常细胞的生长在文化、一种现象被称为“复制衰老”(Blasco Collado, Serrano 2007)。相比年轻供体成纤维细胞的意思是年轻(1 - 5),老六是唯一细胞系表现出显著的端粒缩短。
后,单一的敌对的年龄标记系统地调查,包括诱导细胞周期阻滞,SA-βGal,激活senescence-associated分泌表型(SASP),(即核纤层蛋白B1表达和形态学变化。核的大小)。细胞周期阻滞在衰老在很大程度上是由激活的一个或两个肿瘤抑制通路p53、p21和p16 /复审委员会(Kumari Jat, 2021)。这两个路径非常复杂,涉及许多上游监管者和下游效应器,以及几个侧分支(陈et al ., 2002;Rovillain et al ., 2011)。我们读出了细胞周期阻滞RNA表达水平p21和p16 (图2 g)。老4和老5表明p21 RNA表达水平的提高。否则,没有一个人类成纤维细胞显示改变RNA p21的表达水平或p16。随后,我们确定SA-βGAL阳性细胞的数量,最常用的细胞衰老的标志之一。从化合物的溶酶体水解酶β-galactosidase劈开终端β-galactose如乳糖、角质硫酸盐,鞘脂类等。它存在于几乎所有的组织。这种酶的活性增加与细胞衰老的发展(Dimri et al ., 1995)。我们决定SA-βGAL阳性细胞的数量(图2 f)。相比年轻供者细胞的意思是年轻(1 - 5),旧人类成纤维细胞(1 - 6)显示SA -βGAL阳性细胞显著增加,而在中年人捐赠者,只有Midage 3显示在SA -βGAL阳性细胞显著增加。之后,我们调查核蛋白质表达水平确定CTCF核纤层蛋白B1 (图2 h)。核纤层蛋白B1表达随年龄和被认为是一个标记(时代王et al ., 2017;Kristiani米里,Youngjo, 2020年)。最近的研究表明,核板调节的三维核染色质结构的外围组织(悦,郑,郑,2019)和基因表达,例如,炎症反应的基因(沙et al ., 2013)。显著减少核纤层蛋白B1表达在中年人和老年人供体成纤维细胞(Midage 1, Midage 3,老1 - 5)相比,意思是年轻的供体细胞。为研究SASP激活,反映衰老细胞(Coppe et al ., 2008),我们检查了分泌浓度的两个原则SASP因素,炎性细胞因子白介素6 (il - 6)和白介素8(引发)由ELISA供体细胞条件培养基(图2 i, J)。il - 6的浓度的增加中检测出旧供体成纤维细胞(旧1-Old 4和6)相比,分组控制。此外,Midage 1老4显示显著增加引发的水平。此外,众所周知,细胞核大小变化与年龄和病理条件(Capell et al ., 2005;格林格洛弗,2005;Haithcock et al ., 2005;韦伯斯特,Wikin Cohen-Fix, 2009年)。研究形态发生变化与衰老或在与年龄有关的疾病的发病机理,我们对细胞核的大小使用像素面积DAPI染色(图2 k)。核大小显著扩大只有在非常古老的人类供体成纤维细胞(旧4和5)相比,年轻的控件(分组Heckenbach et al ., 2022)。
总之,当系统地调查上述众所周知的单身时代标记,有一个显著的不同年龄的人类捐助者之间的异质性,因此它可能很难判断在生理年龄要是单独调查一个老化的标志。虽然SA-βGAL是最好的单一标记描述老供体的年龄,年龄并没有完全区分midage年轻供体的年龄。因此,我们继续开发策略一起使用上述标记在一个小组,最终产生一个集成AgeScore结果。
3.2计算提出AgeScore与供体年龄人类成纤维细胞检查
考虑个人更好的细胞系可变性我们使用上述单一标记来生成一个小组用一个绝对值从测试时代标记然后问自己这个值是否描述了成纤维细胞的实足年龄不同的供体年龄一样好,甚至比单标记(图3一)。创建这个分数(以下简称AgeScore)每个主要的细胞培养系统检查收到同等重量的“1”为重要的(积极的)年龄标记结果与“0”的重量为每个非重要(消极的)结果。随后,测试年龄的标记结果总结计算主AgeScore (A)和(B)对抗AgeScore。最后,两个分数一起导致了(C)满是能够区分AgeScore老少捐赠者派生成纤维细胞显示随着年龄的增加(图3 b)。每使用时代标志我们计算皮尔逊相关和最时代标记与AgeScore (补充图S1)。我们观察到一个非常高的相关标记H3K9Me3, p21,细胞核大小和SA-β-Gal核纤层蛋白B1和H2AX高度相关。然而,这是一个温和的相关性对端粒长度和p16的低相关性,白细胞介素6、IL8。,所有的年轻供体成纤维细胞显示全面AgeScore 0,只有敌对AgeScore增加中年人了成纤维细胞(敌对AgeScore = 2)。在旧供体成纤维细胞,主要以及敌对AgeScores增加,导致最高AgeScore计算。皮尔森的相关性R= 0.86 (图3 c)表明,我们AgeScore倾向于增加供体年龄人类成纤维细胞检查。
图3。计算全部AgeScore与成纤维细胞供体的年龄。这里提出完整AgeScore(初级AgeScore +对抗AgeScore)与供体年龄人类成纤维细胞检查。(一)计算提出了给定AgeScore例子(1,老少4)。每个纤维母细胞检测为非重大的时代标志收到0和1的重要时代标记测试。这些值总结主要AgeScore和对立的AgeScore。都是完整的AgeScore的总和。(B)计算AgeScore检查人类成纤维细胞显示AgeScore即将到来的供体年龄的增加。(C)皮尔森相关AgeScore和供体年龄的成纤维细胞进行测试。供者年龄与我们计算AgeScore皮尔森的R为0.86。
我们下一个旨在研究的外部效度提出了与年龄有关的标记板在两个特定场景的老化,即,在复制衰老/衰老(图4)和人工老化(图5)由Progerin超表达(米勒et al ., 2013)。
图4。检查AgeScore人类成纤维细胞复制衰老。(一)细胞模型的验证提出AgeScore,成纤维细胞年轻,中年人和老年人捐助者被复制的。(我)X̅=平均值的年轻的捐助者。(B)γH2A量化。X在成纤维细胞在高通道(p> 35)相比,所有年轻的意思低。γH2A。X疫源地每个细胞增加在所有细胞在高的段落。(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001,单向方差分析)(C)如果染色H3K9Me3的量化。CTCF的H3K9Me3表达式显示明显降低高段的年轻4,Midage 1, Midage 3老3分组相比年轻低。(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001,单向方差分析)(D)端粒长度是衡量MM-qPCR相比,一个标准的健康混合年龄的人。分组相比年轻低1、高通道的年轻,年轻的2,Midage 3老3显示端粒长度缩短。(n= 3,意味着±SEM, *p< 0.05,* *p< 0.001,* * *p< 0.0001,单向方差分析)(F)RNA表达水平p21和p16的存在。细胞周期阻滞被upregulation检测p21和p16的年轻1高Midage 1高1、老高老3高(n= 4,意味着±SEM *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(G)调查的细胞因子分泌il - 6,引发在ELISA条件培养基。SASP激活高架在所有被复制衰老成纤维细胞相比,所有年轻的意思低(n= 3 - 4,意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(E)量化核心区域的像素单元。细胞核面积显著增加在所有高段的人类成纤维细胞相比,低分组段落的年轻低。(nn = 8(每个测试> 15细胞),意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(H)量化的SA-βGAL由半乳糖苷染色阳性细胞。数量的积极SA-βGal染色细胞在高段显著增加在所有细胞相比,所有年轻的意思低。(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(我)量化的核纤层蛋白B1表达如果染色。显著减少核纤层蛋白B1表达在低段Midage 1日Midage 2和在所有高通道(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(J)AgeScore计算。AgeScore增加与复制衰老细胞。
图5。检查AgeScore在人类成纤维细胞过早老化的年轻献血者。数据过早老化的成纤维细胞(诱导Doxycyclin)被标记为红色。(一)验证提出的AgeScore,年轻的供体成纤维细胞过早老化的dox-inducible Progerin超表达。(B)如果γH2A的形象代表。X和GFP-Progerin信号在强力霉素的缺失和存在(1μg /毫升)后4天。γH2A。X疫源地每个细胞增加与GFP-Progerin表达细胞系(年轻,年轻5)相比non-induced成纤维细胞。(nn = 3(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001,单向方差分析、规模酒吧= 10µM](C)代表如果H3K9Me3和GFP-Progerin的图像信号在强力霉素的缺失和存在(1μg /毫升)后4天(合并包括红色=波形蛋白)。CTCF显示没有变化在过早老化的年轻捐赠者H3K9Me3 [nn = 3(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0001, p值均< 0.0001,单向方差分析、规模酒吧= 10µM](d - i)X̅=平均值的年轻的捐助者。(D)端粒长度是衡量MM-qPCR相比,一个标准的健康混合年龄的人。non-induced细胞相比,年轻4和年轻5 progerin表达式显示一个空的端粒长度。(n= 3,意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(E)RNA表达水平存在的p21和p16测量调查激活人类成纤维细胞的细胞周期阻滞。年轻,年轻4和年轻5 progerin表达式显示相对RNA表达水平的提高p16相比non-induced控制。(n= 3,意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(F)如果图片和量化SA-βGAL代表由半乳糖苷染色阳性细胞。所有三个年轻的捐赠者细胞系诱导GFP-Progerin表达式显示阳性染色SA-βGAL细胞量的增加。(nn = 3(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(G)代表如果图像和量化的原子核(像素单元)在人类成纤维细胞过早老化。核面积显著增加在所有三个年轻与诱导GFP-Progerin供体成纤维细胞。(nn = 6(每个测试> 15细胞),意味着±SEM *p< 0.05,* *p < 0001年,* * * p < 0.0001、单因子变异数分析、规模酒吧10µM):(H)测定细胞因子分泌il - 6,引发)在人类成纤维细胞条件培养液GFP-Progerin表达式non-induced细胞ELISA相比。所有过早老化的成纤维细胞有显著提高il - 6和引发浓度相比,分组控制。(n= 3 - 4,意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(我)代表如果图像和量化的核纤层蛋白B1染色。显著减少核纤层蛋白B1表达在所有三个人类成纤维细胞过早老化的(nn = 3(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0, 0001单向方差分析)(J)计算AgeScore过早的衰老成纤维细胞相比,年轻的捐助者non-induced控制。
复制衰老(图4一我们系统地比较低(p= 5 - 15)和高通道(p= > 30老2 - 4除外)的年轻人,中年人和老年人donor-derived人类成纤维细胞。从每个年龄段我们选择两种不同的纤维母细胞行显示足够的增长使使,直到高通道。
首先,我们调查了小学时代的标记。成纤维细胞在高通道(高在双边带γH2A衡量显示显著增加。X疫源地的均值相比低通道(低)的年轻供者细胞(图4 b)。我们总是比的均值控制和没有使用配对t以及相应的低通道细胞线来描绘not-isogenic条件。表达H3K9Me3减少年轻4高Midage 1高Midage 2高老3高分组相比年轻低(图4 c)。缩短的端粒被年轻的1高2、年轻高Midage 3高老3高而所有年轻的意思低(图4 d)。核区(图4 e)和大量正面SA-βGal染色细胞(图4 h)是在所有细胞在高段显著增加。接下来,我们检查了对立的时代标志。我们检测到细胞周期阻滞的upregulation标记p21和p16在年轻的1高Midage 1高1、老高老3高(图4 f)。此外,SASP激活测试通过释放il - 6和引发细胞培养基被发现在所有高的成纤维细胞通道相比,所有年轻的意思低(图4 g)。此外,高段的成纤维细胞表达减少核纤层蛋白B1(显示图4我)。总之,所有高通道细胞同质的显示各种年龄的标记和完整显示高AgeScore (图4 j)。
人工老化中,我们使用一个doxycycline-inducible GFP-Progerin表达系统(Kubben et al ., 2016)在年轻的供体细胞作为人工老化的模型系统。让我们的细胞老化及时明确的方式。Progerin确实表达诱导大量的同质和快速表达时代的标记。四天后GFP-Progerin感应与强力霉素(1μg /毫升),形成人类成纤维细胞过早老化的显示与年龄有关的核被膜表型的各种主要的表达时代的标记。我们总是比控制和的均值不配对t以及相应的低段细胞系不引起偏见由于同基因的遗传背景。所有年轻捐献者的成纤维细胞γH2A GFP-Progerin表达式显示显著增加。X疫源地相比non-induced成纤维细胞(图5 b组蛋白的化学修饰)而没有变化(图5 c)。non-induced细胞相比,年轻4和年轻5 GFP-Progerin表达式显示一个缩短的端粒长度(图5 d)。随后,我们调查了敌对的年龄年轻捐献者的标记过早老化的成纤维细胞。我们观察到显著增加RNA表达p16的成纤维细胞与GFP-Progerin表达式(图5 e)。所有过早老化的成纤维细胞显示,SA-βGal阳性细胞数量显著增加(图5 f),核区(图5克和细胞因子释放图5 h)相比,non-induced细胞。此外,核纤层蛋白B1表达显著减少过早老化的成纤维细胞(图5我)。一般来说,AgeScore显示增加下GFP-Progerin表达年轻供体成纤维细胞(图5 j)。Progerin过度迅速引起早衰,实际上是非常类似于复制衰老(图4)。
3.3成纤维细胞早衰症患者症状表达年龄的标记到一个更高的学位
最后,我们想要解决的问题是如何不同的衰老标记行为过早衰老疾病的细胞培养模型。为此我们研究低通道成纤维细胞从早衰症患者症状计画和WS相比年龄匹配控制,分别是(图6)。控制计画是WS因此明显比对照组更年轻。
图6。应用AgeScore早衰症症状。(一)成纤维细胞的细胞模型的验证提出AgeScore捐助者与早衰症综合征相比年轻/中年人捐助者。(B)γH2A。每细胞检查如果X疫源地染色对双边带进行调查。有γH2A的增加。X焦点在所有细胞的早衰症状。(nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0 0001单向方差分析)(C)CTCF H3K9Me3人类成纤维细胞的早衰症患者。有H3K9Me3表达减少捐赠计患者的成纤维细胞(计1和计2)。nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(D)端粒长度是衡量MM-qPCR相比,一个标准的健康混合年龄的人。没有端粒长度变化的人类成纤维细胞的早衰症综合征患者相比年龄组。(n= 3,意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(E)RNA表达水平衡量p21和p16的存在。激活细胞周期阻滞在WS发现调节RNA p16的表达水平。(n= 3 - 4,意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(F)量化的SA-βGAL由半乳糖苷染色阳性细胞。供体成纤维细胞的早衰症状显示的SA -βGAL阳性细胞显著上升。(nn = 3 - 4(每个测试> 15细胞),意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(G)CTCF的核纤层蛋白B1表达。显著减少核纤层蛋白B1表达在HGPS1观察,计2和WS1相同。(n= 4(测试每个n > 15细胞),意味着±SEM, *p< 0 05年* *p < 0001年,* * * p < 0.0001单向方差分析)(H I)测定细胞因子分泌il - 6,引发在人类成纤维细胞条件培养液ELISA。早衰症研究供体成纤维细胞、HGPS1和计2显示增加引发浓度的均值年龄组相比。(n= 3 - 4,意味着±SEM, *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(J)细胞核的形态变化表现为细胞核面积(像素单元)。核面积显著增加在所有细胞的早衰症综合征患者相比年龄组。(nn = 6 - 8(每个测试> 15细胞),意味着±SEM *p< 0.05,* ** * * p < 0.001, p < 0.0001单向方差分析)(K)计算AgeScore测试人类成纤维细胞。早衰症综合征患者的AgeScores(计1和2,WS 1和2)相比,高年龄组。
早衰症的增长率成纤维细胞在稳定的条件下进行了PDL (37°C, 5%有限公司2)(补充图S2)。捐助者计患者的成纤维细胞显示在PDL没有变化,而WS患者的成纤维细胞显示经济增长放缓而年龄组的均值。接下来,我们调查了小学时代的标记。早衰症综合征的成纤维细胞,我们确定γH2A的增加。X焦点在所有测试细胞(HGPS1,计2,WS 1, WS 2)相比,所有年龄组的意思(图6 b)。此外,我们观察到H3K9Me3表达减少捐赠计患者的成纤维细胞(计1和计2)。从WS患者成纤维细胞(没有变化图6 c)。分组年龄组相比,成纤维细胞的早衰症患者显示没有端粒长度的变化(图6 d)。
其次,我们检查了对立的时代标志。激活细胞周期阻滞在WS调节RNA表达水平的检测p16 (图6 e)。此外,在我们观察成纤维细胞早衰症患者增加SA-βGAL阳性细胞(图6 f)和显著减少核纤层蛋白B1表达计1,计2和WS 1 (图6克)。在计患者的成纤维细胞,我们观察到的浓度显著增加引发的媒体。没有改变SASP标记il - 6的水平或引发WS成纤维细胞(图6 h,我)。所有早衰症成纤维细胞显示增加核区(图6 j)。AgeScores人类成纤维细胞的早衰症患者(计1和2,WS 1和2)因此高年龄组相比,类似于旧的供体成纤维细胞(图6 k)。
有趣的是,单个标记的模式在AgeScore之间不同的计画细胞和人工老化的细胞,由过度Progerin(年龄图7)。此外,单个标记的模式在不同的捐赠者之间的AgeScore非常类似的早衰症综合征,不过确实也在不同计画和WS (图7)。总结个人年龄标志表达的细胞系和老化条件提出了表2。
图7。AgeScore的模式。年轻人和老年人之间的AgeScore捐助者的模式(在活的有机体内老化)越来越多地转向积极的一面取决于供体的年龄。的模式在活的有机体内老化是类似于复制和人工老化。在这里,一个非常强大的转变到积极的测试。的模式在活的有机体内衰老过程的模式不同于早衰症的疾病,但强烈的改变和增加AgeScore可以观察到。
表2。每细胞系调查年龄标志的频率表达式。描述是主要调查的频率和敌对的时代标志表达各自的条件。描绘的积极测试细胞系和括号里的总数调查细胞系/标记条件,分别。
4讨论
尽管存在各种假定的年龄的标记,比较不同研究衰老细胞受到这一事实往往只使用单一的标记(Lopez-otin et al ., 2013;哈特曼et al ., 2021)。这里,我们系统地研究了一组在不同细胞老化条件下建立年龄的标记。这样做,我们提出的各种常用的年龄一起标记似乎衡量细胞的衰老过程的影响至少一样好单一标记但另外给见解在衰老过程的复杂性图7;表2)。此外,小组可能有助于弥补偏见由于遗传背景的差异。
疾病和/或衰老的细胞模型是更重要的发现以来iPSC和其他“诱导”细胞技术。虽然这些技术使以前无法原产地调查patient-derived细胞模型(例如,神经元),他们还大大改变细胞的一般方面包括他们的生理年龄。不同年龄的分数/时钟有因此被提出在过去几年估计生理年龄与不同程度的准确性(陆et al ., 2019;Tarkhov,杰尼索夫骑兵连,Fedichev, 2022年)。众所周知,老化导致表观遗传的改变DNA甲基化,通过几个不同的重叠与年龄有关的机制(所有et al ., 2013;Lopez-otin et al ., 2013)。同时,许多DNA甲基化的时钟,它允许生物年龄从间接推断年龄特异性DNA甲基化模式,最近成立,使生物体的生理年龄估计在大型组织样本多元机器学习模型(所有et al ., 2013;阅读2013;罗宾逊et al ., 2020;Van Den ak et al ., 2020;Hwangbo et al ., 2021)。然而,使用标准细胞培养这些调查往往不一定昂贵,需要特定的设备可用。
所有的细胞都在这个研究显示相当多样化的时代特征标记表达式,可见在这里提出的与年龄有关的标记面板(图7;表2)。这说明了两个概念:一方面它可能描绘了个性的衰老过程本身为基础,在其他捐助者的遗传异质性(施耐德和三井,1976年)。另一方面,它也显示单个标记表达式的异质性和缺陷时只考虑单个标记。捐助者与不同年龄的与年龄有关的标记面板显示与实足年龄增加,即旧供者细胞显示更高的异质性。例如,成纤维细胞从老4的得分最高,但老4的捐赠者是比老年轻6分4。不过,相比,年轻献血者(所有得分0)和中年人献血者(得分0 - 2),它变得明显,随着年龄的增长而显著增加。此外,复制衰老引起的分数最高,高于供体年龄本身。因此,分数可能是最敏感的检测复制衰老,或复制衰老标记选择可能过多。值得注意的是,分数还增加了复制衰老甚至已经增加的情况下由于供体的年龄。此外,过早衰老疾病的初步研究(图6)在两个指向增加分数。有人可能会讨论引入一个附加AgeScore权重系统,例如,通过考虑各自的频率标记表达在不同年龄/老化条件(表2)。然而,这种权重可能不是推广到其他细胞系或“诱导”细胞模型,因此需要进一步细化和验证。
有趣的是,“敌对年龄标记”似乎比“小学年龄的标记”。敌对的时代标志总是复制/人工老化和表达已经出现在中年人的捐赠者。虽然这些也积极没有主要的时代标志是增加,从来没有这样反之亦然。然而,我们不能排除这可能是因为检测限制各自的标记。
异质性不同标记的表达最高,当调查供体年龄依赖性。这种异质性可能是由于不同的遗传背景不同的捐赠者也由于生理年龄的差异(即他们的健康状态在活检)各自的捐助者。理想情况下这将意味着各自的生理年龄供体年龄也被估计使用一个分数。然而在实践中,这种生理年龄的捐赠者通常不是可用的。这种异构性不明显的复制衰老和人工加速老化。为了减少这种异质性在后者,我们比较了复制衰老和progerin过度诱导衰老不是各自的供体细胞(=同基因的背景),但所有控制条件的意思。然而,复制和progerin诱导衰老实验设置可能比衰老定义在单个细胞隔离之前有或没有过早老化疾病。
此外,我们检查的模式与年龄有关的标记面板内的单个标记的细胞和研究条件(图7)。这另外支撑观察衰老过程是多样化,和也可能占多数之间的偏差AgeClocks描述到目前为止。看着面板时,我们看到一个清晰的模式的变化根据这些不同的标记供体的年龄,但也不同年龄相仿的捐助者之间的显著区别。即使所有标记选择被报道是年龄或增加与衰老有关,我们很少发现他们所有人一起增加。特定的标记如SA-β-Galactosidase显然与衰老有关,阳性细胞增加在几乎所有老化条件(图7;表2),但是他们仍然有一些小问题例如,标签清楚所有的中年人捐助者(图2)。有趣的是,另一个年龄评分系统称为CultureAge-did甚至报告缺乏相关性SA-β-Galactosidase CultureAge (Minteer et al ., 2022)。p21等时代标记显示只在几个测试细胞的增加。复制衰老和人工老化引起的更强大,尤其是更同质的改变整体标记模式。虽然总分的标记面板在维尔纳综合症更高的成纤维细胞,计画的模式和WS显著不同。
我们研究的一个限制是人类皮肤成纤维细胞的独家使用。能够很好的接受,在组织细胞老化不同在活的有机体内和在体外。此外,特定标记物的表达,例如,p16和p21,是依赖于组织的。因此,AgeScore也可能受到影响的细胞来源。此外,一些只标记了就更难成为积极的年龄条件尽管被描述为建立年龄标记(表2)。因此未来的研究是必要的调查AgeScore的价值及其在细胞标记面板/胚层来源包括来自不同组织(重新)编程环境,并最终减少AgeScore面板的标记,都成为积极的年龄条件,无论组织起源。
总之,我们这里提出的使用与年龄有关的标记面板中,认为应用的关键年龄的标记在体外细胞培养,并演示了其有效性评估供体年龄、复制和人工老化以及早衰。这AgeScore可以很容易地进行标准的细胞培养实验室的两个人价值也标记模式允许良好的可比性老化过程的多样性。还需要进一步的研究来进一步验证AgeScore提出的使用,也为其他在体外和在活的有机体内应用程序。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
涉及人类受试者的研究回顾和批准Ethikkommission der Technischen德累斯顿大学,德国。书面知情同意参加本研究参与者提供的法定监护人/近亲。
作者的贡献
CH和AHe起草兆瓦的手稿与输入,GF,啊哈。CH、LH、VK,啊哈实验和分析底层表的准备。AHe主要提供资源和资金和监督。所有作者批准了最终版本的手稿和长足,直接和知识贡献的工作,批准发布。
资金
这项工作是支持的,在某种程度上,由FORUN2000罗斯托克大学医学中心的AHe CH和无关基金会。支持AHe赫尔曼和莉莉Schilling-Stiftung毛皮medizinische大幅减退Stifterverband化生。支持GF BMBF (FKZ 01 zx1903a)。
确认
我们深深感谢伟大的细胞培养帮助Jette亚伯。图1,2,4,5,7创建在线软件BioRender.com。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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收到:2022年12月21日;接受:2023年2月02;
发表:2023年2月15日。
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琳恩Juel拉斯穆森丹麦哥本哈根大学版权©2023哈特曼,假蝇,哈特曼,Kockritz Fuellen,沃尔特和赫尔曼。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:安德烈亚斯•赫尔曼,andreas.hermann@med.uni-rostock.de