转录组和代谢组学研究氢分子的保护作用与核电磁pulse-induced脑损伤

背景

近几十年来,通讯科学的迅速发展,electromagnetic-based技术已广泛应用于人类生产活动和日常生活的各个领域。大量的研究报道,电磁辐射(EMR)已成为现代文明的一个重要污染源,不应该忽视(1)。由于长时间的使用手机,手机对大脑的物理距离的沟通,以及在手机的电磁强度大幅度增加沟通,大脑接触到EMR比其他器官。流行病学和实验室研究表明暴露于电磁场会导致失眠、头痛、耳鸣、疲劳、认知障碍、感觉异常、眩晕和焦虑(2- - - - - -4)。此外,国际癌症研究机构(IARC)分类射频电磁场(30千赫−300 GHz)作为一个潜在的人类致癌物(2 b组)在2011年(5)。因此,有害的EMR对人类大脑的影响更值得关注。

电磁脉冲(EMP)是一种特殊类型的电磁场,及其波形是一个短,高压脉冲波和快速上升时间和带宽从0赫兹到1.5 GHz。中枢神经系统容易EMP exposure-induced受伤。暴露在电磁脉冲对鼠大脑微血管通透性增加,从而导致白蛋白增加渗透到大脑(6)。NEMP是emp首次观察到的一个子集的即时核爆炸。强场的特点,作用时间短,范围广泛,操作范围宽。NEMP可以麻痹电子设备和通信设备在短时间内,展示巨大的军事应用价值。与其他员工相比,NEMP具有更高的电压值,会导致更严重的脑损伤。NEMP目前研究主要集中在其破坏性影响电子设备和防护设备,而对健康的潜在威胁的生物很少报道。

考虑到EMR暴露对人体的负面影响,尤其是中枢神经系统,迫在眉睫的是开发安全有效的EMR保护剂。氢分子,作为一种新型的抗氧化剂,可以选择性地清除羟基自由基,是无毒的,可以轻易地穿透生物膜。研究表明,氢分子可以发挥保护作用等各种条件的缺血/再灌注损伤、器官移植、代谢综合征、炎症和急性辐射疾病(7- - - - - -9)。它也报告说,H₂可以缓解神经紊乱引起的氧化应激和神经炎症(10)。在pre-experimental阶段,我们筛选潜在的生物保护剂EMR引起中枢神经系统损害。有趣的是,H₂展示一个戏剧性的保护作用(11)。

在这项研究中,我们调查的影响NEMP暴露在老鼠大脑和氢分子的保护作用。此外,我们利用转录组和代谢组学分析底层机制。

方法

动物和分组

雄性野生型Sprague-Dawley (SD)大鼠(8周大,体重200 - 220克)是来自中国科学院上海实验动物中心和维护在第23 - 25°C与12 h光/暗周期。在实验之前,老鼠被安置了1星期适应新环境。生活条件和协议都是批准的海军医科大学动物福利和伦理委员会按照指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院出版(96 - 01)。这些老鼠被随机分为4组:对照组、H₂组,NEMP组,NEMP + H₂组。

氢分子治疗和NEMP曝光

确保氢水处理的稳定性和均匀性,我们采用了氢产生的新鲜水(HRW),它是用一个自动“氢水发生器”(高浓度HRW生成器,gl - 110 pw深圳智能水科技有限公司,广东,中国)每次使用前,喂老鼠,因为我们之前进行的(11)。总之,发电机的坦克充满了热压处理过的饮用水,然后经过氢生成过程。十分钟后,HRW准备的测试浓度与微电极(Unisense,奥尔胡斯N、丹麦)和动物治疗。训练老鼠喝富氢水,老鼠被喂食与间歇饮用水1星期,和水只有在8 - 10,12 - 14和16点钟每天。H₂组和NEMP + H₂组有富氢水饱和,而对照组和NEMP集团有普通热压处理过的饮用水。供水时间是8 - 10,12 - 14,16点钟每天图1)。氢分子治疗持续了3天前NEMP暴露在牺牲的日子(图2一个,B)。

NEMP曝光系统中使用本研究开发和测试的生物物理学,华东师范大学,上海,中国。系统由一个电压控制系统(控制平台、升压变压器、脉冲电容器),气压控制系统(高纯氮气、空气阀、气压计),辐射室和脉冲探测系统(分压器,同轴电缆,示波器)。辐射暴露之前,高纯度的氮气脉冲电容器是由空气压力控制阀和气压计,以及两个板块之间的电压的电容增加了升压变压器。当电压达到一定值时,氮气被分解,生成和电子脉冲之间的金属铅板与电容,它传播的辐射室。NEMP减毒的阻力来防止反射的形成。在这个实验中,一个示波器连接到取样电阻上的辐照室是用来检测波形(前沿20 ns和脉冲宽度200 ns,图2 c)。整个身体的每个老鼠被暴露在200脉冲电磁场强度400千伏/米,和他们的直肠温度一直被监视,发现高小于0.3°C的曝光,根据先前的报道(12,13)。

高+迷宫

按照项目进行评价焦虑行为基于啮齿动物的天生的厌恶和提升地区开放。EPM装置由两个封闭的手臂和两个张开双臂,丙烯材料和放置在离地面的高度50厘米。老鼠在关闭移动武器由于他们喜欢黑暗,但他们将再次活跃在开放臂的好奇心和求知欲。当面对新奇刺激,老鼠发展探索的冲动和恐惧,导致冲突的勘探和回避的行为,导致焦虑。按照项目被认为是一个经典的实验评估焦虑和压力的研究。在每个测试的开始,老鼠被放置在中央区域开放面临的胳膊,允许自由探索10分钟。动物被捕获的运动与数码相机和分析软件(移动数据信息技术有限公司,上海,中国)。总条目到手臂,张开双臂距离的百分比,并张开双臂的百分比停留时间进行了分析。迷宫是每个测试前用酒精清洗解决方案。每组包含10个老鼠。

开放的现场试验

OFT通常用于评估自主行为,探索行为和紧张的实验动物小说和不同的环境。小说中某些行为的频率和持续时间的环境被用来应对老鼠的自治和探索性行为在陌生的环境中,尿液和粪便的数量被用来回应他们的紧张。公平贸易局装置是由一个黑色的木盒子(100×100×35厘米)和一个黑色的地板上。老鼠被放置在仪器的中心在昏暗的灯光和6分钟的路程是由计算机控制的跟踪监控系统(移动数据信息技术有限公司,上海,中国)。总距离,距离在中心地区,中部地区和时间测量评价焦虑的水平。每个测试后,仪器与酒精溶液清洗。每组包含10个老鼠。

苏木精和伊红染色和尼氏小

完成动物行为学实验后,老鼠牺牲NEMP接触后7日内进行组织学检查。在动物终止过程中,老鼠麻醉组织灌注,然后安乐死组织托收。缓解疼痛诱导麻醉的注入,老鼠首先受到的吸入异氟烷氧(5%)诱导快速无意识的后腹腔内注射戊巴比妥钠(9.1毫克/毫升,80毫克/公斤)。直到没有反应大鼠脚捏,做了心脏灌注(从左心室和液体喷射特征,通过右心房)是由生理盐水(0.9%,250毫升40毫升/分钟)和多聚甲醛(4%,500毫升,20毫升/分钟),按顺序。脑组织灌注过程完成时,收获了之后实验)和尼氏小染色等。考虑两个脑半球之间的同质性的损害大脑NEMP曝光,我们只在大脑右半脑进行组织病理学研究。每个老鼠的右大脑半球是解剖,与4%多聚甲醛固定至少24小时,然后用梯度乙醇脱水系列。随后,嵌入在石蜡标本,切成4μm厚片。切片染色在他走时染色工作方案和尼氏小染色工作方案,分别。那片光学显微镜下观察和拍照。 Each group contained four rats.

转录组分析

均质化后,老鼠大脑的总RNA提取和纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。接下来,使用TruSeq互补脱氧核糖核酸数据库建立^®困总RNA样品制备设备(Illumina公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)根据制造商的指示。随后,测序进行Illumina公司HiSeq 2000系统(Illumina公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。差异表达基因(度)选择使用过滤标准如下:p< 0.05和褶皱变化> 2。每组包含八个老鼠。

代谢组学分析

使用超高液相色谱法分析了样本(1290无穷LC,安捷伦科技,圣克拉拉,加利福尼亚,美国)耦合四极飞行时间系统(AB Sciex TripleTOF 6600年Sciex,红木市,加利福尼亚,美国)。代谢物被确定通过比较它们的质量光谱建立了一个内部数据库使用可用的真实标准(上海应用蛋白质技术有限公司、上海、中国)。单变量分析,排除代谢产物达到一定的标准的foldchange >或< 0.67和1.5p< 0.05 (补充图1)。随后,主成分分析(PCA),偏最小二乘判别分析(PLS-DA) PLS-DA置换试验,正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和OPLS-DA排列测试进行(补充图2- - - - - -7)。OPLS-DA模型变量重要性每个代谢物投影(VIP)值的计算。显著差异代谢物(DM)选择使用过滤标准如下:p< 0.05和VIP值> 1。每组包含八个老鼠。

转录组分析和代谢组学分析相结合的分析方法

差异表达基因和代谢产物都映射到京都基因和基因组的百科全书(KEGG,http://www.kegg.jp/)途径根据在线富集分析。随后,维恩图和直方图绘制结合KEGG注释和浓缩两组学的结果。

统计分析

所有数据提出了平均数±标准差和使用SPSS 22.0软件进行统计分析(美国芝加哥SPSS Inc .)。GraphPad棱镜8软件(美国加州GraphPad软件有限公司)是用来制作图表。两组数据之间的统计学意义,按照正态分布是由学生的决定T以及。时被认为是具有统计学意义的差异p< 0.05。

结果

焦虑的行为

大鼠的焦虑行为被EPM和经常评估。EPM结果显示无显著差异在条目的总数成四组之间的手臂,表示没有改变NEMP曝光后在大鼠运动活动和/或H₂治疗(图3 b)。距离的百分比在张开双臂,张开双臂停留时间的百分比显著降低NEMP组与对照组相比图3一,C,D)。有趣的是,距离的百分比在张开双臂,张开双臂停留时间的百分比显著增加NEMP + H₂集团与NEMP集团(图3一,C,D)。这些结果表明,NEMP接触可以增加动物的焦虑行为,减毒的H₂。

此外,我们发现了一个显著差异总距离和距离之间的中心地区常对照组和NEMP集团(图3 e- - - - - -H),这表明NEMP暴露可能诱发焦虑行为。然而,NEMP + H₂组显示趋势的旅行距离中心地区的OFT (图3 g),这表明焦虑行为被H温和改善₂。

组织学变化

在目前的研究中,海马和杏仁核光显微分析的目标。作为主要组织染色用于组织病理学,我们使用圆)研究病变细胞核和细胞质内含物的海马和杏仁核神经元。通过圆)染色和尼氏小染色图4NEMP暴露导致显著病变大鼠海马和杏仁核神经元在延迟阶段后接触NEMP曝光后(7天):细胞肿胀,细胞间隙明显,形态变化(从圆形和椭圆形、三角形),深层细胞染色,模糊的细胞核和细胞质。值得注意的是,海马神经元的病理变化在老鼠的脑组织NEMP + H₂组明显小于NEMP集团和病态神经元细胞的比例显著降低。同样,更多的异常的神经元细胞中发现了老鼠的杏仁核NEMP集团和H₂显著降低异常细胞的比例(补充图8)。根据我们的低倍镜下观察,大多数在整个海马和杏仁核神经元NEMP曝光后经历了类似的变化,中和的H₂。没有显著差异在胶质细胞和血管的形态在这些四组中,表明神经元对NEMP暴露更敏感。

转录组分析

热图和火山地块被用来显示基因表达谱的变化(补充图9,10)。结果表明,有178上调和502 H的衰减度₂集团77年差异度和166年衰减度NEMP组与对照组相比。与此同时,H₂调节209个基因的表达和表达下调403个基因的表达在老鼠大脑NEMP曝光。

随后,通路富集分析每组的度,和前30名与统计学意义所示图5。结果表明,在三个主要方面去[生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组件(CC)、英国石油(BP)显然是丰富(绿色列)。英国石油公司由H₂治疗仅包括行为、离子运输、安非他命,发展过程,等。英国石油公司方面造成NEMP接触仅包括基因丝组装、微管束形成,微管细胞骨架组织,microtubule-based过程等。BP在NEMP条款改变+ H₂组相比,NEMP组包含多细胞有机体的监管过程中,解剖结构形态发生,多细胞生物开发、系统开发等。

代谢组学分析

微分代谢物中列出表1和补充表1。与对照组相比,6代谢物被抑制(L-Fucose, 2-Methylglutaric酸,cis-Aconitate、次黄嘌呤尿嘧啶,和L-Glutamate)和4代谢物(2-Amino-2-methyl-1、探索1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,鞘氨醇,和泛酰硫氢乙胺)上调了H₂组。与对照组相比,16个代谢物被抑制(磷霉素、Allocystathionine腺嘌呤,组氨酸,Argininosuccinic酸,Isopentenyladenosine, Glycerophosphocholine,环己胺,L-Fucose, 2-Methylglutaric酸,L-Leucine,尿嘧啶、泛酰硫氢乙胺,L-Phenylalanine,多巴胺,和D-Proline)和3代谢物(十七酸、鞘氨醇1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)上调了H₂组。只有一个代谢物D-Arabinono-1, 4-lactone升高NEMP + H₂组相比NEMP组。

转录组和代谢组学结合KEGG途径分析

随后,结合KEGG通路度分析和微分代谢物进行获取更详细的信息的影响NEMP曝光和H₂治疗大鼠的脑组织的代谢途径。维恩图分析了KEGG途径丰富通过转录组和代谢组学,和他们的十字路口是进一步丰富(由于小数量的差异代谢物组的一些比较,KEGG通路的选择确定代谢物)。

所示图6,改变KEGG通路引起的H₂单独治疗中的主要包括刺激神经组织的互动,突触囊泡循环,(多巴胺、胆碱能和glutamatergic)突触,信号通路,药物成瘾,等等。与对照组相比,只有一个代谢途径丰富NEMP组,和几乎无关紧要(图7)。KEGG通路改变在NEMP + H₂组相比,NEMP组中的包含刺激神经组织的互动,突触囊泡循环,磷脂酶D信号通路,血管平滑肌收缩,glycerophospholipid新陈代谢,胆碱能突触等等。图8)。

有趣的是,谷胱甘肽代谢途径明显丰富时比较KEGG H之间的通路₂组和NEMP集团(图9)。

谷胱甘肽代谢途径分析

谷胱甘肽是最重要的活性代谢物自然地存在于细胞具有抗氧化作用。谷胱甘肽可用于减少形式(谷胱甘肽,谷胱甘肽)和氧化形式(二硫化谷胱甘肽(GSSG),以及谷胱甘肽还原酶催化两种形式之间的互变现象,以及这种酶的辅酶还提供了NADPH磷酸戊糖旁路代谢(图10)。

这项研究的结果表明,中谷胱甘肽水平没有区别四组。然而,它可以观察到:GSSG降低氢分子治疗后,GSSG NEMP曝光后升高,GSSG减少NEMP + H₂组相比NEMP组(n= 8,没有差异在统计学上没有显著意义由于大集团内的色散)。类似的趋势也观察辅酶ii的水平。同时,Gpx3,谷胱甘肽氧化酶,独自氢气治疗后显著降低(P< 0.05)。

讨论

越来越多的研究表明EMR可以对人类产生负面影响,其中大脑是最脆弱的器官之一(1,14- - - - - -16)。据报道的文献EMR造成的损害与线粒体损伤和氧化还原平衡(17)。与此同时,补充一些抗氧化剂或抗自由基,如维生素E和褪黑素,表现出保护作用在特定的人口从EMR (18)。氢分子、自由基清除剂,还演示了抗氧化、抗凋亡和电离辐射damage-protective效果。在目前的研究中,我们建立一个保护作用的氢分子反对NEMP exposure-induced进行动物行为学实验和组织病理学的影响实验。采用机械化、转录组和代谢组学解码潜在的保护机制。

流行病学研究提供了丰富的证据表明,电磁场的手机,手机基站和无线设备都有类似的不良神经影响人类,和一些研究展示了一个明确的电磁强度和剂量反应关系健康问题(19)。最常见的障碍或疾病引起的电磁场包括失眠、头痛、抑郁、疲劳、感觉迟钝,注意力不集中,记忆变化,头晕、易怒、食欲不振、焦虑、恶心、皮肤燃烧(或刺痛)和脑电图的变化。动物行为学实验的结果表明,NEMP暴露诱导大鼠焦虑状态,就是明证减少居住时间和旅行距离张开双臂在EPM实验中,可以解释为一个更大的老鼠不愿涉足高风险活动。此外,选择实验的结果还表明,NEMP暴露导致更少的自治和探索性行为的老鼠。重要的是,我们的结果表明,H₂有保护作用对焦虑行为引起的大鼠NEMP曝光。动物行为实验的结果与EMR通常是令人困惑和矛盾,主要是因为EMR对大脑的影响其类型、强度、频率和持续时间的接触。不同的参数可能导致相反的结论。它已经表明,长期接触极低频率电磁场pro-anxiety在老鼠和氧化压力效应(20.)。Zhang et al。(2)研究了1.8 GHz射频场对小鼠行为的影响,发现了类似的现象。相比之下,Qubty et al。(21)没有发现焦虑行为差异的EPM实验小鼠暴露于射频EMR。值得一提的是,在我们之前的研究中,我们发现EMR的负面影响接触迅速衰减随时间(11),只有非常严重(一天后暴露)潜在的生物分子变化决定利用转录组,代谢组学和行为方式解剖NEMP引起的潜在的分子改变和/或H₂曝光。

海马体是空间和时间的地方人类观念相互交织与内存(22)。和海马体被认为是一个脆弱的大脑区域EMR诱导损伤(23)。接触900/1,800 MHz射频电磁波报道导致氧化损伤小鼠的海马(24)。大脑杏仁核是一个关键的调节行为和动机调节开关之间的探索性和non-exploratory防守状态(25)。组织病理学实验的结果表明,发生了重大的改变在海马和杏仁NEMP照射后大鼠神经元:细胞肿胀、明显的细胞间隙,形态变化(从圆形和椭圆形、三角形),深化细胞染色,模糊的细胞核和细胞质。有趣的是,氢分子可以明显减弱这些神经元损害。这些组织病理学结果提供了重要的证据来解释后大鼠的焦虑变化NEMP暴露在动物行为实验,以及减轻焦虑的氢分子治疗后的变化。在目前的研究中,H₂中和大多数的组织学变化在整个海马和杏仁核神经元NEMP曝光。结果表明,氢分子可能没有工作区域特异性。

微管结构中扮演着重要角色在髓鞘形成,神经元细胞骨架结,cell-matrix依恋和对大脑刚度(有巨大的影响26)。微管结构也容易EMR, 915 MHz射频EMR可以破坏微管结构和扰乱细胞生长(27)。转录组数据表明NEMP暴露对微管结构,有最重要的影响与生物过程方面包括基因丝组装、微管束形成,微管细胞骨架组织,microtubule-based过程,等等。这可能是归因于NEMP暴露的可能性影响细胞骨架蛋白在神经元和神经胶质和解释NEMP暴露引起的神经元损伤。此外,这将是我们的一个后续研究的方向,并将进行进一步的研究后使用电子显微镜等技术。

氢分子的抗氧化是一种新型有效的自由基清除能力,及其发挥生物效应也可能由于其广泛的影响力在代谢途径(28)。一致,代谢组学的研究结果表明,H2表现作为一个强有力的调制器调节代谢途径,主要影响相关的分子中的刺激神经组织的互动,突触囊泡循环,突触,营地信号通路和药物成瘾等。相比之下,在NEMP exposure-induced干扰只是浓缩到一个无关紧要的途径,可能是因为NEMP暴露对大脑的影响没有明显的代谢途径。

谷胱甘肽起着至关重要的作用在神经细胞抗氧化防御系统和神经元氧化还原体内平衡的维护。因此,大脑中谷胱甘肽是一种常见的消费因素患者神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病(29日)。GSSG氧化的谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG通常是作为一个敏感的指标来评估细胞内抗氧化能力(14)。虽然差异没有统计学意义由于社会团体内部的过度分散,造成的海拔GSSG NEMP曝光和GSSG的衰落引起的氢分子可以很容易地观察到治疗。NADPH,氢供体的过程中减少GSSG谷胱甘肽,其氧化产品辅酶ii也增加NEMP暴露和减少后H₂治疗。此外,H₂也显著降低gpx3的表达,这是GSSG氧化谷胱甘肽的关键酶。这些结果表明,NEMP暴露干扰减少谷胱甘肽系统和神经元导致氧化应激,进而导致神经元损伤的发病。我们的工作是一致的一个研究表明,手机发出的电磁波减少小鼠的大脑中谷胱甘肽水平(30.)。

目前的研究只是初步验证H的保护作用₂NEMP暴露引起的脑损伤和探索潜在的机制,与许多限制和争议不安。NEMP暴露引起的脑损伤也需要更有效率和即时标记,如TUNEL染色。关于NEMP微管结构的影响,我们只做了一个初步的一步探索氢分子治疗的机制,需要和更基本的实验来证实我们的转录组结果随后。最重要的是,本研究确定了H₂作为一个高效和强有力的保护剂对NEMP exposure-induced脑损伤,为未来铺平道路转化研究。

结论

总的来说,目前的研究表明H的保护作用₂NEMP暴露对脑损伤诱导的大鼠。机械化,NEMP暴露主要破坏微管结构和H₂发挥保护作用,调节代谢途径,其中最受影响的是谷胱甘肽代谢途径。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。

道德声明

综述了动物研究和海军医科大学动物福利和伦理委员会批准。

作者的贡献

LM导致实验操作,接触过程,初稿写作和实验设计的研究。J-MG导致实验设计、曝光过程,手稿修改。圣导致数据分析和动物实验。H-LZ导致统计分析的研究。QS导致了数据分析和手稿修改。X-GH造成了研究设计和生物信息学分析。H-LY、J-YW J-WW导致了动物饲养,组织学分析,富氢水准备和浓度测量和数据统计。

资金

这项研究是由中国国家重点研发项目(2022 yfc3103002 - 002),能力建设项目的医学支持岛屿上(2021 js003),中国国家自然科学基金(31900890),海军医学大学的试点项目(2019 - lh - 02),和军事医学研究项目(BKJ21J007)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpubh.2023.1103022/full补充材料

引用