年龄相关性积累τ聚合秀丽隐杆线虫
温迪·阿涅斯
本杰明·库姆斯
t . Gamblin克里斯3和
布莱恩·d·《- 1实验室的分子生物科学,堪萨斯大学的劳伦斯,KS,美国
- 2转化神经科学部门,大急流城,密歇根州立大学,美国
- 3神经科学、发育和再生生物学,德克萨斯大学圣安东尼奥马刺,TX,美国
衰老是主要的危险因素为阿尔茨海默病(AD)和相关疾病(ADRDs)。τ聚合是一个标志的广告和其他tauopathies。即使在正常老化,τ聚合存在于大脑,但在疾病状态,更多聚合τ存在于大脑区域展示突触变性和神经损失。目前尚不清楚如何τ聚合和老化的互动产生的表型观察到疾病状态。大多数广告/ ADRD动物模型都集中在后期阶段,发生了重大τ后聚合。越来越少,我们可以观察到早期聚集事件和在衰老进程。为了解决这个差距,我们创建了秀丽隐杆线虫模型表达人类τ蛋白GFP-tagged版本。这里我们研究如何tau-gfp表现在老化,比较野生型τ(hTau40),疾病相关变异(P301S),和一个aggregation-prone变体(3 po)。我们测量年龄相关性变化GFP强度和线虫相关的这些变化正常老化。我们发现不同τ表示稳定和积累取决于τ变体。hTau40GFP和P301SGFP局部轴突和细胞的身体,而3 pogfp更多集中在细胞体。表达式3 pogfp导致寿命减短,运动速度的变化,符合病理效应。最后,我们发现人类τ基因与互动秀丽隐杆线虫人类τ的直接同源,ptl-1,的损失ptl-1大大加速了死亡时间在动物表达3 po。
介绍
衰老是主要的危险因素为阿尔茨海默病(AD)和其他AD-related障碍(ADRD)。广告是最常见的老年性痴呆和影响超过650万人(Rajan et al ., 2021)。人65岁及以上的人口到2050年预计将翻一番(国家,2019)。这些统计数据表明了解衰老的紧迫性的几率提高了神经退行性疾病(如广告和ADRDs)和聚合蛋白的存在加速衰老,增加死亡率。
正常老化的特点是蛋白质体内平衡(下降泰勒和迪林,2011年;Lopez-Otin et al ., 2013)。细胞过程,维持proteostasis下降会导致蛋白质聚合(Ben-Zvi et al ., 2009;黄et al ., 2019)。个人死后大脑诊断为广告和ADRDs高浓度的胞内神经原纤维缠结(非功能性测试)由蛋白质τ。大多数人会自发地发展低聚物的复合物聚合不同τ除了非功能性测试,因为他们年龄(黄et al ., 2019),并至少有一项研究表明,非功能性测试与正常,与年龄相关的认知下降(Guillozet et al ., 2003)。然而,个人与广告或ADRDs将开发更高浓度的非功能性测试,尤其是在突触损失和神经元死亡的大脑区域,可以观察到(赵et al ., 2017;Ziontz et al ., 2019;陈et al ., 2021)。因此,关于τ聚合的差异仍然在正常老化与疾病,以及与年龄有关的可能会加速下降的状态。
有几种动物模型对广告和其他ADRDs,与许多主要侧重于amyloid-ß的聚合(“斯皮罗,2002年;天天p和灰色,2010年;普里和李,2010年)。然而,最近的研究强调的重要性和复杂性tau蛋白在这些障碍。与年龄相关的变化τ已被证明损害生物能疗法(综述(格林,2021),自噬(Chatterjee et al ., 2021),钙的摄入量(达塔et al ., 2021)和其他细胞活动。此外,结构研究表明,τ采用不同构象的疾病可能有不同的疾病的因果关系功能(奥克利et al ., 2020;谢尔et al ., 2020;施et al ., 2021)。仍有需要新的在活的有机体内模型的可视化τ蛋白动力学、测量老化的影响,遗传学,细胞类型在聚合或其他环境变量。
在这里,我们描述一个模型可视化τ在老化秀丽隐杆线虫模型。的线虫秀丽隐杆线虫已被用来作为生物模型来识别机制,调节寿命(凯尼恩,2010;Lopez-Otin et al ., 2013)。几项研究已经强调了蛋白质组重构之间的关系,在线虫蛋白聚合和正常老化(大卫et al ., 2010;Ciryam et al ., 2013;沃尔特et al ., 2015;黄et al ., 2019)。最近的一项研究显示,长寿的线虫突变体有延迟性的健康下降,激励更清楚的了解衰老过程诱发与年龄有关的下降(Statzer et al ., 2022)。动物模型(τ)聚合一直报道寿命下降归因于人类τ的超表达(维特曼et al ., 2001;Sealey et al ., 2017;海厄姆et al ., 2019;麦克唐纳et al ., 2019)。同样,线虫表达人类τ也会减少寿命和验证的存在聚合τ(Kraemer et al ., 2003;Pir et al ., 2016)。这里我们发现表达gfp-tagged人类τ线虫寿命降低,与更大的减少与τ的积极聚合版本(3 po)。这减少寿命被删除该基因的突变,增强编码内生微管相关蛋白,PTL-1,暗示这是保护在这个上下文。
材料和方法
菌株和遗传学
N2 (var。布里斯托尔)作为野生型参考菌株在所有实验。压力保持在在18到22岁的°C,使用标准的维护技术描述(布伦纳,1974)。菌株中使用本报告包括:RB809 [ptl-1 (ok621)),NW1229evIs111[Prgef-1:GFP) (Altun-Gultekin et al ., 2001),EVL1654lhIs94[Prgef-1:EVL1644 hTau40GFP]lhIs92(Prgef-1:hTau40-P301SGFP], EVL1372lhIs84[Prgef-1:3 potaugfp]。创建τ转基因DNA注入浓度以下:lhEx274(Prgef-1::hTau40GFP 5 ng /μl;Pstr -1:GFP 5 ng /μl);lhEx646(Prgef-1::hTau40 (P301S) GFP 5 ng /μl;Pmyo-2:RFP 5 ng /μl;Pstr -1:GFP 5 ng /μl);lhEx327(Prgef-1::3 potaugfp 5 ng /μl;Pstr-1:绿色荧光蛋白5 ng /μl)。转基因是综合使用Trimethylpsoralen和紫外线作为描述(Najarro et al ., 2012)。动物被饥饿孵化,然后放在同步大肠杆菌(OP50)开始发展。
包埋疣状
Anti-TAU染色是使用Bouin固定所述(九重奏曲et al ., 1997)。本研究中使用的主要抗体:兔子anti-TAU (1:1000 A00024-A安捷伦),鼠标anti-TAU (1:50 0, TNT1) (Kanaan et al ., 2011;梳子et al ., 2016)。二次抗体使用Alexa 488 -标记山羊anti-rabbit和Cy3山羊anti-mouse 1:50 0稀释。
荧光显微镜和图像分析
图像获得使用一个奥林巴斯FV1000激光扫描共焦显微镜配备Fluoview软件。Z-stacked图像拍摄和出口ImageJ (施耐德et al ., 2012)。图像使用max z-projected强度和ROI是在相关领域的尾巴(GFP图像)或腹神经索(疣状)。以下测量选项被选中:区域,意思是,最小值,最大值,集成像素强度,和生综合像素强度。图像的区域毗邻动物被用来评估的背景,这是相对于原始像素密度,然后这个值除以面积到达一个归一化值报告GFP荧光。
生化特性
线虫生长在标准NGM盘子和维持在20°C。妊娠线虫是收获和洗板使用M9缓冲区和15毫升锥形管收集。使用漂白剂和孵化胚胎提取5分钟而旋转。胚胎洗四次和resuspended M9缓冲区,在那里,他们可以随意舱口一夜之间,在缺乏食物。Starvation-arrested L1蠕虫是生长在含液体培养大肠杆菌(HB101)、胆固醇和1 x HyClone Antibiotic-Antimycotic解决方案(热科学)。蠕虫是保持恒定的摇晃在20°C和收集和清洗在M9缓冲天1和3的成年。最后用冰冷的RAB重组的缓冲补充与蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒(热科学、PI78440)和5毫米EDTA。100毫克的紧凑蠕虫被整除到存储在−1.5毫升管和80°C。
执行顺序蛋白质提取的(Kraemer et al ., 2003),小的修改。短暂,τresuspending获得的分数是100毫克蠕虫病毒颗粒在两次(wt /卷)高盐RAB重组的缓冲区(G-Biosciences PI53113)补充1 x的最终浓度蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒(热科学、PI78440)。相同体积(紧凑虫/珠子)的冰冷的0.5毫米玻璃珠(BioSpec产品)被添加到管中。蠕虫是细胞溶解使用BeadBug超小型电子管均质器(基准科学)最高速度为5 s, 4次剩下20年代在每个会话之间在冰上。的解决方案是在冰上孵化30分钟然后离心机在4°C (20817 xg) 30分钟。上层清液被认为是可溶性分数。剩下的颗粒被冰冷的RAB缓冲区和提取与EDTA里帕缓冲区(G-Biosciences AAJ61529AK),通过孵化冰20分钟和离心4°C (20817 xg) 15分钟。得到的上层清液被认为是detergent-soluble分数。颗粒被冰冷的里帕缓冲区和提取与尿素(30毫米三7 m尿素,2 m硫脲,4%的家伙(3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] 1-propanesulfonate), pH值8.5)(Pir et al ., 2016),孵化15分钟在室温和离心机在室温下(RT) (20817 xg) 10分钟。由此产生的浮层被认为是尿素溶性分数。
蛋白质分数在10%聚丙烯酰胺凝胶和解决转移到PVDF膜(止动剂,IPFL00005)。以下使用抗体:单克隆anti-tau Tau-5 (1:20 00;热科学),Tau-7 (1:20 00;微孔σ),Tau-12 (1:20 00;微孔σ),Anti-Alpha-Tubulin (1:10,000;热科学),anti-mouse HRP-labeled二级抗体(1:5000;热科学)。PVDF膜可视化使用Licor奥德赛Fc成像仪。免疫印迹图像转移到PowerPoint裁剪,对齐和注释;没有收购后调整亮度和对比度。
生存分析
50-late阶段L4被转移到一个OP50播种NGM板和维持在20°C的持续时间分析。活的动物被数和搬到一个新的板块每天的第一个7天测定每2 - 3天,然后在蠕虫停止产卵。死虫子的数量被记录。2 - 5独立实验复制每个应变了。
运动分析
线虫运动进行了分析使用WormLab跟踪软件(MBF生物科学)。L4线虫选择和种植在标准NGM盘子了大肠杆菌(OP50)。动物每天都被转移到新的板块和维持在20°C。当天化验,线虫被转移到新的NGM板(没有食物)来消除多余的OP50线虫的角质层。个人蠕虫选择和放置在一个新的NGM板(没有食物),可以适应在收购前1分钟视频。(记录(11.1帧每秒)被使用CCD相机(徕卡DFC 3000 g)附加到荧光立体显微镜(徕卡M165 FC)。速度是衡量天1、3、5、7的成年。
统计数据
分析使用GraphPad RStudio(9.0.0)或使用R (团队,2019;团队,2020)。GFP分析交互方差分析模型计算(天*τ变种),和明显不同的交互使用图基HSD测试评估,和P-adjusted值< 0.01是用来确定的意义。Log-rank (Mantel-Cox)用于生存曲线的比较分析。一个阈值建立了意义p< 0.05和图传说中定义和用星号表示。
克隆和分子生物学
τ变异放大了PCR从细菌表达克隆。原hTau40表达载体(pT7C)描述的是(卡梅尔et al ., 1996)。P301S从hTau40 pT7C向量生成使用QuikChange定点诱变工具包(Stratagene)制造商的协议。3 poτ是来自hTau40通过以下修改:I278N + N279I +ΔK280 + V309Y + Y310V +ΔP312 + S341I +ΔE342,使用QuikChange定点诱变工具包(Stratagene),基于前面描述的策略优化τ的自发聚合(Iliev et al ., 2006)。PCR产品插入pCRII-TOPO(英杰公司)使用制造商的协议。克隆被重组成一个P的条目rgef-1瓦:gfp: unc-543′UTR目标向量(pCZ # 599,进实验室的一个慷慨的礼物)使用LR重组酶(英杰公司)使用制造商的协议生成pEVL415 (Prgef-1:htau40: gfp:: unc-543′UTR)、pEVL538 (Prgef-1:3 potau: gfp:: unc-543′UTR)、pEVL539 (Prgef-1:htau40 (P301S):: gfp:: unc-543′UTR)。
蛋白质比对
的微管结合重复2 n4r人类MAPT蛋白质(NP_001116538.2)一致的微管结合重复PTL-1 (NP_001367354.1)使用Clustalω(西弗斯和希金斯,2021)。序列与已知人类变异注释与所描述的潜在致病性ClinVar数据库(它et al ., 2020)。
结果
野生型τ表达在神经元是耐受性良好
我们理解τ生物学急剧增加,因为它被发现是一个神经原纤维缠结的一部分广告(Grundke-Iqbal et al ., 1986;木头et al ., 1986;Goedert et al ., 1988;Wischik et al ., 1988)。我们现在知道,沿着MAPT突变基因,编码的tau蛋白质,可以引起各种疾病称为tauopathies (罗西和Tagliavini, 2015)。基因突变,或外部因素,可能导致异构τ聚集,产生不同表型光谱(奥克利et al ., 2020;谢尔et al ., 2020;施et al ., 2021)。然而,理解初始的事件导致的频谱τ从单体的过渡到低聚物的较大的骨料,和τ聚合物如何引起疾病的不同机制已被证明具有挑战性的(奥尔et al ., 2017)。
动物模型,模拟方面的阿尔茨海默病(AD)和其他老年相关疾病(ADRDs)理解这些疾病的病因是关键。因此,我们准备建立一个在活的有机体内使用线虫模型来研究τ秀丽隐杆线虫。我们创建了集成转基因动物表达GFP-tagged版本最长的人类τ同种型(hTau40) pan-neuronally使用rgef-1启动子(陈et al ., 2011)(图1一个,B),因为这种启动子在老化有相对稳定的表达式(Adamla Ignatova, 2015)。此外,我们使用τ变异生成类似的动物,要么P301S,这是一个突变与额颞叶痴呆(FTD),常用于研究(Yoshiyama et al ., 2007;竹内et al ., 2011),或者3 po,实验室建设,优化自发聚合(Iliev et al ., 2006)(图1一个)。我们发现,当DNA注入浓度相对较低(5 ng /μl)表达野生型τ是耐受性良好。我们没有观察到任何明显的缺陷在有机体的形态或在开发过程中对生存的影响,相对于动物表达GFP独自在同样的启动子是一种消极控制(evIs111)(数据未显示)。因此,我们这个浓度用于所有剩余实验。
图1。Pan-neuronalτ聚合模型。(一)2的示意图表示n4rτ同种型(hTau40)和本报告中使用的突变。(B)DNA结构的示意图表示注射(创建BioRender.com)。(C)透射光和(C′)荧光表达hTau40GFP一个成年人一天动物的形象。的共焦图像放大(D)腹神经索和(E)尾部区域的动物在野生型hTau40, 3 po(D, E)和P301S(D, E”)表达动物。注意,图像都是取自区域中的散列框所示(C)。(D)我们发现,在腹侧神经hTau40均匀集中在轴突,形成鲜明对比(D′)3 potau集中在细胞体。(D)P301S是类似于野生型τ。(E, E, E”)的尾巴我们观察到类似的结果,通过细胞与τ现在的身体。
我们观察到tauGFP表达整个神经系统的线虫(图1 c”)。在动物表达野生型τ,hTau40GFP似乎很大程度上通过轴突和神经元细胞体(图1 d, E)。P301S变异就像野生型蛋白(图1 d”,E”)。相比之下,3 po变体集中在细胞体,用更少的材料出现在流程(图1 d”,E”)。3 potau的外观和定位是一致的细胞培养研究Iliev et al ., 2006)。基于这些结果,我们得出结论,我们可以观察τ内定位秀丽隐杆线虫神经元。
衰老与聚合TauGFP分布和外观变化
老化是广告的主要风险因素和ADRDs,所以我们监控在tauGFP衰老变化。我们成像神经元位于动物的尾巴天一,三,五,七成人(图2)。这一地区提供了一个一致的和良好定义的位置和避免潜在的肠道自发荧光背景的影响,这自然随着年龄的增加和压力。定量荧光通过图像分析,我们发现离散年龄相关性变化tauGFP本地化和数量是不同的,这取决于τ变体表达(图3)。定性,hTau40GFP的模式很大程度上是相同的在成年后的第一个星期展示本地化细胞体和轴突。GFP强度没有明显差异在hTau40-expressing动物年龄的函数在成年后的第一个星期图3)。
图2。年龄相关性tauGFP积累。我们监控TauGFP在衰老的动物。在成年后的前7天,观察hTau40GFP细胞体内(箭头)和轴突的过程(箭头)一直在衰老。与野生型相比我们注意到P301SGFP似乎丰富的轴突(箭头),以减少在衰老细胞荧光(箭头)。3 pogfp优先积累在细胞体内(箭头),用更少的荧光在神经过程(箭头)。此外,τ动物细胞体内表达3 pogfp似乎比动物更集中表达野生型或P301Sτ。酒吧= 10μm规模。
图3。TauGFP稳定,积累在神经元和轴突的年龄相关性的方式。第一天线虫菌株也有类似的GFP强度表明τ要素有相同程度的表达式。白天3 (P301S)和第五天(3 po)荧光明显增加,分别显示的重要积累τhTau40统计上保持稳定时所选的时间点。方差分析(天*变体)与图基因果比较。N= 12 - 15。
接下来,当我们检查疾病相关变异的变化,P301SGFP,我们观察到一个不同的模式。虽然GFP的分布在第一天似乎细胞体和过程之间的大致相等,动物们随着年龄的增大,我们注意到一个定性浓缩的过程和一个相对损耗在细胞体,hTau40GFP没有观察到的模式(图2)。当我们量化总荧光,荧光观察到显著增加第三天(图3)。因此,我们得出这样的结论:P301S变体优先局部神经过程,而细胞体。增加的强度随着时间的推移,表明它可能更稳定在活的有机体内相比hTau40 (图3)。3 pogfp动物衰老期间我们也观察到荧光强度的增加,蛋白质主要集中在细胞体。从这些研究我们得出结论,与野生型相比τ,P301S和3 po都可以积累显著在活的有机体内在老化,虽然变异似乎是分布在不同的细胞。
P301S和3 poτ不溶性聚合物在形式的洗衣粉秀丽隐杆线虫神经元
先前的工作表明,τ总量秀丽隐杆线虫可以通过串行生化特征提取(Kraemer et al ., 2003)。我们从τ转基因动物,孤立的蛋白质或non-tau控制(evIs111),在一个和三个成年和使用串行提取(材料和方法)的聚集状态(图4)。简而言之,我们分离蛋白质可溶性(RAB缓冲区),洗涤剂可溶性(里帕缓冲区)或洗涤剂不可溶性(尿素)提取阶段,然后进行sds - page和西方的屁股。
图4。系列生化提取聚合τ。蛋白质提取表示基因型和转基因动物的天,然后进行一系列的提取步骤收集可溶性(通道1和2),洗涤剂可溶性(车道3和4)和尿素溶性(车道5和6)分数。分数被sds - page分离和检测使用τ抗体和化学发光。存在尿素τ的分数(红色箭头)是指示性的聚合形成。我们发现τ存在于这个分数3 po表达行成年的第一天和第三天P301S表达。摘录的右下角是一个污点第一天显示控制蛋白质的基因型的动物,微管蛋白,证明等于加载。
我们发现,正如预期的分离蛋白从我们non-tau动物没有免疫反应性τ抗体在免疫印迹。hTau40,野生型蛋白是存在于可溶性或洗涤剂溶解阶段,没有蛋白质检测Urea-extracted分数。相比之下,3 po蛋白被发现在所有三个阶段,早在第一天的成年。为P301S线,有趣的是,我们发现在第一天发现蛋白质只有在可溶性和洗涤剂可溶性分数。然而,我们发现P301Sτdetergent-insoluble分数从一天三个成年人。基于这种模式,我们得出的结论是,P301Sτ是形成detergent-insoluble总量秀丽隐杆线虫,尽管比3 po缓慢。我们也可以得出这样的结论:3 po蛋白质更积极地聚合,预计将从以前的生化分析(Iliev et al ., 2006)。
表达人类τaggregation-prone减少寿命
确定我们的τ表情纹影响到我们所测量到的生物有机体的寿命。其他几个tauopathy线虫模型表明,τ的表达可以使用寿命不利读出(Kraemer et al ., 2003;Pir et al ., 2016)。这表明,寿命分析可以提供信息,帮助我们评估线虫健寿恶化。
我们镀age-synchronized线虫和一群50(每复制)L4上演动物(0)天。然后我们继续每天计算现存动物的数量(见材料与方法),直到所有死了(图5)。我们发现50%的hTau40和P301S动物死于14天,这两种明显不同于没有τ控制。相比之下,50%的3 po动物已经死了十天,证明减少寿命(图5)。我们观察到的动物数量急剧下降在第七天,这与3 pogfp水平的显著增加5天图3)。有趣的是,P301S疾病相关变异,不明显导致寿命减少,独自hTau40或GFP相比,尽管增加积累。这些认为积累,本身并不足以影响寿命,但pro-aggregation变体(τ)会影响生物的生存。
图5。表达突变τ的神经系统引起过早的杀伤力。一群动物表达GFP, hTau40GFP P301SGFP或3 pogfp统计每日为生存。我们确定一天50%的人口生存(LD50)。3 po动物展览∼8天的LD50, P301S∼∼12天11天,WTτ(3 po是明显不同于GFP,p< 0.001,生存率较)。每一行代表2 - 5独立的实验。
Aggregation-proneτ诱发运动的变化
的秀丽隐杆线虫运动系统依赖于交替兴奋性和抑制性motorneurons引起肌肉收缩或放松,导致正弦爬行行为(甄撒母耳,2015年)。向前和向后运动都是由不同种类的motorneurons控制的,而行为可以由感官事件。因此,评估运动是一种检查的整体功能秀丽隐杆线虫神经系统。我们收购了电影的转基因动物爬行NGM板(见材料与方法),分析了这些使用追踪软件(WormLab)。最明显的模式出现,3 po动物活跃,没有τ控制相比,hTau40或P301S动物,成年的第一天,但他们的运动逐渐减少,每天测试(图6)。从这些分析我们得出结论,τ的3 po版的表达影响神经功能的早期成年。
图6。表达突变τ影响运动。动物运动性收购视频显微镜使用跟踪和分析软件(WormLab)。运动的速度量化时,3 po动物表现出极度活跃的行为在第一天,但运动逐步放缓的动物。移动速度是策划,蓝色透明条指示的范围控制动物的平均速度evIs111从测量的所有天。第一天3 po动物明显不同于所有其他的线在每一天p< 0.001)。N为每个转基因在每一天= 10。
人类τ变异的表现有所不同秀丽隐杆线虫直接同源的τ,ptl-1,突变体的背景
τ是microtubule-associated蛋白与微管蛋白结合,并提供微管稳定性(Kadavath et al ., 2015;巴比尔et al ., 2019)。因此,我们问是否有表达人类τ和之间的交互秀丽隐杆线虫τ直接同源ptl-1。先前的报道表明,人类τ可以拯救一些,但不是全部,表型的观察ptl-1突变体(咀嚼et al ., 2013)。
我们越过tauGFP菌株进入ptl-1 (ok621)背景。的ok621突变是一个删除,删除的大部分ptl-1编码区,突变报道加速神经元衰老的发生(戈登et al ., 2008;咀嚼et al ., 2013)。
我们再次测量的总像素强度tauGFP尾巴(图7)。就像野生动物一样,hTau40水平保持相对一致的观察时间。有趣的是,在动物缺乏ptl-1P301S变体没有显示与老化增加积累。相反,随着时间的推移保持相对稳定的水平。定性,hTau40GFP P301SGFP保持局部的神经元和轴突ptl-1突变的动物。因此,我们假设的轴突积累P301S是依赖于内源性ptl-1,或者没有ptl-1有间隙的补偿机制,促进P301S蛋白质。我们继续观察3 potau当的重要积累ptl-1缺席(第一天和第三天吗p< 0.0077,第一天和第五天p< 0.00001,第一天和第七天p< 0.0004;双向方差分析与校正图基)。总的来说,这提供了进一步的证据的积累的差异蛋白变体,P301S受到的损失ptl-1,但3 po少。
图7。TauGFP变体ptl-1突变体中积累。(一)。的ok621突变的积累减少P301SGFP发生在野生型的背景,而不是增加3 pogfp的稳定。方差分析(天*变体)与图基因果比较。N为每个示例= 10。(B)。代表GFP积累的图片ptl-1突变体在一个和7个。
ptl-1保护动物免受tau3PO效果
我们重复的寿命试验ptl-1突变体的背景。没有野生型或寿命的差异ptl-1 (ok621)动物表达GFP单独控制(p= 0.18)(图8)。在ptl-1背景我们观察到减少寿命由于hTau40GFP (p< 0.001)和3 pogfp动物(p< 0.001),而P301SGFP寿命没有不同ptl-1独自一人(图8)。目前尚不清楚为什么野生型人类τ的表达ptl-1背景突变是有害的,而P301S不是。然而,观察的ptl-1;3 potau动物死亡更快比3 po的表达野生型的背景暗示τ直接同源的存在有利于生物的生存。
图8。人类τ寿命ptl-1突变体的表达。动物为了生存每天监测。所有的线条表达突变τ过早死亡,相比ptl-1 (ok621)单突变体(生存率较)。我们决定LD50如下:3 pogfp;ptl-1P301SGFP∼5天;ptl-1hTau40GF∼15天;ptl-1∼12天ptl-1 (ok621)∼13天。曲线代表4独立进行实验。
τ采用aggregation-prone构象TNT1探测到
最后,以确定τ积累观察到的是与人类疾病相关的我们染色转基因线使用优先的抗体结合构象变化τ与τ聚合(TNT1) (梳子et al ., 2017)和抗体识别一般τ(A0021-A)。我们量化TNT1强度比总τ强度的腹神经索动物衰老期间(图9)。我们没有看到染色-控制(evIs111,单独GFP),这表明染色是特定于tau-expression线。我们发现TNT1 /总τ的比率没有显著不同的动物表达hTau40之间或P301S 1天,但有一个更高的比例TNT1染色的动物表达3 po变体。随着老化的进行聚合比总τ稳定hTau40线,但是一直高于3 poτ。第七天,我们发现了一个显著增加TNT1 P301S表达动物的免疫反应性。因此,我们得出结论,τ的一些物种的形态形成的线虫是这样形成的人类疾病早期老化过程和聚合τ的比率增加动物表达3 po或P301S。
图9。TNT1染色表明τ可以采用disease-relevant构象秀丽隐杆线虫我们使用了TNT1抗体和A002401抗体染色动物早期疾病的构象总量相比总τ。(一)第一天成年动物沾TNT1(红色)和总τ(绿色)抗体。(B)我们量化的染色天,三,七成人(N每天= 10 /基因型),推导TNT1 /τ总额的比率。致病性的3 po线有较高比率比hTau40或P301Sτ,这在第一天没有显著不同。通过第七天TNT1免疫反应性显著增加在P301S动物相比hTau40(方差分析,图基事后比较,p< 0.05)。
讨论
gfp-tagged野生型τ允许可视化的表达与年龄有关的变化
在活的有机体内动物模型是非常宝贵的对于理解神经退行性如阿尔茨海默病及相关疾病。在脊椎动物模型有明显的效用的神经元的复杂性和基因与人类的关系,有一些缺点使用无脊椎动物模型可以更好地解决。例如,它更容易创造新的转基因动物,一般来说,表型发展更快。也简单交叉这些转基因动物感兴趣的基因突变在被隔离在一个共同的遗传背景,从而减少潜在的混淆的遗传变异表型观察。
解决一些无脊椎动物小说的潜力模型我们依赖的事实秀丽隐杆线虫是光学透明的整个生命周期,使我们能够想象τ在活的动物。重要的是,我们观察到野生型τ(hTau40),同时动物的DNA浓度我们注入创建转基因。这与其他秀丽隐杆线虫tauopathy模型表达的野生型τ对生存有负面影响(Kraemer et al ., 2003)。一个区别可以使用1 n4r同种型研究,而在这里我们使用了2 n4r同种型。然而,表达水平的鉴定野生型τ的非病理性允许我们观察τ的“正常”的行为在一个生物的神经系统在衰老。
我们注意积累一些差异在神经元的腹神经索和尾巴,更多的观察tauGFP在细胞体内。有两种可能的解释这种差异。首先,腹神经索主要是运动神经元细胞,而神经元中观察到尾感官或中间神经元,因此,有可能是τ积累各种类不同的神经元。第二,神经元的形态是不同的,在尾巴的神经元胞体”之间的“轴突和树突隔间,而运动神经元细胞体,有点侧神经索的过程(白色et al ., 1976,1986年)。因此,观察到的差异可能是更多的形态的结果。未来实验限制的一个子集的神经元τ应该使我们能够更好的区分哪一个更有可能。
有趣的是,在成年后的前7天(大约有1/3到1/2的动物的寿命)我们做观察一些野生型τGFP的强度的差异在不同的细胞。虽然这可能只是一个差异表达的产物,这还表明,一些神经元更容易tauGFP积累,之前已经报道过了。在两个不同的研究使用老鼠,似乎gaba ergic神经元更容易积累神经原纤维缠结(非功能性测试)和显示赤字活动(Andrews-Zwilling et al ., 2010;Levenga et al ., 2013;Najm et al ., 2020)。
最后,重要的是要注意,我们所做的观察与抗体免疫反应性,优先检测从人类疾病相关τ的构象事后组织(TNT1)。因此,即使是在几天后的短时间内,我们发现的秀丽隐杆线虫神经系统,τ采用构象与人类疾病相似。我们接着提取τ从转基因动物使用越来越严格的缓冲区。我们发现的证据只detergent-insolubleτ3 po和老P301S动物,但不是hTau40。因此,至少一些TNT1染色在这些动物是表明一种可溶性的τ。有越来越多的证据表明,在这个领域更大的聚集可能保护和较小的低聚物的物种更致病,因此它是有趣的,我们观察τ物种被TNT1似乎可溶性。
τ变体可以不同于野生型
我们评估两种不同τ变异,一个P301S突变,是一种疾病相关变异与多个tauopathies在人类,包括额颞叶痴呆(FTD) corticobasal变性(CBD),和进行性核上的麻痹(PSP) (Bugiani et al ., 1999;Kametani et al ., 2020)。第二,3 po,已经使用在体外和在活的有机体内模型快速聚合的τ版本不需要启动聚合诱导物分子。
我们观察到的结果之一是,在大多数情况下,表现得像野生型P301S变体τ在我们的模型中,有一些明显的差异。像野生型τ,良好的对寿命的影响,有机的能动性。
与野生型tau蛋白质,P301SGFP似乎更稳定,增加强度在我们观察的时间框架,在神经过程优先积累,第三天可以聚合成detergent-insoluble物种的成年。一些τ突变体,包括P301L变体可以抵抗细胞退化,独立的能力总(卡巴雷若et al ., 2018)。有趣的是,观察P301S稳定性依赖于内生增长秀丽隐杆线虫地图,PTL-1。这是否表示实体之间的交互P301S PTL-1,或者还有其他补偿的变化ptl-1突变体,从积累降低P301S需要进一步研究。
正如人们预期的那样,我们观察到显著不同的结果使用迅速聚合变体。首先,我们确认3 po蛋白质生化反应形成聚合,这TNT1 3 po-expressing动物的免疫反应性增加。3 potau更集中在细胞体,甚至在神经过程出现不同于P301S或野生型。这些与以前的工作相一致在体外记录的各种聚合形成的3 po P301相比,突变体(梳子和Gamblin, 2012;Mutreja et al ., 2019)。动物表达3 potau死早于预期,生物的寿命的下降是在我们开始看到整体tau蛋白质含量的增加,这与其他线虫tauopathy模型一致的表达增加τ或τ变异越来越不利于动物。我们观察到3 po和损失之间的交互ptl-1,和其他人之前报道之间的交互(ΔK280)和另一个快速聚合的变体ptl-1(Ko et al ., 2020)。
为什么P301S变体不是特别病理在我们的模型中,考虑到其他τ变体,包括oft-studied P301L已被证明产生表型?有可能P301S花费的时间积聚在一个病态的形式,我们不能观察到的秀丽隐杆线虫生命周期(2 - 3周)。也有同种型差异聚集属性(Mutreja et al ., 2019)。因此,这将是有趣的研究在我们的系统,问0或1 n亚型P301残渣突变时表现不同。
另一个可能性是丝氨酸替代更好地容忍秀丽隐杆线虫神经元。突变是在第二微管结合重复。在那些重复有一个高度保守的P-G-G-G-X主题,预计使MTBRs折叠。在大多数哺乳动物τ蛋白,P是不变的。相反,当从PTL-1 MTBRs蛋白质和人类τ是一致的脯氨酸残基是丙氨酸和脯氨酸(图10)。因此,它是可能的,这个位置的环境里面有更大的灵活性秀丽隐杆线虫神经元。最后,可能是神经元内的位置,我们观察蛋白质积累(细胞体和流程)可能是相关的。
图10。排列的微管结合重复(MTBR)从人类τ和C。eleganPTL-1。域是相互一致的使用Clustalω,编号从hTau40。轮廓的红框位置P301S P301突变的线条和黑匣子大纲残留修改的3 po变体。低于特定的氨基酸是地区,已确定在人群中,和致病性的颜色代码。
从以前的工作在我们的结果有差异研究τ聚合秀丽隐杆线虫。为主,我们没有看到任何明显的细胞死亡的动物,至少在我们专注的时间框架。这与最近的一项研究中,作者使用了单份敲入的方法研究τ翻译修饰的影响效果在活的有机体内(古et al ., 2020)。其他tauopathy模型使用表达τ注意到神经变性的情况下(Miyasaka et al ., 2005;Kraemer Schellenberg, 2007)。有不同的亚型在这些研究中,使用的激励进行更彻底的调查同种型tau-induced表型的差异。
对非聚合τ影响生存的聚合
GFP荧光显示,τ的量化水平正在维护。因为的活动rgef-1启动子是恒定在成年的阶段分析,最简单的解释为τ的稳定水平的荧光被生产和翻以恒定速率。P301S和3 po我们观察荧光在年龄相关性的方式,增加符合减少删除这些蛋白质的能力。然而,只有3 potau结果对寿命的影响。有更多TNT1染色在动物表达3 po,建议更多的总蛋白是在一个病态的构象,一致的一代作为一种积极pro-aggregating形式τ(Iliev et al ., 2006)。从这一点,我们假设有一个阈值τ总量开始影响生物的健康。这些结果表明,像许多其他的研究则认为,tau-aggregates浓度必须维护细胞毒性,和更高的浓度τ沉积导致恶化的表型(西蒙et al ., 2012;Shigemoto et al ., 2018)。只是这个门槛是否依赖聚合,或聚合的本地化,甚至其他细胞因素还有待确定。
地图蛋白质可以防止聚合τ的影响
PTL-1是秀丽隐杆线虫直接同源的人类τ和其他地图;它与微管蛋白结合,提供细胞骨架支持神经元和轴突(戈登et al ., 2008;咀嚼et al ., 2013)。我们发现突变消融ptl-1函数有多个交互与τ表情纹。其中最重要的似乎是,损失的ptl-1导致了生物的寿命明显降低动物表达3 potau,暗示PTL-1保护动物从聚合τ的后果。与这种效果一致,我们发现减少的能力积累在轴突P301S变体ptl-1被删除。
总的来说,我们已经证明,添加GFP一半τ可以帮助可视化τ在一个活的有机体。我们目前的结果表明,聚合,局限于神经过程可能会容忍比当它主要是躯体。使用这个系统,我们可以开始测试遗传或环境风险因素,试图关联聚合的位置和速度的改变生物的寿命。最终,由于该系统的简单性和速度的表型出现,此模型可用于解决许多tauopathies领域的开放问题。
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数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
作者的贡献
研究概念:英航和TG、实验程序:佤邦,公元前和英航;数据分析:WN和英航;手稿准备和编辑:WN,公元前,TG,英航。
资金
资金是由美国国立卫生研究院提供T32 GM132061和T32 GM00854 (WAN) P20GM103418 (BDA)和KU阿尔茨海默病中心(BDA)。
确认
我们想感谢伦德奎斯特实验室和思想讨论量化τ水平通过荧光显微镜。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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关键词:秀丽隐杆线虫τtauopathy,微管相关蛋白,神经元衰老
引用:阿基诺Nunez W,梳子B, Gamblin TC和Ackley BD(2022)年龄相关性积累τ聚合秀丽隐杆线虫。前面。老化3:928574。doi: 10.3389 / fragi.2022.928574
收到:2022年4月25日;接受:2022年7月25日;
发表:2022年8月19日。
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