评论文章

前面。植物科学。,26 January 2023
秒。植物生物技术
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1100228

基因的方法在提高生物技术生产紫杉烷:一个更新

埃德加Perez-Matas ¹,

迭戈Hidalgo-Martinez ¹,

Ainoa Escrich ²,

Miguel Angel镇长 ¹,

伊丽莎白Moyano ²,

奔驰Bonfill ^{1 *}和

哈维尔Palazon ^{1 *}

¹生物学系、医疗和环境,制药和食品科学学院大学巴塞罗那,西班牙巴塞罗那
²Departament药物我不熟悉de la维达(梅丽莎),大学Pompeu布拉,西班牙巴塞罗那

紫杉醇(PTX)及其衍生物二萜生物碱广泛使用的化疗药物在治疗多种癌症。由于PTX的稀缺特性,其在细胞培养生产和植物器官对植物生物技术是一个重大的挑战。虽然取得了重大进展在这个领域通过代谢工程和合成生物学技术的发展,生产水平仍不足以满足当前市场的需求对这些强大的抗癌药物。的一个关键障碍是裸子植物基因转化的困难水松spp。本文侧重于通过基因工程技术提高紫杉烷生产取得的进展。这些包括限制紫杉烷生物合成途径中的基因的过度表达及其调节转录因子参与水松种虫害细胞培养和改变了根,以及转换技术的开发和优化。尝试在不同的生物如细菌和酵母生产紫杉烷也进行了描述。虽然已报告有前景的结果,将整个PTX代谢途径没有日期,和紫杉烷生物合成仍然是限制水松细胞和一些内生真菌。合成生物以外的发展水松细胞的能力依然生产PTX可能要等到其代谢途径的完整说明。

1介绍

植物细胞、组织和器官在体外文化是优秀的平台上生产专业感兴趣的化合物化学/制药行业,如皂苷含量(Mallol et al ., 2001),托烷生物碱如莨菪碱(Palazon et al ., 2003),ginkgolides (Sabater-Jara et al ., 2013),反式白藜芦醇(Almagro et al ., 2022)或centellosides (镇长et al ., 2022 a),等等。这些生物技术工具的另一个重要手段产生的化合物是紫杉醇(PXT),这是由食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗难治性转移性卵巢癌1992年,和转移性乳腺癌(耐火材料或对蒽环霉素)是在1994年。高度积极的结果与PTX延长其使用非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌,食管,睾丸,胰腺癌,以及艾滋病卡波济氏肉瘤和白血球减少症(Perez-Matas et al ., 2022)。此外,PTX正在研究治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症的疾病(Zhang et al ., 2005)和其他健康状况相关的稳定microtubule-associated蛋白质如银屑病(埃利希et al ., 2004)。

由于其有效性,PTX也许是历史上最重要的抗肿瘤剂。2021年,全球PTX市场价值45.1亿美元,预计到2030年将达到超过111.6亿美元(Perez-Matas et al ., 2022)。几个国家的20多家公司参与新药物的开发和商业化的PTX形式,尤其是在美国,占全球近40%的肿瘤市场(索非亚et al ., 2017)。获得这种化合物或半合成前体水松树木生态持续是由于他们的自然水平低,化学合成是在经济上是不可行的。因此,通过优化PTX的生物技术生产水松种虫害细胞培养是当前方法的选择,因为细胞悬浮液可以控制和具有成本效益的条件下生长。例如,植物细胞发酵(PCF^®)技术实现了芬多精生物技术,当今世界上最大的供应商PTX (Perez-Matas et al ., 2022)。尽管如此,生物技术生产平台的PTX收益率仍然很低。因此,PTX是市场上最昂贵的和附加值最高的化合物。虽然PTX生物合成途径并不是完全理解,主要flux-limiting步骤已经阐明,打开机会的代谢工程方法来增加其生产或半合成的前体。的一个主要障碍在代谢工程技术的应用水松种虫害cell /机关文化是这些裸子植物基因转化植物的困难,和改变了植物的缓慢增长在体外条件。由于这些原因,遗传转化的水松种虫害对植物生物技术仍然是一个重要的挑战。

本文研究的遗传转化方面取得的进展水松,专注于关键的研究范围广泛的使用水松物种、植物材料、转换系统、向量和文化条件。代谢工程的成功应用在这个领域进行了总结。覆盖其他方面是外源基因的表达在PTX生物合成途径和合成生物学的潜力开发一个快速和简单的PTX生产系统。

2的遗传转化研究的进展水松spp。

有许多试图获取转化细胞(表1,图1)或毛状根培养(表2,图2)水松物种使用不同的方法和策略(图1 a, B),但很少有研究小组成功(图1 c)。正如前面提到的,缓慢和困难在体外这些裸子植物植物的文化是一个严重障碍发展高产的转基因生产平台PTX或半合成的前体。

表1

表1改变了水松细胞培养。

图1

图1总结相关的研究水松细胞培养。(一)研究在不同的水松物种分组通过遗传转化技术和植物材料。(B)外源基因的频率使用不同种类的紫杉。(C)多的研究积累水松细胞培养。1。直接接种植物导致冠瘿(史密斯,1942)。2。直接接种茎段导致冠瘿(汉et al ., 1994)。3所示。GUS活性观察经过coculture的质粒和合子胚胎(烹调的菜肴et al ., 1996)。4所示。稳定细胞系overexpressingS-DBAT基因(何鸿燊et al ., 2005)。5。稳定的转化株感染后土壤杆菌属(凯彻姆et al ., 2007)。6。瞬态转换实现即peg在细胞培养。引出实验测试。(Vongpaseuth et al ., 2007)。7所示。更高的生产PTX细胞系的方式基因,overexpressingtx基因(Exposito et al ., 2010)。8。稳定细胞系overexpressingDBAT基因(Zhang et al ., 2011 b)。9。减少的紫杉烷类C14OH转基因细胞系overexpressingas14OH基因(李et al ., 2011)。10。细胞系overexpressingTcNCED即peg的基因和转换显示更高水平的ABA和PTX (李et al ., 2012)。11。最高转换效率(75%)实现t . x媒体细胞培养(Martinez-Marquez et al ., 2015)。12。最好的识别农杆菌属细胞转化T.cuspidata和t .黄花(威尔逊et al ., 2018)。

表2

表2水松毛状根的文化。

图2

图2总结了紫杉毛根感应和文化的过程。左边的图像显示8-week-old t baccata幼苗生长在无激素DCR培养基,这些幼苗土壤杆菌属感染rhizogenes。中间的图像显示毛在感染根站点的发展。正确的图片显示的是一个稳定的,一岁的毛状根线隔离受感染的外植体。

2.1转换水松细胞培养

最早的努力变换水松种虫害的史密斯(1942),曾Phytomonas农人工接种植物t . baccataErecta大声,t .杂草纳特t . cuspidata摘要。和调查。和t .媒体Rehd。,grown in controlled conditions. Most of the plants developed crown galls with variable growth capacity. (汉等人,1994年;汉等人,2000年)基因转化成熟的茎段t .杂草和t . baccata树根癌土壤杆菌(Bo542和C58)。虽然获得gall细胞株生长良好,PTX生产(untransformedμg / g干重)愈伤组织并没有改善。

瞬态转换化验了烹调的菜肴et al . (1996),受精卵的孵化胚胎与pB112表达载体携带β-glucuronidase(格斯)基因和卡那霉素抗性基因(nptII基因)控制下的花椰菜花叶病毒35 s (CaMV35S)。GUS表达实现92%的成熟的胚胎,表明转换的效率取决于胚胎的发育阶段。

Croteau的集团,其中一个最杰出的PTX领域的生产水松细胞培养,也专门努力获得基因改变了细胞培养使用农杆菌属系统(凯彻姆et al ., 2007)。他们成功地建立hygromycin-resistant转换t . cuspidata细胞培养进行GUS报告基因,实现充分的生物质20个月后建立一个生物反应器的文化。遗传转化并没有改变生产紫杉烷的水平和模式。目的是描述所涉及的基因PTX生物合成及其调控,Vongpaseuth罗伯茨,2007实现了粒子bombardment-mediated瞬态的转变t . cuspidata和t .黄花用萤火虫荧光素酶基因本构CaMV35S启动子的控制下。参数优化,然而,似乎是高度依赖于所使用的细胞系。

代谢工程是一个非常有用的技术,因为它允许内生的操纵各种次生化合物的代谢途径。转移和集成的基因编码酶参与限制的代谢步骤通常促进内源性化合物的生产到目标路径。这种方法的应用使得PTX产量的提高在体外文化overexpressing键或限制生物合成基因的能力。

目的是提高生物技术生产紫杉烷、转基因细胞培养水松mairei既定的窝藏基因编码酶10-deacetyl baccatin III-10-O-actyl转移酶(DBAT)。然而,紫杉烷生产仍然依赖于启发式与甲基jasmonate (MeJa)在转基因根线,只有其中一个PTX高收益率(何鸿燊et al ., 2005)。在2011年,Zhang et al。(2011)获得转基因红豆杉细胞也overexpressingDBAT基因coculture后一个农压力。在这种情况下,PTX生产转化细胞相比高出1.7倍untransformed细胞没有的。

另一个用于代谢策略t . x媒体细胞培养是块分支点PTX antisense-induced抑制生物合成的taxane-14-hydroxylase基因,其产品在碳催化紫杉烷类含氧的生物合成。因为这些化合物与PTX争夺相同的最初的前兆,阻止它们的形成导致转基因细胞系(PTX增产李et al ., 2011)。

另一方面,臭氧引起紫杉烷的生产t对细胞培养和响应至少部分取决于脱落酸(ABA)信号(徐et al ., 2011)。应用此策略,转基因t对细胞株是通过与粒子携带质粒向量窝藏轰炸TcNCED1和成基因的控制下35 s启动子。的数控基因编码9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶,这种酶负责9-cis-epoxycarotenoid的乳沟,病原反应一步ABA的生物合成。ABA积累在转基因细胞系和PTX生产增加了48%相比高出2.7倍untransformed细胞(李et al ., 2012)。

Exposito et al。(2010)获得根文化的转换t .媒体overexpressing的t . baccata tx基因编码的酶控制特定于紫杉烷生物合成的第一步。作为根线增长率很低,两个选择,都包含了答:rhizogenes高校基因和只有一个tx基因。植物生长调节剂被应用于反分化根和获得的愈伤组织被用来建立悬浮细胞培养。三个t . x媒体细胞株是发达,untransformed控制,rolC线(携带的方式基因),tx(携带的方式和tx基因),用于建立一个两阶段的文化系统。在第一阶段,细胞培养的生长培养基优化生物质生产了12天。此后他们被转移到生产中紫杉烷生产优化,有或没有的诱导子的法案,并维护了28天。紫杉烷生产tx行被发现高于控制2.64倍和1.55倍高于rolC线,引发条件。

Martinez-Marquez et al。(2015)描述了一种稳定可靠的协议转换的t . x媒体细胞培养。十了愈伤组织获得从1 g鲜重镀水松细胞,其中75%被维持了几个月连续选择的媒介。其他有效的遗传转化方法t . cuspidata和t .黄花愈伤组织和细胞悬浮液与最优农应变(EHA105)描述威尔逊et al。(2018)。转换后的愈伤组织表现出稳定的GUS表达超过五年。这种技术代表了一个比其他方法明显改善红豆杉细胞转换时农。

2.2水松毛状根培养

毛状根文化是一个非常有用的生物技术平台,天然产品的生产,主要是那些合成的原植物的根部。这些文化建立了不同菌株的感染后的植物答:rhizogenes。毛状根培养几个优势超过其他生物技术系统,包括它们的相对快速增长(在无激素媒体),遗传和生化稳定性和organogenesis-associated代谢物的合成能力(镇长et al ., 2022 b)。此外,毛状根的文化可能会扩大从小规模系统大规模的工业过程。

然而,获得的毛状根文化水松种虫害可能非常困难由于转换效率低,感染之间的时间长度和毛状根的形成,和低增长率水松多毛的根(图2)。然而,几个研究小组取得了毛状根培养与提高增长和生产如下提及。

在2000年,Furmanowa和Syklowska-Baranek (2000)和Furmanowa et al。(2000)成功建立了根文化t . x媒体通过直接感染与三种不同菌株的几种外植体答:rhizogenes。毛状根接种后出现19周,慢慢成长为一年半,之后达到一个稳定的文化。PTX生产这些根源后三周的启发与MeJa高出三倍比控制的根源。相同的研究小组报告说,添加前体L-phenylalanine p-aminobenzoic酸的培养基显著增加紫杉烷的生产。值得注意的是,增加L-phenylalanine一起惩罚比未经处理的文化(PTX增产14倍Syklowska-Baranek et al ., 2009)。

Sykłowska-Baranek et al。(2022)最近发现了一种有效的策略,显然PTX产量的增加t . x媒体多毛的根源。预处理后与100年μMβ-aminobutyric酸一周,100年文化引起了μM法案,10μM硝普酸和100年μM L-phenylalanine。经过14天的启发,PTX生产3179.9μg / g干重,这是613倍高于控制文化。

t . cuspidata毛状根培养获得的金et al。(2009)感染后三周的老水松苗三个野生菌株答:rhizogenes(写明ATCC 15834、R1000和A4),以下三种不同的方法:直接感染,液体培养和固体培养。得到了三个稳定的根线经过10个月的亚文化和文化的最佳线路选择优化条件,导致PTX收益率为52.6 mg / L, 14天的启发。

的t .媒体毛状根的文化了Exposito et al。(2010)通过直接感染植株吗答:rhizogenesLBA 9402野生菌株或农C58C1携带答:rhizogenesRiA4质粒和二进制质粒pCA-TXS-His窝藏tx基因的t . baccata。执行转换CaMV35S启动子的控制下,利用潮霉素磷酸转移酶基因(hptII)作为标记。证实了根线的转换性质PCR分析,但由于根系生长不良,正如上面提到的,毛状根线是肉瘤,t .媒体建立了细胞培养的的方式基因,有或没有tx基因。

在2015年,Sykłowska-Baranek et al。(2015 b)获得t . x媒体转基因根overexpressingtx基因,其增长和紫杉烷生产大大改善两相液体文化与充气或脱气perfluorodecalin (PFD)。添加MeJa(100μM)文化PTX产量的增加,而补充coronatine(1μM)更有利于baccatin三世积累。几个PTX生物合成基因的表达总是更高tx-overexpressing与野生型毛根部,紫杉烷的生产(Sykłowska-Baranek et al ., 2019 a)。同一研究小组还研究了PTX生产和苯丙氨酸ammonia-lyase (PAL)活动在两个t . x媒体毛状根线overexpressingtx基因(Sykłowska-Baranek et al ., 2015 a)。引出后的法案(100μM)和苯丙氨酸(100μM),最高PTX产量与最大朋友活动在一个毛状根线,但不是在另一个。

生物技术系统基于纤维素酶的添加t . x媒体毛状根培养overexpressingtx基因明显增强PTX从生产者细胞释放介质(Sykłowska-Baranek et al ., 2018),尽管总生产没有增加。(审查,请参阅Sykłowska-Baranek et al。(2019 b)。

在2022年,Sahai和Sinha (2022)建立了t . baccata无性系种群。wallichiana适应了树的毛共培养后根外植体答:rhizogenes,添加100μM acetosyringone和应用声波降解法(30千赫,每隔5 s 60年代300 W)和加热5分钟(4°C)。改变根出现co-cultivation七天之后,和34%的外植体与毛根部被改变了。经过4个月的增长,PTX毛状根的生产,光谱方法测量,高于对照组。

所有这些研究证实的结果的可能性建立转化细胞或毛状根文化和代谢工程方法的有效性在增加生产PTX紫杉烷类和相关水松spp。还需要进一步的研究来继续提高PTX及其衍生物的产量,以满足日益增长的临床/工业对这些药物的需求。

2.3其他转换系统

内生真菌能够产生PTX,主要是如果他们生活在主机水松物种。植物化学相结合的一项研究中,分子生物学和基因组测序未能发现PTX通路或在真菌内生菌与生物合成基因水松spp。(Heinig et al ., 2013)。然而,自从第一个报告Stierle et al。(1993)和Strobel et al。(1996)一些研究证实紫杉烷生产的内生真菌水松和其他植物物种(评论,看到周et al。(2010);Shankar奈克(2019))。事实上,大约有200种不同的真菌被认为代表不同的订单生产PTX (Flores-Bustamante et al ., 2010;哲人et al ., 2022),尽管非常低且不稳定的水平。

紫杉烷类低PTX和相关的内容在植物内生真菌文化中,和减少生产连续亚文化鼓舞了几次试图增加PTX收益率通过基因改造的真菌。在2007年,王et al。(2007)改变了真菌BT2隔绝t对var。mairei使用限制enzyme-mediated集成技术。质粒pV2用于真菌原生质体转化存在潮霉素B和氨苄青霉素抗性基因的选择性标记。真菌原生质体被另一个转换系统魏et al。(2010)。在这种情况下,PTX-producing内生真菌菌丝束sp。EFY-21遗传转化是由聚乙二醇(PEG)相同的兵质粒,但携带hygromycin-B磷酸转移酶基因的控制下真菌子trpC。原生质体再生的频率高于6%。这两种不同的变换方法的成功打开了转移的可能性PTX生物合成的基因提高真菌紫杉烷的生产。

Zhang et al。(2011 b)稳定转换PTX-producing真菌的孢子枝孢属cladosporioidesMD2和农LBA4404携带二进制向量pCAMBIA1303,存在hygromycin-resistance基因的控制下CaMV35S启动子和Nos终端。最优培养条件建立一个高效、稳定的真菌转化。两年后,刘et al。(2013)开发一个有效的协议转换PTX-producing植物内生真菌菌丝束sp。EFY21农EHA 105携带表达载体pCAMBIA 1304 'an7-1 hygromycin-resistance基因。几个因素影响转换和转化株稳定也进行了优化。然而,这些研究集成PTX生物合成的基因转化真菌的基因组。

CRISPR / Cas9系统已成为一个强大的和精确的工具在各种生物基因组工程,包括丝状真菌的基因组编辑了非凡的成功。PTX生产在丝状真菌中可能增强将这项技术应用于块的甾醇代谢途径角鲨烯合酶和羊毛甾醇合成酶和通灵PTX合成的前体(El-Sayed et al ., 2017)。尽管还过早宣布这个基因组编辑系统迎来了一个黄金时代的生产医药产品在操纵真菌,这当然是一个有前途的未来的大道。

另一个转换策略旨在理解分子机制参与紫杉烷被生产Sanchez-Munoz et al。(2020)。瞬态PEG-assisted转变t . x媒体原生质体的转录因子BIS2相见Catharanthus roseus也叫(范Moerkercke et al ., 2016)和TSAR2从Medicago truncatula(莫顿et al ., 2016克隆到PK7WG2D质粒)。随后发现了几个这种taxane-related基因的表达调节,表明这种方法,结合与启发,可以建立更高效的服务水松种虫害PTX增产率转换系统。

最近,沙尼et al。(2022)暂时性的改变t . baccata叶子由overexpressing DBTNBT的全长编码序列使用农LBA 4404真空渗透方法。DBTNBT酶控制的最后一步PTX生物合成途径。两个农菌株被使用,携带向量pCAMBIA-DBTNBT或(没有DBTNBTpCAMBIA1304基因)。这个基因的超表达明显增加了PTX生产与控制,coronatine时高7.4倍(1μM)和环糊精(50 mg / L)被添加到孵化文化。

3杆菌和表达向量用于遗传转化

植物物种的遗传转化,广泛应用于植物生物技术领域,允许将外源基因插入到收件人创建转基因植物组织文化。基因转移方法最常用的植物农杆菌属种虫害系统挂钩,电穿孔,即PEG技术(Rakoczy-Trojanowska 2002)。基因修改的主要障碍水松种虫害是缺乏一个有效的和可再生的转换系统。使用的优点农杆菌属种虫害感染不同的植物物种群体都被记录在案,但在裸子植物转基因表达仍然是困难的,甚至当使用supervirulent菌株(Van Der适合et al ., 2000;Gelvin 2003)。转换的顽固的松柏粒子轰击(即peg)已经被用于引入线性和质粒DNA结构,但很少出版物报告瞬态或稳定的转变水松spp。其他的障碍是裸子植物植物遗传转化后,再生的困难和可能出现的支离破碎或多个复制转换事件导致转基因沉默。

农杆菌属是一个属的细菌诱导肿瘤的生长或由天然植物根的生长基因转移到植物细胞的能力。这种机制被利用为生物技术和工具农杆菌属系统是最用于植物的遗传转化。在近期重新分类农杆菌属物种(Flores-Felix et al ., 2020),目前大多数属中根瘤菌和其他Ruegeria,Pseudorhodobacter和Stappia(新属)。因此,最杆菌用于植物生物技术目前被称为根瘤菌radiobacter,r . rhizogenes,r . rubi和r .葡萄,分别。后两个物种诱导肿瘤/皇冠在几个植物虫瘿。

4紫杉烷生产在不同的系统:合成生物学

尽管某些遗传转化的杰出成就水松spp,如前所述,这个过程很少被报道的数量与被子植物植物的遗传转化研究,单子叶植物和双子叶植物。此外,PTX生产实现基因转化文化仍然相对较低。这促使调查潜在的代谢工程non-taxane-producing不等的系统。合成生物学技术的发展创造了一个充满希望的场景建立PTX替代高产生产系统和相关的紫杉烷。

生物模型用于插入和目标生物合成基因的表达提供容易使用的优势和规模。它们包括微生物等大肠杆菌,酿酒酵母(Vongpaseuth罗伯茨,2007)。植物等拟南芥和烟草sp.用于异位遗传转化,因为他们很容易改变,具备所有高等植物的代谢过程典型。

4.1代谢工程大肠杆菌和其他细菌

紫杉烷类的第一个试图获取在non-PTX-producing生物体利用原核系统基于大肠杆菌(黄et al ., 2001)。四个紫杉烷生物合成途径相关基因发生:两个特定基因编码taxadiene合成酶(tx)t .杂草和geranylgeranyl二磷酸合成酶(GGPPS)欧文氏菌herbicola和两个总萜烯生物合成的基因编码isopentenyl二磷酸合酶粟酒裂殖酵母和1 deoxy-D-xylulose 5-phosphate合成酶(dx)内生表达大肠杆菌。这四个转基因的成功表达大肠杆菌导致生产taxadiene 1.3 mg / L (黄et al ., 2001量),远低于获得水松种虫害细胞培养。虽然最终目的是重建整个PTX生物合成途径大肠杆菌原核中,引入复杂的真核生物的新陈代谢模型被证明是极其困难的。

使用multivariate-modular策略,taxadiene生产大肠杆菌提高了15000倍(1 g / L)工程本机methylerythritol-phosphate (MEP)通路(Ajikumar et al ., 2010)。第一个模块组成一个上游议员通路有八个基因,和四种基因的表达被认为是病原是调制。第二个模块由一个二基因下游taxadiene不等的途径。PTX P450-based氧化系统的生物合成大肠杆菌当时设计转换taxadiene taxadien-5α-ol,提供后续的合成代谢产物的基础通过类似的细胞色素P450 (CYP450)氧化。优化工程应变提高taxadiene-5α-ol生产2400倍相比,用酵母艺术的状态。这项研究表明,taxadiene严重抑制外源性吲哚的合成水平高于~ 100 mg / L。进一步提高吲哚浓度会抑制细胞生长,抑制的程度是高度strain-dependent。尽管吲哚的生化机制交互类异戊二烯途径目前不清楚,结果表明吲哚和萜类化合物的化合物之间可能的协同效应的类异戊二烯途径抑制细胞生长。一般来说,植物CYP725A4的功能表达大肠杆菌(埃德加et al ., 2017)是具有挑战性的,因为细菌平台的固有局限性,如缺乏电子转移机制和CYP450-reductases(碳污染减排方案)和转化膜的不相容信号模块的CYP450酶由于缺少内质网。

同年与前面的研究中,扁et al。(2017)甲羟戊酸途径和建立tx基因大肠杆菌。工程菌能够产生taxadiene,尽管在低量。此外,他们取得了第一个转移taxadiene-producing平台从细菌到丝状真菌主产。几个相关基因转录后修饰,包括那些表达细胞色素P450,很容易引入真菌使用农杆菌属系统。转换效率和taxadiene水平增加时强大的异种的推动者。

在不那么具有挑战性的方法中,大肠杆菌被利用为semi-synthesis生产紫杉烷中间体。Loncaric et al。(2006)获得转基因baccatin三世大肠杆菌这表达了DBAT基因和酰化添加外源性底物的能力,10-deacetylbaccatin III。

另一个taxadiene-producing微生物宿主,枯草芽孢杆菌168年,首次获得了阿卜杜拉et al。(2019)。它是植物的代谢工程过度表现tx基因和合成操纵子窝藏枯草芽孢杆菌议员通路中的基因一起当前基因(编码香叶和通过焦磷酸合成酶)。此外,一个向量携带crtE介绍了基因(编码GGPPS)增加GGPP供应。议员途径酶的过度当前和GGPPS基因导致了83倍增加taxadiene生产菌株相比只表达tx和依赖的天生的途径枯草芽孢杆菌。taxadiene总额由后者工程应变为17.8 mg / L,表明枯草芽孢杆菌PTX生产也可以是一个很好的平台。

然而,使用大肠杆菌和其他原核细胞异种的生产系统的植物代谢产物有几个限制因缺乏一个有效的类异戊二烯生物合成途径。此外,原核生物宿主倾向于产生目标蛋白质不溶性和非功能性的形式,和有一个有限的NADPH:细胞色素P450还原酶,是植物细胞色素P450的正确功能所必需的(Julsing et al ., 2006)。此外,原核生物缺乏真核细胞的划分,形成不同的细胞内环境,使空间和时间分配的中间代谢物在最终产品的形成。由于这些原因,真核单细胞生物酵母等吸引注意力,因为他们特性的典型membrane-enclosed细胞器真核生物和细胞各自为政,大多数专业的化合物的生物合成的基本要求。

4.2酵母代谢工程:酿酒酵母

德琼et al。(2006)产生了PTX中间taxa-4 (20), 11 (12) -dien-5α-10β-ol酿酒酵母转换的八19已知PTX生物合成的基因(GGPPS,tx,T5αOH,T10βOH,T13αOH,答,技术性贸易壁垒和DBAT在两个质粒)。在体外实验证明了重组蛋白的功能、免疫印迹证实了他们在活的有机体内表达式。GGPP和taxadiene检测系统中,展示融合蛋白的功能酿酒酵母,本机类异戊二烯前体IPP和DMAPP足以启动萜烯生物合成途径(德琼et al ., 2006)。然而,taxa-4 (20), 11 (12) -dien-5α-ol酶T5αH的产物,是在非常小的量,获得可比的大肠杆菌(黄et al ., 2001),比获得的水平低得多水松细胞培养(凯彻姆et al ., 1999)。另一方面,随后PTX通路中的紫杉烷不能检测,表明限制在代谢通量T5αH水平,增加taxadiene引入生产酵母。也在酿酒酵母,恩格斯et al。(2008)引入外源基因编码类异戊二烯生物合成的酶的早期步骤紫杉烷的新陈代谢,以及调节因子抑制竞争的途径。最高taxadiene内容时(8.7 mg / L)得到酵母中的以下基因:3-hydroxyl-3-methylglutaryl-CoA的截断版本还原酶(β-还原酶)同工酶1,不受反馈抑制;突变的监管蛋白质,UPC2-1;的GGPPS基因硫化叶菌acidocaldarius,这并不与类固醇合成;和一个codon-optimizedtx确保高层表达基因。更高的taxadiene生产(72.8 mg / L)是通过丁et al。(2014)在一个酿酒酵母共同表达最有效的应变GGPPS基因(由蛋白质建模和对接策略从八个不同的来源),erg20基因(编码通过二磷酸)截断HMGR基因,tx基因。

科斯林集团(Nowrouzi et al ., 2020)大大提高taxadiene生产酿酒酵母细胞培养维持在22°C利用启动子GAL1和一个工程TASY (tx)变体60-residue截断。确认后染色体整合导致taxadiene效价高于游离表达式,盒式含有一个氨基端酵母codon-optimized MBP标记TASY-ERG20 *融合基因是与增加的双重目的开发的先驱可用性和改善TASY溶解度。这个磁带染色体整合到两个位点,获得的应变LRS5 taxadiene水平57±3 mg / L小规模文化和129 mg / L在更大规模的文化保持在30°C。

同一研究小组(墙壁et al ., 2021)改进生产taxadiene taxadiene-5α-ol (T5αol)和醋酸taxadien-5-yl (T5αAc)酿酒酵母LRS6。应变是建于LRS5一样但的基因序列编码CYP725A4,它的同源细胞色素P450还原酶(CPR),和答基因的获得t . cuspidata。合成基因codon-optimized酿酒酵母表达式。除了taxadiene通常和其他产品时形成杂交酶tx活跃(例如verticillene isotaxadiene),产生的应变GGOH和其他二萜,以及一些含氧化合物如10月iso-OCT (5 (12) -oxa-3 -cyclotaxane(11)和5 (11)-oxa-3 -cyclotaxane(11),分别),通常发现的大肠杆菌overexpressing的CYP725A4基因(埃德加et al ., 2017)。多个化合物的形成从同一前体反应在一定程度上解释了低生产PTX紫杉烷的生物合成途径。在这项研究中,文化是扩大和优化条件。此外,提高了pH值控制,目标化合物的识别和量化方法。当使用1 L生物反应器,taxadien量5α必经yl乙酸量水平3.7 mg / L,那些taxadien 5α应承担的ol应承担的异构体的大约20 mg / L,和总含氧紫杉烷含量增加2.7折78 mg / L,在酵母迄今为止的最高数量。

在最近的一项研究中,旨在增加上游的生产PTX前体taxadiene, T5αol T5Ac,墙壁et al . (2022)改进的文化条件酿酒酵母LRS6 1 l生物抑制剂生物反应器。养分的影响压力被确定和解决通过增加文化养分供应。紫杉烷积累进一步加强在一个小规模的生物反应器通过使用统计最终筛选设计。最后,在最佳培养条件1 L生物反应器,主要产品是taxadiene二萜,最大效价为71±8 mg / L获得95 h的文化,尽管iso-taxadiene和对象verticillene也被发现。12二萜的产品进一步CYP725A4和乙酶被观察到。主要CYP725A4产品是以前确定潜在T5αol异构体二萜1最大效价为97±2 mg / L;iso-OCT 10月和T5αol中发现大量的16±3,44±3和42±4 mg / L,分别。所需的乙产品、T5Ac得到最大程度的21±0.3 mg / L,这是近3年来高于先前的最大值。这个改善紫杉烷的水平反映了优化取得的重大进展酿酒酵母文化和显示他们的潜力扩大工业规模生产力。

然而,T5αOH基因通常是不善表达在不同的主机和催化活性较低,不到10%的taxadiene T-5α-ol转换。其主要产品有10月及其异构体,iso-OCT,增加PTX通路的分支。就像在大肠杆菌,实现保持酶的活性的酵母细胞色素P450的活动限于依赖一个内生NADPH:细胞色素还原酶耦合电子流。进一步干扰是由端产品的形成和内源性代谢物的存在。因此,生产更多的、更高的biomass-producing和快速增长的异种的宿主植物提供了相当大的优势。这些包括代谢通量的控制和操纵通过改善酶表达,途径规定,代数余子式的可用性,和工程相互竞争的途径,以及从光合作用碳资源的可用性。

4.3植物代谢工程模型

利用模式植物的好处有自己的IPP的来源和质体DMAPP,部分PTX生物合成途径转移到答:芥(Besumbes et al ., 2004)。在引进的tx基因的控制下的本构CaMV 35 s启动子,taxadiene是纯合的植物,表明重组蛋白质的功能答:芥。然而,观察一些有害的影响,比如减少下胚轴长度、叶变色,减少生长和开花(Besumbes et al ., 2004)。可能的解释可以taxadiene的细胞毒性,或持续活跃tx基因干扰萜烯的合成植物发展至关重要,如赤霉素或类胡萝卜素。的负面影响tx将表达式随后被避免txglucocorticoid-inducible启动子基因的控制下,从而防止代谢GGPP重定向到萜烯途径在植物生长与发展(Besumbes et al ., 2004)。然而,尽管有害表型的比例减少,taxadiene生产保持在低位。工厂使用相同的模型,造成et al . (2010)表达了tx基因答:芥(生态型Columbia-0)转换农AGL1携带质粒pTA-TXS-His。转换和转基因表达被证实,尽管taxadiene生产没有测量。

几项研究也成立烟草不同的文化表达PTX生物合成的基因。的使用烟草种虫害有利是因为其高生物量、复杂的次生代谢,容易培养在活的有机体内和在体外。在2008年,Rontein et al。(2008)介绍了tx和T5αH基因在野生烟草(烟草的抗旱性)生产cembratrien-diol敲门后。植物转换进行使用农杆菌属LBA4404携带taxa-4(5), 11(12)二烯合酶CYP725A4特定的基因表达在细胞毛状体。然而,而不是T-5α-ol,转基因植物产生了环醚,5 (12)-oxa-3 (11) -cyclotaxane(10月),发生在大肠杆菌和酿酒酵母overexpressing相同的基因。

烟草benthamiana植物ectopically tx基因表达产生多达27μg / g taxadiene干重(哈桑et al ., 2014)。叶的光盘n benthamiana是改变了农和由此产生的纯合子taxadiene内容植物与法案增加了启发。然而,最高水平的taxadiene 50µg / g(干重)获得了沉默后八氢番茄红素合成酶(小组)和茄红素desaturase (PDS)基因转移对tetraterpene GGPP生物合成而不是让它自由等二萜的合成紫杉醇。

最近,(李et al ., 2019)是暂时性的改变n benthamiana通过co-infiltration不同的菌株农GV3101。部分PTX工程在生物合成的途径n benthamiana通过划分tx和T5H-CPR融合构造(T5H和心肺复苏编码taxadiene 5α-hydroxylase,细胞色素P450还原酶,分别在叶绿体),使用本机tx信号肽作为chloroplast-targeting肽。这种划分策略结合增强前体可用性和引导对co-expression紫杉烷生物合成的碳dx(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate合成酶)和GGPPS(GGPP合酶)基因导致的积累相对高水平的taxadiene(56.6±3.2μg g⁻¹鲜重),最重要的是,taxadiene-5α-ol(1.3±0.5μg g⁻¹鲜重)。很明显,inter-organellar运输紫杉烷中间体是一个主要的障碍在植物PTX生产系统,阻止访问内质网的cyp450 plastid-localized二萜基板。

tx叶绿体酶,傅et al。(2021)建立transplastomicn .烟草简历。佩蒂特哈瓦那,目的是生产taxadiene这些细胞器。令人惊讶的是,在植物中表达获得的水平tx在叶绿体基因非常低,胞质。然而,当tx携带叶绿体转运肽在细胞核表达,taxadiene叶绿体明显增加。结果表明,这个中间的运输叶绿体及其转录后修饰对taxadiene形成的高水平很重要。

尽管这里描述的重要进步,T5αH仍然是最主要的瓶颈之一PTX生物合成途径,由于其贫困活动生成T5αol及其设施生产端产品,争夺相同的前兆。杠杆优化了合成生物学的工具T5αH表达式和活动,包括截断,启动子优化、CPR优化,区分工程在植物细胞器和使用riboregulated可切换的反馈促进剂(rSFPs)。计算和实验的方法也被用来提供新的见解的催化机制tx和T5αH (Mutanda et al ., 2021)。

工程PTX生产在不同的主机是一个有前途的,也非常具有挑战性的任务。除了这里列出所有的困难,许多的生物合成的酶尚未阐明,从而防止异种重构整个通路(Courdavault et al ., 2020)。其他的差距我们理解PTX新陈代谢包括的监管和控制机制,这也限制了合成生物学的方法来生产。

最近,熊et al。(2021)完成了的chromosome-level基因组t对var. mairei。他们的研究显示,一些PTX生物合成基因共享相同的染色体位置和确定一个基因簇表达tx和T5αH,激活酸盐。他们还发现不同基因编码酶具有相同的功能,但有不同的规定。本研究产生的新知识和先前的代谢研究,结合计算工具的应用,将促进发现失踪步骤PTX生物合成及其调控。这样,潜在的生物技术系统的大规模生产这种重要的抗癌药物可能会实现。

5对紫杉烷生产挑战和视角

的障碍仍在几十年的研究水松种虫害无疑是其遗传转化的困难,其次是其适应不良在体外系统。这些障碍导致了一场激烈的寻找不同的系统,更友好的转换和栽培技术。但这些系统同时揭示了紫杉烷的合成背后的隐藏的复杂性。说到不同的植物系统,各种各样的竞争途径或酶代谢紫杉烷前驱代表最大的挑战的能力。剩余的真核系统中,所有的生物合成步骤的缺乏知识以及外源蛋白质的溶解度问题用来重建紫杉烷的合成代表最大的任务。原核细胞而言,没有必要大量的代谢途径产生的前兆,外源蛋白质的溶解度低,生成的化合物的潜在毒性的主要障碍。与最近的测序水松种虫害基因组以及酶工程使用的计算工具的进步Mutanda et al ., 2021),紫杉烷的生物技术生产将主要支持不同的系统。

作者的贡献

EP-M、MB和摩根大通:提出想法的构想;EP-M DH-M:原创作品准备草案;MAA和AE:图处理和数据采集;MB,摩根大通、DH-M和EM:审查和编辑。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由西班牙科技部创新,与项目数量pid2020 - 113438 - rb - i00 AEI / 10.13039 / 501100011033。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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引用

阿卜杜拉,我。。Pramastya, H。,Van Merkerk, R., Sukrasno, Quax, W. J. (2019). Metabolic engineering of bacillus subtilis toward taxadiene biosynthesis as the first committed step for taxol production.前面。Microbiol。10。doi: 10.3389 / FMICB.2019.00218