RNA有效性评估指南通过农杆菌属介导的瞬态分析中烟草benthamiana
Zhibo王
扎卡里·谢伊
气李,
张老板
Bingyu赵- 植物与环境科学学院,弗吉尼亚理工大学,布莱克斯堡,弗吉尼亚州,美国
CRISPR / Cas9-based基因组编辑系统是一个功能强大的工具为植物遗传改良。然而,指导RNA (s)的变量效率(gRNA)代表一个关键限制因素,阻碍CRISPR / Cas9系统的广泛应用于作物改良。在这里,我们使用农杆菌属介导的瞬态分析来评估gRNAs编辑基因的有效性烟草benthamiana和大豆。我们设计了一个基于indels灵巧的筛选系统,可以引入CRISPR / Cas9-mediated基因编辑。gRNA绑定序列(23个核苷酸)插入到开放阅读框的黄色荧光蛋白(YFP)基因(gRNA-YFP),这扰乱了YFP阅读框和结果没有荧光信号时,在植物细胞中表达。瞬变co-expression Cas9和gRNA针对gRNA-YFP基因在植物细胞可以恢复YFP阅读框和恢复YFP信号。我们评估五个gRNAs瞄准烟草benthamiana和大豆基因和证实gRNA扫描系统的可靠性。有效gRNAs目标NbEDS1, NbWRKY70,GmKTI1,GmKTI3被用于生成转基因植物,导致预期每个基因突变。而gRNA目标NbNDR1证实了在瞬态分析是无效的。这确实gRNA未能触发目标基因突变在稳定的转基因植物。因此,这个新的瞬态试验系统可用于验证的有效性gRNAs之前生成稳定的转基因植物。
介绍
定期聚集空间短回文重复(CRISPR)中科院系统已成为一个强大的工具,在不同生物基因编辑(刘和风扇,2014年;陈et al ., 2019)。它已经应用于改善许多作物农艺性状的植物物种(陈et al ., 2019;王et al ., 2022(审查))。新的基因编辑工具,包括基础编辑和编辑,在学术界和私营部门不断发展(宗庆后et al ., 2022)。
CRISPR / Cas9机械采用短指导RNA (gRNA),一个在18到22岁的核苷酸(nt)地区互补的短片段在感兴趣的基因(吴et al ., 2014;Matson et al ., 2019)。由gRNA导航,核酸内切酶Cas9或其orthologues可以绑定并坚持目标dna和引入突变在所需的位置(Abudayyeh et al ., 2016;金正日et al ., 2017)。CRISPR / Cas9-mediated基因编辑的成功依赖于目标识别DNA由rna DNA CRISPR / Cas9系统交互。虽然gRNA似乎是无限的选择,各生物研究表明选择gRNA显著影响CRISPR / Cas9定位的效率和/或DNA乳沟在目标位点(Doench et al ., 2014;梁et al ., 2016)。最近的研究表明,核苷酸组成,长度和二级结构的gRNAs可以影响基因的特异性和有效性编辑(党et al ., 2015)。因此,选择一个有效的gRNA基因编辑实验成功的关键。事实上,gRNA的有效性至关重要的'编辑系统,目前基因编辑效率低(陈et al ., 2021 a)。对一些植物物种,如苹果、胡椒、大豆、等等,基因转移的发展需要多年才能获得稳定的转基因植物。因此,选择功能验证Cas9 / gRNA转换结构在植物转换过程的启动之前,将大大增加的生产力CRISPR / Cas9-mediated农作物基因编辑。
计算和实验都记载试图评估的有效性gRNAs CRISPR / Cas9-mediated基因组编辑(梁et al ., 2016;刘et al ., 2020 a;湘et al ., 2021;Konstantakos et al ., 2022)。例如,梁et al。(2016)提出G / C gRNA序列的核苷酸含量应该在30% - -80%。潜在的二级结构gRNAs也可能干扰他们的目标识别(梁et al ., 2016)。Konstantakos et al。(2022)总结了目前已知的计算工具,可用于gRNAs选择有效。到目前为止,只有两个方法已经开发的实验评价gRNAs在植物细胞中。第一个是利用protoplast-based瞬态试验(Carlsen et al ., 2021)。然而,这些类型的协议需要DNA扩增和酶消化和/或测序协助验证gRNAs的有效性,这是不便和浪费梁et al ., 2016;刘et al ., 2020 a)。第二个团队基于小插入和删除(indels)可以由CRISPR / Cas9-mediated基因编辑,这也是我们工作的原则。简而言之,梁et al。(2019)开发了一个记者构造,感兴趣的基因(GOI)融合的站点内切核糖核酸酶Csy4。绿色荧光蛋白(GFP)基因,克隆毗邻GOI-Csy4 Cys4识别网站融合基因。当没有基因编辑事件,Csy4 GFP记录将被摧毁。当一个基因编辑GOI事件发生时,小indels CRISPR / Cas9系统生成的有2/3的机会停止Csy4的表达,因此,防止退化绿色荧光蛋白成绩单和导致增加GFP信号(梁et al ., 2019)。然而,这种复杂的系统并不简单,这对于大规模筛选化验可以进一步简化。
小的插入和删除可以引入的nonhomologous end-joining (NHEJ)过程中CRISPR / Cas9-mediated基因编辑(Kumar et al ., 2019)。一些INDELS导致目标基因的转移gRNA绑定网站(Kumar et al ., 2019),导致目标基因功能的丧失。另一方面,某些INDELS也可以正确就针对基因移码突变,因此,恢复基因的功能。这种机制的基础上,我们开发了一个更方便协议评估gRNAs的有效性通过农杆菌属介导的瞬态分析中烟草benthamiana。新开发的系统可以帮助gRNA效率的评估开始之前稳定的转换。我们验证的功能和可靠性筛选系统通过测试gRNAs瞄准三个基因n benthamiana和两个来自大豆的基因。这个新系统不需要排序的目标基因,它预计将广泛适用于在基因组编辑gRNA验证实验。
结果和讨论
两个gRNAs针对NbEDS1和NbNDR1分别有不同的触发Cas9-mediated基因编辑方面的有效性
增强的疾病易感性1 (EDS11)和nonrace-specific抗病性(NDR1)基因编码两个关键组件的植物免疫力,分别,这是需要在不同植物物种(植物抗病性亚特et al ., 1998;科尔et al ., 2011;Knepper et al ., 2011;兔子et al ., 2020)。在以前的研究工作中,我们旨在发展n benthamiana突变体植物均受损NbEDS1和NbNDR1基因。我们手工设计两个gRNAs瞄准NbEDS1和NbNDR1分别基于PAM的位置序列(NGG)。他们克隆作为一个CRISPR / Cas9串联阵列构造(pCas9 -NbEDS1/NbNDR1gRNA)和转换成n benthamiana工厂(图S1和图S2A)。在这种构造,分配一个U6启动子表达每个gRNA (图S2A),从而表达两个gRNAs确保编辑的NbEDS1和NbNDR1基因。二十多个T1转基因植物是恢复和基因分型。的NbEDS1基因被成功编辑所有转基因植物的基因(图开通),而不是编辑NbNDR1基因被发现在任何转基因植物的基因,即使在T2和T3代(图S2C)。有趣的是,我们注意到NbNDR1gRNA序列有70%;GC含量低可能表明它有一个低亲和力目标基因(梁et al ., 2016;伯爵et al ., 2019)。我们推测gRNA瞄准NbEDS1比一个更有效的目标NbNDR1。
先前的报道表明,变异的NbEDS1可以抑制n benthamiana疾病的抵抗黄euvesicatoria(Xe)(Schultink et al ., 2017;马丁et al ., 2020)。我们接种pCas9 -NbEDS1/NbNDR1gRNA转基因植物与Xe应变Xe85-10。所有测试的转基因植物,但野生型植物,容易受到感染Xe85-10在接种,导致一个明显的水溶表型网站(图S2D)。NbNDR1需要Rps2(抗P。两)/ AvrRpt2-mediated抗病性(世纪et al ., 1995;亚特et al ., 1998;Knepper et al ., 2011;陈et al ., 2021 b)。因此,我们也接种pCas9 -NbEDS1/NbNDR1gRNA转基因植株和野生型控制根癌土壤杆菌菌株携带35 s::RPS2和35 s::avrRpt2。正如所料,瞬态co-expressionRps2和avrRpt2基因引发了细胞程序性死亡表型转基因和野生型植物(图S2E)。这个结果表明NbNDR1没有突变,与DNA测序结果一致(图S2C)。因此,我们的数据显示,尽管两个gRNAs瞄准NbEDS1和NbNDR1分别被组装成一个转换构造,两种gRNA-triggered基因编辑的有效性是不同的,唯一的地方NbEDS1 -gRNA触发基因编辑事件。
澄清我们的猜测,我们执行农杆菌属介导的瞬态分析n benthamiana,可以可视化co-inoculation图图1一个。农菌株携带p35区域:NbEDS1黄色荧光蛋白(YFP)或p35区域:NbNDR1- - - - - -YFP有或没有pCas9 -NbEDS1/NbNDR1gRNA接种到n benthamiana叶子。我们以前也生成转基因n benthamiana植物表达pCas9 -NbWRKY70gRNA,NbWRKY70基因被成功摧毁了,表明NbWRKY70gRNA功能和效率(刘et al ., 2016)。因此,在这项研究中,我们还用pCas9 -NbWRKY70gRNA p35区域::NbWRKY70-YFP控制。
图1评估gRNAs定位的有效性NbEDS1,NbNDR1,NbWRKY70通过农杆菌属介导的瞬态分析。(一)的co-inoculation方案农菌株携带pCas9- - - - - -GOIgRNA和p35区域::GOI-YFP在n benthamiana。p35区域:NbEDS1-YFP(罪犯),p35区域::NbWRKY70-YFP(eg),p35区域:NbNDR1-YFP(H-J)分别为co-inoculated pCas9空向量(没有gRNA), pCas9- - - - - -NbEDS1 / NbNDR1gRNAs, pCas9- - - - - -NbWRKY70gRNA。YFP信号检测的荧光显微镜在48小时后接种。NbEDS1gRNA和NbWRKY70gRNA,但不是NbNDR1gRNA,可以触发基因编辑共同表达时pCas9-GOI gRNA农杆菌属介导的瞬态分析中n benthamiana,导致减少荧光信号。比例尺µm代表100人。GOI;感兴趣的基因,YFP;黄色荧光蛋白,35 s;花椰菜花叶病毒35 s启动子。
的荧光信号注EDS1-YFP,注NDR1-YFP,注WRKY70-YFP融合蛋白荧光显微镜下检测(图1 b-j)。的荧光信号注EDS1-YFP中的pCas9——时略有减少NbEDS1/NbNDR1gRNA,但不是pCas9或pCas9 -NbWRKY70gRNA (图1罪犯)。类似地,注WRKY70-YFP信号也减少中的pCas9——的时候NbWRKY70gRNA (图1比)。相反,注NDR1-YFP荧光信号与pCas9——类似发生时NbEDS1/NbNDR1gRNA、pCas9或pCas9 -NbWRKY70gRNA (图1 h-j)。这个结果再次表明gRNA瞄准NbNDR1是无效的。
虽然减少YFP信号能被探测到的荧光显微镜下,我们从来没有注意到,GFP信号可以抑制GOI-YFP时完全在我们的瞬态分析中的同源Cas9 / gRNA。不保证解决结论gRNA有效性基于减少YFP信号。为了进一步验证瞬态分析的结果,我们进行了免疫印迹分析检查的积累注EDS1-YFP,注NDR1-YFP,NbWRKY70-YFP融合蛋白。的积累注EDS1-YFP (图2一个),NbWRKY70-YFP (图2 b),但不注NDR1-YFP (图2 c)融合蛋白,大大降低了发生时,携带相应的gRNA pCas9构造。这个结果是一致的与荧光显微镜下检测荧光信号(图1)。
图2的图像用于检测YFP融合蛋白免疫印迹。蛋白质的积累(一)NbEDS1-YFP,(B)NbWRKY70-YFP,(C)NbNDR1-YFP被探测发现的污点anti-HA-HRP抗体。(一)农菌株携带p35区域:NbEDS1-YFP,NbWRKY70-YFP, p35区域:NbNDR1-YFP, co-inoculated pCas9空向量,pCas9 -NbEDS1/NbNDR1gRNA, pCas9 -NbWRKY70gRNA到n benthamiana叶,分别。CK:蛋白质提取n benthamiana叶与10毫米MgCl渗透2作为一个消极的控制。污点膜是沾染了朱红色年代确认等效载荷。+:现在显示的构造,-:没有指定的构造。
发展为功能验证gRNAs pgRNA-YFP向量
虽然这瞬态分析方法可以评估的有效性gRNAs用于CRISPR / Cas9-mediated基因组编辑在植物细胞中,它需要的克隆目标基因的开放阅读框(ORF),并进一步验证通过免疫印迹分析。我们推断,而不是克隆目标基因的开放,我们可以简单地插入gRNA绑定序列(23个核苷酸包括protospacer相邻主题(PAM)序列)的YFP基因,导致gRNA -YFP融合基因的转移YFP基因,破坏了YFP蛋白表达。
为此,一个二进制向量,pXhoI-YFP,带着一YFP基因,它有一个独特的在坐标系Xho我网站毗邻起始密码子YFP基因,构建了(图3一)。合成gRNA(23元)目标序列,包括一个PAM网站,可以插入Xho我网站造成移码YFP(图3一)。派生的构造是pgRNA-YFP计价。当它与另一个二进制向量中的pCas9-GOI-gRNA,YFP阅读框可以恢复indels创建通过CRISPR / Cas9-mediated基因编辑事件和恢复YFP蛋白表达(图3 b)。为了提高克隆效率,我们进一步修改后的pXhoI-YFP插入的Xho我携带的DNA片段ccdB基因(刘et al ., 2016)。细菌克隆携带pXhoI-ccdB-YFP空向量可以消极的选择因为毒性条件的ccdB基因。派生的向量被命名为pXhoI-ccdB-YFP任何gRNA绑定序列的克隆。Cas9是一个大型的蛋白质有超过1300个氨基酸,和瞬态分析的表达水平可能是一个瓶颈,限制了基因编辑在瞬态试验系统的效率。为了简化协议和提高基因编辑效率,我们生成一个稳定的转基因n benthamiana线表示Cas9基因结构上(图S3)。
图3质粒载体的关键元素用于这项研究。(一)pgRNA-YFP向量的方案。给定gRNA绑定的两个序列互补的寡核苷酸引物序列(23元),包括一个PAM网站,可以合成,退火,克隆的Xho我网站的XhoI-ccdB-YFP通过吉布森克隆。35 s;YFP花椰菜花叶病毒35 s启动子;黄色荧光蛋白,Nos的怪兽;根癌土壤杆菌胭脂氨酸合成酶终结者。其他关键要素是相同的原始pEALEYGATE 101向量[14]。(B)pCas9-GOI-gRNA和pgRNA-YFP的方案,说明pCas9-AtU6pro-gRNA表达gRNA目标YFP基因pgRNA-YFP构造。AtU6,拟南芥U6启动子;AtUbi10 pro,拟南芥10泛素启动子;口服避孕药后,根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的终结者;PAM, protospacer相邻的主题。
gRNA筛选系统的功能测试通过农杆菌介导瞬态分析
我们验证了pgRNA-YFP / Cas9系统测试gRNAs瞄准NbEDS1,NbNDR1,NbWRKY70在n benthamiana。低聚糖基于gRNA绑定每个基因序列引物合成,退火,克隆到Xho我的pXhoI-ccdB-YFP。由此产生的构造是pNbEDS1gRNA-YFP pNbNDR1gRNA-YFP, pNbWRKY70分别gRNA-YFP。派生的基因结构与pCas9——中的NbEDS1/NbNDR1gRNA或pCas9 -注WKRY70 gRNA由农杆菌属在野生型介导的瞬态分析n benthamiana和转基因n benthamiana窝藏的Cas9基因。YFP时可以检测到的荧光信号Cas9与p中的NbEDS1gRNA-YFP和pNbWRKY70gRNA-YFP,但不是pNbNDR1gRNA-YFP (图4 a - c)。因此,我们进一步证实gRNA瞄准NbNDR1是无效的触发基因编辑,解释为什么没有NbNDR1基因编辑事件可以发现稳定的转基因植物。这些结果也意味着新的gRNA评价体系的可行性。此外,我们还执行测试pCas9转基因植物,这是有效的瞬态分析方法。正如前面所讨论的那样,pCas9转基因植物使系统更加简单明了。因此,我们预计pCas9转基因植物可能是一个宝贵的资源共享植物研究社区。第一系统描述在这项研究中,我们比较了YFP信号在两个样品,在减少可能是植物细胞中观察到的荧光信号基因编辑事件。YFP第二系统,获得的信号是比较一个样本YFP信号,另一个没有荧光信号。因此,第二种方法更方便,更确凿的数据。
图4pgRNA-YFP向量用于屏幕gRNAs的有效性农杆菌属介导的瞬态分析。瞬态pgRNA-YFP唯一的表情n benthamiana不会产生任何荧光信号。(一)Co-expression pNbEDS1gRNA-YFP pCas9 -NbNDR / NbEDS1gRNA YFP信号的恢复n benthamiana。(B)Co-expression pNbNDR1gRNA-YFP pCas9 -NbNDR1 / NbEDS1gRNA未能恢复YFP信号。(C)Co-expression pNbWRKY70gRNA-YFP pCas9 -NbWRKY70gRNA YFP信号恢复。(D, E)Co-expression p的GmKTI1gRNA-YFP或pGmKTI3gRNA-YFP pCas9 -GmKTI1 / GmKTI3gRNA YFP信号的恢复n benthamiana。比例尺µm代表100人。
评估的有效性gRNAs针对两种大豆胰蛋白酶抑制剂基因
我们进一步测试的可行性预测的有效性gRNA针对两个大豆基因通过使用上面描述的系统。为此,我们首先gRNA有效性验证,然后生成稳定的转基因大豆作物。虽然成功的基因在大豆已报告编辑事件,转换效率低和long-tissue文化过程阻碍CRISPR / Cas9系统的广泛应用在大豆分子育种程序。因此,它是至关重要的验证的有效性gRNAs起始之前稳定大豆转化实验。
大豆Kunitz胰蛋白酶蛋白酶抑制剂(KTI)基因编码的蛋白质可以降低动物和人类的蛋白质消化率(吉尔曼et al ., 2015)。因此,KTI-free或低KTI大豆品种与突变KTI基因是非常可取的。我们试图摧毁两个seed-specific KTI基因,KTI1(Gm01g095000)和KTI3(Gm08g341500),通过CRISPR / Cas9-mediated基因组编辑方法。gRNAs定位的有效性KTI1和KTI3使用上面描述的瞬态试验系统验证(图4 d, E)。随后,pCas9-KTI1/3 gRNA构造转化为大豆品种82年威廉杆菌介导的转换(Luth et al ., 2015)。五个独立的转基因植物是恢复和基因分型。这两个KTI1和KTI3基因编辑事件被发现在所有测试转基因线(图5 a, B)。
图5桑格测序色谱图显示的DNA序列GmKTI1和GmKTI3这是针对基因编辑。的开放阅读框架GmKTI1和GmKTI3在pCas9-GmKTI1 / GmKTI3 gRNA T0转基因大豆植物被放大并测序。测序的双峰值色谱表明野生型和突变等位基因序列的存在GmKTI1(一)和GmKTI3(B)。野生型基因序列图上方的测序色谱图所示。PAM网站强调。
结论
在这项研究中,我们使用了农杆菌属介导的瞬时化验测试gRNAs的有效性。第一种方法是基于Cas9可以编辑目标基因融合YFP和导致减少了融合蛋白在植物细胞转化和荧光信号。第二种方法,pXhoI-ccdB-YFP / Cas9系统,开发基于小indels可能引入的nonhomologous end-joining CRISPR / Cas9-mediated基因过程中编辑。这样的小indels可能正确的阅读框YFP插入的基因中断gRNA绑定序列。我们表明,第二种方法是更方便和可靠的通过测试五gRNAs瞄准n benthamiana分别和大豆的基因。的pre-validated gRNAs允许我们在目标基因产生突变稳定的转基因大豆植物(王et al ., 2022(审查))。因此,我们预期pXhoI-ccdB-YFP / Cas9系统广泛适用于筛选gRNA (s)在植物基因组编辑。
材料和方法
大肠杆菌,根癌土壤杆菌、黄euvesicatoria菌株
大肠杆菌菌株DH5a和ccdB幸存者(热费希尔科学Inc .)是生长在Luria肉汤(磅)中补充与适当的抗生素在37°CC。根癌土壤杆菌菌株GV2260生长在LB培养基28°CC。黄euvesicatoria应变Xe85 - 10是生长在营养酵母甘油琼脂(NYGA)介质在28°CC。卡那霉素50微克/毫升(σInc .)、庆大霉素50微克/毫升(σInc .)和利福霉素100 ug /毫升(σInc .)被用来选择转化细菌细胞携带指定的质粒结构。
植物材料和生长条件
大豆(大豆,简历。82年威廉(WM82)),烟草benthamiana种子发芽和生长在阳光下®混合# 1在生长箱(14小时/ 10小时光/暗周期25°C / 20°C)。还是植物被用于实验的详细。
CRISPR / Cas9质粒结构
之前描述pCRISPR / Cas9-Kan构造(刘et al ., 2016为应用程序)修改转基因大豆作物的基因组编辑。总之,我们取代了卡那霉素耐药基因盒的酒吧基因盒(抵抗除草剂Bialaphos)。的酒吧基因盒,它由一个mannopine合成酶(MAS)启动子酒吧基因开放阅读框,MAS终结者,是放大的质粒DNA pEarleyGate101 (Earley et al ., 2006)。PCR引物与注释中列出表S1。的酒吧克隆的基因盒中外职业我/茂BI网站pCRISPR / Cas9-Kan构造使用吉布森组装®克隆工具(新英格兰生物学实验室公司)。派生的构造被任命为pCas9。Cas9基因表达的是使用一个拟南芥泛素10基因启动子(刘et al ., 2016)。指导磁带针对RNA表达GmKTI1和GmKTI3,NbEDS1和NbNDR1,NbWRKY70分别,在GenScript合成生物技术公司gRNA的表达是由一个拟南芥U6启动子(刘et al ., 2016)。gRNA磁带被克隆到中外职业我网站使用吉布森pCas9组装®克隆工具。派生的结构变成了农应变GV2260为稳定的转换和瞬时基因表达分析。
基因克隆和质粒结构
开放阅读框(orf)NbEDS1(Ordon et al ., 2017),NbNDR1(董et al ., 2022),NbWRKY70(刘et al ., 2016放大的互补n benthamiana与引物中列出表S1。子被克隆到pDonr207®使用英国石油公司®克隆工具(热费希尔科学)。/片段的基因供体向量subcloned进pEarleyGate101使用LR®网关克隆工具(热费希尔科学)。派生的构造p35区域:NbEDS1-YFP, p35区域::NbNDR1-YFP, p35区域:NbWRKY70-YFP。克隆基因的表达是由花椰菜花叶病毒35 s启动子(35)。植物表达结构变成了农应变GV2260通过电穿孔。
一个二进制向量pXhoI-YFP带着黄色荧光蛋白(YFP)基因,构建了放大和DNA片段克隆到Xho我和Spe我网站pEarleyGate101 (Earley et al ., 2006)。列出了引物表S1。克隆的YFP基因有一个独特的在坐标系Xho我网站毗邻起始密码子YFP基因。ccdB磁带是放大pEarleyGate101和插入Xho我的pXhoI-YFP (表S1)。派生的向量叫做pXhoI-ccdB-YFP维护大肠杆菌应变ccdB幸存者(热费希尔科学Inc .),它可用于任何合成gRNA绑定序列的克隆与减少假阳性克隆来自不完全消化的pXhoI-ccdB-YFP DNA,可以选择消极的ccdB基因大肠杆菌DH5α。
吉布森克隆
克隆gRNA绑定到p序列XhoI-ccdB-YFP,两个给定gRNA绑定的序列互补的寡核苷酸引物序列(23元),包括一个PAM网站,可以合成,退火和克隆Xho我网站的XhoI-ccdB-YFP通过吉布森克隆。总之,带着gRNA绑定两个核苷酸引物序列,包括一个PAM网站,合成(集成DNA技术,Inc .)。这两个引物(100点)被使用热退火周期计编程98°CC / 30秒,56°CC / 45秒,重复10周期。退火gRNA链接器直接克隆到Xho我的pXho吉布森I-ccdB-YFP通过使用克隆工具(新英格兰公司)(Lei et al ., 2014)。总之,0.01 pmol线性化矢量pXhoI-ccdB-YFP, 0.2 pmol gRNA链接器,与同等体积的混合2 x吉布森大师,和孵化热循环程序保持在50°C 60分钟(雅各布斯和马丁,2016年)。孵化后,反应混合物变成了大肠杆菌DH5a使用热休克的方法。pgRNA-YFP变成了派生的二元结构根癌土壤杆菌应变GV2260通过电穿孔。
农杆菌介导n . benthamiana瞬态分析和免疫印迹分析
农杆菌属菌株GV2260窝藏pCas9-gRNA质粒,pgRNA-YFP质粒co-infiltratedn benthamiana叶片叶肉组织瞬态蛋白表达。YFP信号监控使用荧光显微镜(Axio观察者背书,Zissis)在48小时后的渗透。YFP基因融合了c端HA型表位标记,和融合蛋白可以检测到anti-HA-HRP(罗氏)抗体的稀释1:5,000。Plant-expressed蛋白质免疫印迹分析探测到后过程如前所述王et al ., 2018;刘et al ., 2020 b)。
n . Benthamiana黄euvesicatoria疾病检测
Xe应变Xe85-10种植在NYGA媒介补充了利福霉素(100 ug /毫升)28°CC了两天。收集细菌细胞和悬浮在MgCl 10毫米2和稀释4 x108CFU毫升1。细菌培养液是渗透到背面n benthamiana使用钝端针头注射器叶。接种植物维持14岁以下人力资源在室温下光/ 10小时暗。表型的细胞程序性死亡在48小时post-inoculation记录。
代的转基因烟草和大豆种植农杆菌
农杆菌属应变GV2260窝藏质粒pCas9或pCas9-gRNA用于烟草转换后协议如前所述刘et al ., 2016)。大豆核电站执行转换转换设施如前所述爱荷华州立大学(巴斯et al ., 2006;Luth et al ., 2015;通用电气et al ., 2016)。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步调查可以直接到相应的作者。
作者的贡献
BZhao构思项目;ZW BZhao设计的研究过程。ZW, z,千瓦,QL,公里,完成了实验。ZW和BZhao分析数据。ZW, BZhang BZhao手稿输入从所有的作者写道。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作得到了维吉尼亚州大豆委员会(# 467059)和种子格兰特平移弗吉尼亚理工大学植物科学中心。中心的统一内部竞争格兰特先进创新农业在弗吉尼亚理工大学农业与生命科学学院和维吉尼亚州农业试验站(VA160144)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2023.1111683/full补充材料
补充图2 |敲除的NbEDS1损害的细胞死亡trigerd交互的注Roq1 XopQ,但不是Rps2 / AvrRpt2。(一)CRISPR / Cas9构建港口三个必要元素表现出如下:植物选择磁带由一个MAS (mannopine合成酶)启动子,酒吧的基因,和MAS终结者;Cas9磁带包含拟南芥泛素启动子,Cas9基因,口服避孕药(章鱼碱合成酶)终结者;两个指导RNA磁带和每个人都包含一个拟南芥U6启动子,sgRNA之一。序列比对的野生型和突变体EDS1(B)或NDR1(C)等位基因生成通过CRISPR / Cas9-mediated基因组编辑显示NbEDS1在所有这些植物基因被成功编辑,而编辑NbNDR1基因被发现在任何基因分型植物。(D)pCas9 -NbNDR1/NbEDS1gRNA转基因植株和野生型植株接种黄euvesicatoria应变Xe85-10。相比之下,co-inoculation农菌株携带p35区域:RPS2和p35区域::avrRpt2,2 x10的浓度8CFU毫升1,可以触发细胞死亡野生型和转基因n benthamiana48岁居民(E)。的图片都来自正面和背面的叶样品。
补充图3 |pCas9转基因的验证n benthamiana植物。pCas9向量不携带任何gRNAs被用来变换n benthamiana工厂。的Cas9基因片段检测转基因线# 1和# 2的PCR扩增而不是在野生型植物。质粒DNA pCas9担任积极控制模板。(1)1 Kb标记,(2)pCas9 1号线,(3)pCas9第2行,(4)野生型植物,(5)pCas9质粒DNA。
引用
亚特,N。,Metz, M., Holub, E., Staskawicz, B. J., Daniels, M. J., Parker, J. E. (1998). Different requirements forEDS1和NDR1通过抗病基因定义至少两个r gene-mediated信号通路拟南芥。Proc。国家的。学会科学。美国的一个。95 (17),10306 - 10311。doi: 10.1073 / pnas.95.17.10306
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收到:2022年11月29日;接受:2023年1月25日;
发表:2023年2月20日。
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