西尼罗河病毒隔离的系统发育特征库蚊modestus蚊子在哈萨克斯坦西部
Talgat Nurmakhanov1,Yerlan Sansyzbaev1,鲍里斯Atshabar1,弗拉基米尔·柏林2,一Kobzhasarov2,Olzhas Yeskhojayev1,安娜Vilkova1,帖木儿Ayazbayev3,
Alexey Andryuchshenko
4,费奥多Bidashko3
__,
约翰干草
5
*和Alexandr Shvetsov6
- 1m . Aikimbayev哈萨克斯坦科学中心的检疫和人畜共患疾病(KSCQZD),哈萨克斯坦阿拉木图
- 2微生物学和免疫学研究所教育和科学,哈萨克斯坦阿拉木图
- 3消费者权益保护委员会、统治者、哈萨克斯坦
- 4乌拉尔一方面站、Uralsk、哈萨克斯坦
- 5微生物学和免疫学,雅各布斯医学院Univertsity水牛,水牛,纽约,美国
- 6国家生物技术中心、统治者、哈萨克斯坦
西尼罗河病毒普遍存在在俄罗斯南部,每年出现发烧。自哈萨克斯坦西部接壤俄罗斯南部,我们检查了这个地区的蚊子对西尼罗病毒的存在。病毒被发现在一个小的比例库蚊modestus蚊子(3/239池)和隔离相关菌株从伏尔加格勒,俄罗斯。屏幕为西尼罗病毒进行免疫球蛋白和~ 5%的当地人口呈阳性。
介绍
西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)是一个病毒的节肢动物分类中黄家庭。这是一个日本脑炎病毒(我)的成员组,其成员包括日本脑炎病毒,圣路易斯脑炎病毒(SLE)和穆雷谷脑炎病毒(MVE) (1)。普遍存在西尼罗河病毒在非洲、亚洲、欧洲和澳大利亚,一直负责几个重大流行病[以色列(1950)、法国(1962)、南非(1974)和罗马尼亚(1996))(2- - - - - -5)。1999年,西尼罗河病毒引起两个流行病。一个发生在伏尔加格勒,俄罗斯,另一个在纽约地区,美国,那里有62确认的人患病例,6例死亡(2,6- - - - - -8)。西尼罗河病毒仍然是一个在21世纪日益增长的医疗保健问题。在2018年,例如,欧洲南部和东南部看到案件大量增加;一个合理的原因是气候变化,早期的春天,炎热的夏天导致蚊子活动增加(9- - - - - -11)。
西尼罗热被诊断在俄罗斯联邦(16个地区12),几个近乎NW哈萨克斯坦。没有西尼罗河病毒病例报告(或寻找)在哈萨克斯坦,但考虑到这些周边地区局势的俄罗斯已报告例西尼罗河病毒(伏尔加格勒,阿斯特拉罕,鄂木斯克,翅果,车里雅宾斯克,奥伦堡市)(13,14)有理由担心。因此,我们进行了一项研究当地的蚊子在哈萨克斯坦西部州西尼罗河病毒携带者。主要的目标我们的研究来确定:(1)是否在西哈萨克斯坦和西尼罗河病毒传播(2)如果是这样,占主导地位的是什么种类的蚊子参与该地区。我们采用rt - pcr病毒RNA,紧随其后的是孤立的部分测序和系统发育分析来确定哈萨克斯坦菌株可能与菌株从俄罗斯和世界上的其他地方。
方法
蚊子研究收集使用人类着陆捕捉方法收集科学家,通常与一个Mondchadskiy贝尔(2×1.4印花布锥小幅高开,收集器,充当诱饵)。收集28日发生在所有11个地区不同场合的WKO面积49.0401和51.2520度和47.3325和54.0851之间的度5月25日至09年7月,2015年。这个区域是~口服以南100公里,哈萨克斯坦和~伏尔加格勒以东600公里,俄罗斯。补充图1显示收集区域内的地理位置在地图的左上角加黑边框的椭圆形。每个蚊子被合格标识视觉,经验丰富的昆虫学家使用哈萨克斯坦国家鉴定标准。我们没有汇总雄性和雌性,但考虑到收集方法,大量可能是女性。个人昆虫汇集了35 - 40份相同的物种;这些都是标准编号为哈萨克斯坦官方集合在这部分。这些都是储存冷冻(−70°C)作为整个昆虫。每个冻结蚊子池700μl MK28R PBS立即治疗之前添加的组织均质化管使用珠搅拌器高速搅拌器(Retsch MM400)。隔离病毒RNA, 100μl暂停使用的“AmpliPraym Ribo-Sorb”工具包(俄罗斯)。的第一步过程包括异硫氰酸酯变性/稳定。
检测病毒RNA在蚊子池,使用病毒E(信封)存在分析基因序列进行了hybridization-fluorescent检测方法,使用“AmpliSens WNV-FL变体FRT”工具包(俄罗斯)。Rotogene 6000循环采用。这是一个“单管”的方法,即RNA互补dna进行PCR产品所有混合在同一反应。
两个样本显示Ct的代谢途径是进行序列分析。第三个阳性样品Ct 36分的,不习惯。
序列分析,上述两个样本然后受到进一步的rt - pcr来生成一个~ 900 b之前从E基因片段测序。我们设计了引物的嵌套PCR BioEdit测序比对编辑器(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)使用70出版的西尼罗河病毒的基因组序列。针对病毒E基因的保守区域以最小的核苷酸多态性,我们选择了四个简并引物如下:
西尼罗河病毒f1 1330 GGACTGTTTGGRAARGGAAGCATTGA;
西尼罗河病毒f2 1400 CATCCAGAARGAGAAYATCAAGTA;
西尼罗河病毒r1 2444 ACGGGCATTGATKCCCATCCACA;
西尼罗河病毒2305 AACTGAYCCAAARTCCCAAGC r2。
这些嵌套引物被用于在一个标准的两步放大过程中,使用HotStarTaq + DNA聚合酶(试剂盒),如下:
掌握组合:
运行参数:
在检查一个小样本的反应混合1.5%的琼脂糖凝胶产品预期的~ 900基带,净化这个片段PCR引物的残留和核苷酸是由沉淀在20%。使用大染料终结者v 3.1执行排序。(热科学)根据制造商的指示。DNA测序反应进行自动分析仪3730 xl(应用生物系统公司)。核苷酸序列得到了约800基地和序列放置在资源库(资源库加入数字KX129740.1;KX129741.1)。序列中获得两轮PCR被组合成一个公共子序列使用SeqScape 2.6.0软件(AppliedBiosystems)。参考毒株序列存入国际NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)被用作比较。系统树图建立了使用大型6.0软件,对齐的核苷酸序列进行了使用肌肉使用最大似然算法,同时构建系统发育树(图1)。多重序列比对,使用所有已知的西尼罗河病毒E基因序列,与肌肉进行大型软件(6.015)。
图1。种系发生树从西尼罗河病毒E基因序列使用最大似然。从获得的序列c . modestus蚊子在西北收集的哈萨克斯坦。
分析细节如下:
使用最大似然发展史重建
系统测试:引导方法与1000年复制
替换模型:Type-nucleotide method-Kimura出现模型
利率/模式:率sites-Gamma分布;5离散的类别
使用空白/丢失的数据完整删除数据子集
树推理选择:
毫升启发式method-Nearest邻居交换
初始树ML-Make自动(default-NJ / BioNJ)
分支交换filter-very强
系统资源usage-1st + 2 + 3 +非编码
不。的seqs-53
不。的网站- 692
不。引导代表- 1000
蚊子发现后,我们做了一个屏幕的454居民的血清WKO,随机选择。这些血清样本被收集的哈萨克卫生当局在西哈萨克斯坦作为常规筛查活动,请向我们提供匿名编号(即材料。,没有识别标志)。商业设备使用(VectoNile-IgG、向量最好、俄罗斯),遵循制造商的指示。这些包包含积极的和消极的控制和从欧盟CE认证。短暂,1:10,1:10 0稀释血清中使用96孔板,一式两份,化验进行两次。最终读数是这四个读数的平均值。
结果
收集蚊子从11区西部哈萨克斯坦州(WKO),由经验丰富的昆虫学家,利用哈萨克斯坦当地形态学标准。共有9500个蚊子是239年合并成池。我们确定在三属7种昆虫。我们没有区分男性和女性。
属的主要潜在向量库蚊集合(占总数的56.2%,所有在一个物种-库蚊modestus。属的蚊子的成分伊蚊更加多样化,由四个物种-伊蚊刺蛾、伊caspius伊蚊vexans,伊蚊cinereus。属的蚊子按蚊该地区不太常见,捕获昆虫总数的1.8%,由两个物种-按蚊maculipennis(我们没有区分sl和ss)按蚊hyrcanus。在这项研究中,库蚊modestus拥有西尼罗河病毒。实时rt - pcr分析显示3的西尼罗河病毒RNA阳性样本库蚊modestus发现Akzhaiksky地区(表1)。哈萨克斯坦这个区域是口语之间的北部和南部和里海是俄罗斯边境约80公里,在萨拉托夫和伏尔加格勒之间。比较哈萨克病毒氨基酸序列与其它菌株在NCBI数据库中,很明显,病毒从WKO有着密切的关系从伏尔加格勒菌株。的高攻击性和anthropophilia库蚊modestus验证了这一发现,这是一个活跃的西尼罗河病毒载体(16)。
表1。蚊子数量的表提供数据区,捕捉到池的数量和种类的蚊子。
我们人类免疫球蛋白g的西尼罗河病毒免疫球蛋白、血清样本显示,大约5%的样本(454)21日我们是积极的。因此,虽然没有正式的报告在WKO WN发烧,如前所述,似乎WKO)病毒循环和b),人们被感染。
讨论
本文的主要发现是,西尼罗河病毒在西北哈萨克斯坦和与循环c . modestus蚊子,但不是在任何其他积极的昆虫在我们的样例。
蚊子是一种已知的西尼罗河病毒载体,这是流行在南亚和欧洲东南部和似乎向北移动,也许为了应对气候变化,如前所述。
我们确定的西尼罗河病毒菌株是非常相似的伏尔加格勒,俄罗斯,约600公里远离收集在哈萨克斯坦地区。
关于积极的人类的起源的问题收集血清样本在这个地区,这些人或许是否被感染在俄罗斯,同时访问。虽然这不能排除,不太可能,这可以解释所有的情况下。阳性血清的起源的地方,事实上,没有直接与俄罗斯接壤(几个100公里)之间存在有限的旅行,NW哈萨克斯坦。似乎更有可能,人们被居民感染c . modestus蚊子。作为比较,类似的报道西尼罗河病毒在蚊子流行疾病的爆发在纽约和路易斯安那州,美国,发现蚊子感染率类似发现在这项研究中17,18)。
是有用的对我们已经能够进一步测试的人是积极的西尼罗河病毒免疫球蛋白,也许通过寻找病毒在血液或尿液中病毒似乎持续相当时间在某些情况下(19)。这个希望会产生病毒序列进行比较。然而,正如前面指出的,我们曾访问收集血清样本分别从这项研究中,我们无法访问这些个体进行进一步的测试。这将是重要的人类样本建立在这些初步研究结果,我们计划在IgM额外工作,以及可能的血清和尿液分析西尼罗河病毒基因组的存在。
西尼罗河病毒的检测库蚊modestus哈萨克斯坦在西北指向一个感染在这个区域的焦点。共和国的公共卫生当局现在希望蚊子种群(特别是仔细监测c . modestus在WKO)筛查人口西尼罗热的迹象。其他几个地区的哈萨克斯坦边境地区俄罗斯西尼罗河病毒与已知的情况下,许多相对无人居住的,但一些城市(如Aktobe北部和西部的阿),在哈萨克斯坦西尼罗河病毒继续勘探工作将是一个重要的未来的公共卫生活动。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
道德声明
这些研究涉及人类受试者进行审核和批准通过哈萨克斯坦共和国。书面知情同意参与这项研究并不需要按照国家法律和制度需求。
作者的贡献
所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。
资金
这个工作的唯一的资金来源的MES是哈萨克斯坦共和国。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
确认
这项工作是一个科学技术项目的一部分(0021 ptsf-14)新的和反复出现的病毒感染在哈萨克斯坦共和国:监测和生物制剂的开发控制的科学委员会的MES哈萨克斯坦共和国。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpubh.2020.575187/full补充材料
引用
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关键词:E段、系统发育分析、哈萨克斯坦西部地区,血清转化,西尼罗河病毒、西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)
引用:柏林Nurmakhanov T, Sansyzbaev Y, Atshabar B, V, Kobzhasarov D, Yeskhojayev O, Vilkova, Ayazbayev T, Andryuchshenko, Bidashko F,干草J和Shvetsov(2021)西尼罗河病毒分离的系统发育特征库蚊modestus蚊子在哈萨克斯坦西部。前面。公共卫生8:575187。doi: 10.3389 / fpubh.2020.575187
收到:2020年6月22日;接受:2020年12月31日;
发表:2021年2月12日。
编辑:
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