NTR1通过中介参与热应力宽容的热应力的基因表达调控和可变剪接拟南芥
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你们金
华中史
译王
射杀杨- 1华中师范大学生命科学学院,武汉,湖北,中国
- 2化学和生物化学、德州理工大学卢博克市,美国TX
常见的不良环境因素,热应力(HS)不仅彻底地改变植物转录组的转录水平也增加可变剪接(),特别是基因内区保留(IR)事件。然而,确切的机制还不清楚。这里,我们报道,NTC-related蛋白1 (NTR1),它充当一个附属组件的剪接体拆卸,对于这个过程是必要的。突变体的NTR1,本文分别插入和点突变通过乙确定显示(EMS)诱变筛选,容易受到海关,它指示NTR1对植物耐HS至关重要。在分子水平上,基因的响应反应温度和热刺激高纯度的燥热引起,但低表达ntr1突变体。此外,大部分商品,如热休克反应(高铁)基因转录因子(hsf)和热休克蛋白(休克)热处理引起的,和更多的事件,尤其是红外事件,是热处理中发现的ntr1突变体。此外,HS压抑的表达NTR1和NTR1-associated复杂的组件。因此,很有可能在海关,植物减少了NTR1的表达- - - - - -相关的复杂实现高铁的快速要求转录基因hsf和休克等,进而导致不当拼接尤其是红外产品的积累,最终导致危害植物。
介绍
近几十年来全球变暖加速和极高的温度经常发生,热应力(HS)成为越来越多的不利因素影响植物的生长和发展,特别是农作物的产量(Dusenge et al ., 2019;Jagadish et al ., 2021)。HS影响植物的生理和生化过程,如损害光合活动,呼吸,和水代谢(赵et al ., 2020;Jagadish et al ., 2021)。无柄,植物进化出精致的系统来抵消这些不利条件和表现出某些商品宽容。植物快速响应HS与新的蛋白质组或产生的代谢产物,如分子陪伴和抗氧化酶,实现某种程度上的HS电阻(Jespersen 2020)。
在分子水平上,当遇到海关,植物细胞重新编程的转录组主要通过热休克转录因子(HSF)热休克蛋白(HSP)调节子。植物hsf刺激通过海关和海关响应中发挥核心作用,调节下游HS响应(高铁)基因的表达,如热休克。例如,HSFA1s充当主监管机构拟南芥因为他们激活其他转录因子的表达(TFs)DEHYDRATION-RESPONSIVE元素结合蛋白2 a(DREB2A),HsfA2,HsfA7a,HsfBs,1 c MULTIPROTEIN连接因素(MBF1C),hsfa1s四倍的突变体(hsfa1a/hsfa1b/hsfa1d/hsfa1e)表现出严重减少的耐热性和降低高铁诱导基因(吉田et al ., 2011;Ohama et al ., 2017)。HsfA2是海关引起的急剧扩展所需的获得耐热性(在)(Charng et al ., 2007;Lamke et al ., 2016)。在拟南芥报道,HsfB1 HSFA2阻遏镇压表达式,A7a, B1和B2b (Ikeda et al ., 2011)。然而,hsfb1 hsfb2b双突变体显示下降比野生型(Ikeda et al ., 2011),这表明HsfBs也促进高铁拟南芥。
热休克伴护蛋白质引起的商品以及其他压力。他们不仅函数错误折叠蛋白质的复性由压力引起的但也参与hsf的翻译后调节。例如,HSP70和一半寿命可以通过与温度有关的镇压与HsfA1s交互(TDR)域HsfA1s镇压HsfA1 transactivation活动和核本地化(哈恩et al ., 2011)。在海关,增加导致离解HSP70 /错误折叠蛋白质从HsfA1s释放HsfA1s可能促使核激活下游TFs (Ohama et al ., 2016)。
非编码rna也从事高铁的监管。MiR398的直接目标HsfA1并迅速引起海关。的目标miR398活性氧(ROS)清除基因。诱导miR398导致活性氧积累,然后激活HsfA1,形成一个正反馈循环(关et al ., 2013)。MiR156也是诱导通过miR156-SPL HS和调节HS内存(SQUAMOSA-PROMOTER BINDING-LIKE)模块(Stief et al ., 2014;赵et al ., 2016)。的目标ta-siRNAs (TRANS-ACTING小干扰rna)和HTT1/2(燥热引起TAS1目标1/2)被激活HsfA1a和海关引起的。然而,过度的TAS1a导致耐热性下降随着TAS1-siRNAs的表达增加,从而减少HTT1/2表达式(李et al ., 2014)。
可变剪接(因为),利用可变剪接网站形成不同的成熟的信使rna,是真核生物的关键过程,丰富gene-encoded产品也是一个重要的方式来调节基因的功能。压力促进了植物的事件,这导致不正常的积累产品(Laloum et al ., 2018)。此外,正如可能执行一个重要的角色在监管的关键球员植物应激反应(凌et al ., 2021)。例如,严重的商品导致HsfA2生成一个剪接变体,它编码一个小截断HsfA2同种型(S-HsfA2)。S-HsfA2只发现在商品或商品后的恢复期和函数作为激活HSF HsfA2表达式(刘et al ., 2013)。HS诱发DREB2A变体的生产记录,形成截短蛋白没有DREB2A降解所需的c端域(Vainonen et al ., 2012)。bZIP60,基本leucine-zipper domain-containing转录因子,展开与蛋白质反应(UPR)拟南芥。HS-induced UPR原因bZIP60移除一个23个基点序列,导致易位bZIP60的内质网(ER)到核(邓et al ., 2011;丁et al ., 2020)。此外,HS引起更多的全球事件尤其是基因内区保留(IR)事件与高等植物的正常条件下相比,这可能源于HS-induced pre-mRNA拼接的障碍,或成为一个适应HS (凌et al ., 2018;凌et al ., 2021)。拼接的组件机械本身也在海关监管下,主要从报道剪接因子丝氨酸/ arginine-rich (SR)蛋白质,RNA结合,促进pre-mRNA拼接(凌et al ., 2021)。例如,HS诱发SR30产生更多的mRNA变体编码的长篇SR30蛋白(Filichkin et al ., 2010)。商品不仅促进SR45a还增加外显子的转录跳过(ES)的第5外显子SR45a形成一个完整的SR45a蛋白与一个完整的c端包含一个arginine-serine重复(RS)域(Gulledge et al ., 2012)。然而,海关是如何导致的增加,特别是红外事件高植物和剪接体的其他组件或配件是否参与高铁还没有明确的规定。
NTR1 (NTC-related蛋白1),也叫SPLICEOSOMAL计时员LOCUS1 (STIPL1),是一个附属组件之间散播他们的参与剪接体拆卸和守恒的动物和植物(Dolata et al ., 2015)。一起在植物,NTR1 Polyploidy1-1D水平增加(ILP1) DEAH-box-containing RNA解旋酶PRP43, PRE-MRNA处理8 (PRP8)、小核RNA(核内小RNA),或其他组件形式intron-lariat剪接体(ILS)的复杂,这是拆除在剪接体周期的最后阶段回收剪接因子(王et al ., 2019)。在拟南芥,NTR1突变以来昼夜节律调节是至关重要的NTR1原因的拼接circadian-associated基因(琼斯等人。,2012年)。此外,NTR1促进微rna (microRNA的)生物起源与ILP1协助microRNA的(MIR)基因的转录、剪接拟南芥(王et al ., 2019)。在这里,我们报告NTR1中扮演着重要的角色在促进植物HS宽容,NTR1突变导致mis-expression和假基因拼接的高铁增加,造成表型越容易受到海关ntr1突变体,HS抑制NTR1-associated复杂的表达。
材料和方法
植物材料和生长条件
本文分别突变体的NTR1和他们的同族体基因STPL2被称为salk_073187c (ntr1-1)(Dolata et al ., 2015)和cs315805 (stpl2-T)(琼斯等人。,2012年),ILP1被称为salk_030650c (ilp1-1)。乙的建设显示出(EMS)诱变池是前面描述的(沈et al ., 2016)。突变体hl761从EMS诱变筛选得到的吗pHSP18.2:卢克热处理后在Col-0 LUC活动增加。背景pHSP18.2:卢克Col-0转基因线指的是控制植物(CK)。植物种子被种在一半Murashige和斯库(MS)固体培养基发芽,然后转移到土壤生长在温室下光:黑暗(LD)光周期16小时光和黑暗8小时22°C到25°C。
热应力的治疗方法
得分HS宽容的表型,发芽后7天(DAG)幼苗一半盘子女士接受连续热暴露(38°C) 16 h孵化器(mir - 154、三洋、东京、日本),然后搬到22°C到5天恢复。幼苗生长22°C在同一时间被用于消极的控制。
荧光素酶成像分析
7-DAG幼苗在半盘子女士治疗1 h在38°C第一,然后是吕克·活动对植物是用电荷耦合器件(CCD)相机成像(DU934-BV,和或技术,南温莎,CT,美国)后喷洒1毫米的d荧光素Triton x - 100年的0.1%。LUC信号捕获和处理使用和或索利斯软件。
RNA提取和RT-qPCR
RNA提取从10-DAG苗女士盘子的一半。热处理,10-DAG幼苗受到在38°C的设计时间,收集,然后瞬间冷冻在液氮RNA提取利用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。半定量PCR和RT-qPCR互补dna合成使用'脚本™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类、前桥市、日本)。RT-qPCR ABI棱镜上执行7900年ht序列检测系统使用AceQqPCR SYBR绿色主人混合(高火箭燃料混合)Q141(中国南京)TUB2(AT5G62690)是用作内部控制。列出使用的引物表S2。
RNA-seq和分析
RNA-seq实验,10-DAG幼苗hl761突变体和控制植物(CK)被用作材料。幼苗被收集在三个时间点的热处理(38°C),这是在热处理之前,下半场和点热处理。两个生物复制用于分析。总RNA提取使用RNeasy +迷你包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示。rna被Illumina公司HiSeq 2500测序平台在公司Annoroad(中国,北京)。RNA-seq读取是一致的拟南芥参考基因组(TAIR10)使用HISAT2 (金正日et al ., 2019),基因数量决定使用HTSeq (安德斯et al ., 2015)。差异表达基因(度)与Bioconductor包DESeq2 (爱et al ., 2014)在R语言褶皱变化≥1.5或≤2/3的错误发现率≤0.05(罗斯福)。基因本体论(去)富集分析分析了使用agriGO (田et al ., 2017)。微分作为事件,分析rMATS(阈值为0.05和错误发现率≤0.05)(沈et al ., 2014)。
组织学分析β-glucuronidase染色
大约10天大的幼苗的转基因植物表达pNTR1:格斯长在女士中,被用来作为材料的一半。在收获之前,植物热处理在38°C 1 h或保持在22°C控制。然后,苗孵化90%丙酮在β-glucuronidase冰大约30分钟,染色(格斯)染色解决方案(100 mM的磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,亚铁氰化钾的0.5毫米,0.5毫米的铁氰化钾,0.1% Triton x - 100和10毫米的EDTA, pH值8.0,10%甲醇和1毫米X-gluc)。GUS染色水平与ImageJ量化。
结果
的识别NTR1突变体hl761
寻求高铁的主要监管机构,我们构造了一个EMS突变体与植物池窝藏记者萤火虫荧光素酶基因(LUC)启动子驱动的拟南芥HSP18.2引起的,这是快速和高度HS (高桥和Komeda, 1989;Matsuhara et al ., 2000),筛查突变改变了卢克的活动。一个突变体,hl761高亮度(hl),表现出明显的LUC活动增加相比,控制植物在38°C(1小时热处理后图1 b, C)。通过映射,在基因点突变本地化NTR1(AT1G17070)被确认,这导致G过渡第656位核苷酸,反过来导致第219位氨基酸变化从甘氨酸谷氨酸(G219E) (图1一个)。NTR1蛋白质包含三个守恒的领域:Tuftelin互动蛋白质N终端(TIP-N)域N端,G-patch域(GP)中间,和GC-rich序列dna结合蛋白因子蛋白c端(GCFC)领域。的位置hl761GP域局部突变,有七个高度保守的甘氨酸残基,出现在许多RNA结合蛋白的RNA绑定函数(图S1)。确认增加是由于LUC活动hl761突变,我们走过hl761一个报道NTR1本文分别插入等位基因ntr1-1(salk_073187c) (Dolata et al ., 2015),然后得分LUC活动后38°C热处理。正如所料,F1的植物hl761交叉ntr1-1显示类似的程度增加的LUC活动(图1 d, E)。我们还做了另一个测试通过引入互补pNTR1: NTR1来hl761突变体。结果表明,NTR1可以完全恢复LUC表型,作为两个独立的参考转基因线表现类似于控制植物LUC活动(图2 a, B)。基因的表达水平卢克和本地HSP18.2也被量化。虽然两卢克和HSP18.2海关引起的高度,表达水平要高得多hl761比在控制植物突变体(图2 c, D),这是符合的卢克蛋白质的活动。在一起,这些结果表明,NTR1变异占LUC的急性增加hl761突变体。
图1突变体hl761港口的点突变NTR1。(一)图表的位置hl761突变基因和蛋白质。黑色的三角形显示了本文突变体插入的地方ntr1-1。颜色框在较低的面板显示NTR1的守恒的域。TIP-N Tuftelin蛋白质N交互终端域;GP, G-patch域;GCFC, GC-rich序列dna结合蛋白因子蛋白质域。(B)吕克·活动38°C 1小时热处理hl761突变体和控制植物(CK)种苗。(C)量化的LUC活动幼苗所示(B)误差棒代表SE, n = 20。(D)LUC cross-complementation测试活动。样本38°C热处理1 h。(E)量化的LUC活动幼苗所示(D)误差棒代表SE, n = 10。n。一个,不适用;CK、背景线hl761。。
图2燥热引起高LUC活动hl761之外,还介绍了NTR1。(一)38°C LUC活动1小时热处理控制植物的幼苗(CK),hl761突变体,和两个独立的补偿的参考线,单一的复制pNTR1: NTR1转基因。(B)量化的LUC活动幼苗所示(一)误差棒代表SE, n = 20。(C)相对表达的本地HSP18.2在38°C 1小时热处理CK的幼苗,hl761和补偿的1号线(Com1)。CK的表达式是相对于没有热处理。误差线指示三个生物复制的SD。(D)卢克基因表达在38°C 1小时热处理CK的幼苗,hl761和补偿的1号线(Com1)。CK的表达式是相对于没有热处理。误差线指示三个生物复制的SD。(* *星号显示统计学意义差异在学生t p < 0.01)。CK、背景线hl761。
NTR1对植物耐HS至关重要
接下来,我们推测NTR1是否有功能植物高铁,所以我们得分的高铁表型hl761。不喜欢控制植物,hl761突变体不能恢复16 h的连续热处理在38°C,而补偿的行幸存下来几乎一样的控制(图3 a, B)。此外,ntr1-1零,本文分别插入等位基因,也敏感商品治疗(图3 c, D和图S2),这表明NTR1对植物HS宽容是至关重要的。STIPL2的相同器官NTR1这两个蛋白质之间,有61.27%相似。高保护在于G-path域和c端GCFC域而不是n端TIP-N域这两个蛋白(图S1)。有趣的是,衰减的STIPL2孤独并没有导致减少的零本文突变以来的耐热性STIPL2表现一样的野生植物(图3 c, D和图S2)。巧合的是,尽管G-path域显示高保护NTR1和STIPL2之间的精氨酸STIPL2取代甘氨酸在glycine-rich NTR1守恒的核心区域(图S1),这也许可以解释函数的变化对热应力的监管。然而,我们不能排除可能的功能STIPL2自从wild-type-like表型可能是由于功能之间的冗余NTR1和STIPL2,也没有双突变体所暗示的事实ntr1-1 stipl2-T或者是hl761 stipl2-T可以获得,因为双突变体胚胎可能是致命的,不能正确设置种子。
图3NTR1工厂需要热应力宽容。(一)热应力CK的表型,hl761,两个补偿的线。离开,幼苗在38°C热处理16 h,然后恢复22°C。相同时间的幼苗是保持在22°C。CK、背景线hl761。(B)热处理CK的存活率,hl761,两个补偿的线。误差线指示三个生物复制的SD。(* *星号显示统计学意义差异在学生t p < 0.01)。(C)热应力本文分别插入突变体的表型NTR1及其同族体STIPL2。离开,幼苗在38°C热处理16 h,然后恢复22°C。相同时间的幼苗是保持在22°C。(D)热处理坳和本文分别插入突变体的存活率NTR1和STIPL2。误差线指示三个生物复制的SD。星号表示统计学上显著差异(ns,没有意义;在学生的学习任务* * p < 0.01)。
除了敏感商品,hl761突变体植物显示表型,如工厂规模小,小叶子和地面,根长和短,类似于本文等位基因ntr1-1(数字S3A-D)。的表达模式NTR1本构的植物,因为它可能是所有植物中发现部分(图S3E)。
NTR1基因突变导致高铁mis-expression在海关
调查HS宽容监管的机制NTR1,特别是在高铁的哪个阶段NTR1可能的影响,我们进行转录组测序与控制(A)和植物吗hl761(B)突变体在三个时间点的热处理38°C: 0, 15, 60分钟(图4一;RNA-seq流程图所示图S4)。通过主成分分析(PCA),所有的样品可以在二维的歧视。显然,热处理的主要因素,点热处理样品显然是分开其他人(图4 b),而15分钟的分布非常接近未经处理的(图4 b),表明植物下半场热处理就躺在高铁的早期阶段。PC2,根据植物基因型(植物被歧视图4 b),表明突变NTR1导致分离。看着度时,下半场治疗引起的一小部分基因表达改变遗传背景(571调节和371年下调369年控制和调节和286个表达下调hl761)(图4 c,表S1);然而,更多的基因表达改变60分钟(3752调节和3717年下调3637年控制和调节和3382个表达下调hl761时间点相比,15分钟)(图4 c;表S1),这表明点热处理足以引起巨大的基因表达在植物响应。虽然比较hl761和控制植物,商品数量也增加了度(495年调节和未经处理的536个表达下调,709年调节下半场治疗和740个表达下调,和1445年调节和1531点次下调点)(图4 c;表S1)。考虑的数量调节和表达下调基因,热处理导致类似规模的改变基因治疗不同时期和不同的遗传背景(图4 c)。
图4热应力触发植物基因表达变化。(一)RNA-seq热应力的实验设计。(B)主成分分析(PCA)的样品测序。(C)差异表达基因(度)不同样本之间的数字。盒子y值代表的0轴调节度,和箱子0轴以下代表度使之抑制。度的数量显示在盒子里。(D)基因本体论(去)注释分析度的生物功能hl761与CK (B_A)热处理的三个时间点。CK、背景线hl761。y轴表示基因的一部分去。
更清楚的了解NTR1调节植物的耐热性,我们执行去注释分析生物度的函数。正如所料,当比较不同时间点的热处理,对于这两个基因型,反应温度的条件刺激,反应加热,热适应大大丰富了燥热引起基因(A2_A1, A3_A2, B2_B1, B3_B2) (表1)。然而,这不是heat-repressed基因。很有趣的术语应对寒冷也丰富燥热引起的基因(表1),表明这些基因可能对冷和热。当比较两个基因型之间的度,走的有节奏的过程大大丰富了所有三个时间点(B1_A1, B2_A2, B3_A3) (图4 d),这是同意的角色NTR1昼夜节律的监管。另一个丰富词在三个时间点是反应温度刺激(图4 d),表明突变NTR1在刺激反应基因的表达变化的结果,这是可以理解的,作为观察耐热性下降hl761突变体。此外,显著富集的术语对反应温度和热刺激对所有三个时间点观察,尤其是对点热处理两个方向的基因表达调节和表达下调)(表1),这表明商品可以显著引起高铁的mis-expression基因hl761突变体。
表1基因的反应对温度刺激和反应加热浓缩(度)之间的差异表达基因在不同时间的热处理或不同的基因型。
与此同时,当比较常见的度hl761与热处理的控制不同时期,绝大多数的共同度是0 -和下半场热处理调节和表达下调基因(B1_A1和B2_A2) (图5 a, B),点热处理明显放大度的数量(B3_A3) (图5 a, B)。然而,当比较的度hl761与点的控制热处理(B3_A3) heat-inducing (A3_A1)或heat-repressing基因(A3_A1向下),之间未发现明显的重叠基因表达下调hl761(1531年几乎一半,676)和heat-inducing的(图5 c),同时调节基因之间hl761(654 1445)和heat-repressing的(图5 d)。仔细检查这些常见的度,在676点热处理燥热引起更少hl761,反应对温度刺激和反应方面去热最显著富集的两个(图5 e)。基因的表达词反应点热处理引起的加热大幅但表达的更少hl761突变体相比,控制植物(图5 f)。然而,对于基因heat-repressed和调节点热处理hl761,没有明显的浓缩温度有关条款被发现。因此,这些燥热引起但表达下调hl761高铁基因可能占低的耐热性hl761突变体。
图5NTR1促进高铁热应力下基因转录。(A, B)维恩图之间的共同基因的调节(一)和表达下调(B)度在hl761与CK热处理的不同时期。CK、背景线hl761。(C)维恩图显示了显著的热应激和重叠度使之抑制hl761与CK在38°C点治疗。(D)维恩图显示了显著的热stress-repressed和调节度之间的重叠hl761与CK在38°C点治疗。假定值(确切概率法)之间的重叠基因标记集。(E)基因本体论(去)注释分析所示的676个常见基因的生物学功能(C) (F)。所示的676个常见基因表达的热图(C)热图显示每个基因的FPKM的z分数值。高铁、热应激反应;度,差异表达基因;FPKM,每千碱基片段每百万映射外显子片段。
然而,如果比较不同热处理时间的度相同的背景(A2_A1, A3_A2、B2_B1 B3_B2),燥热引起和heat-repressed基因,度hl761极其的重叠与控制(数字S5A B)。因此,hl761共享一套共同的基因,以应对海关的控制植物基因表达水平;换句话说,中断NTR1不影响对植物海关作出回应的能力。
很大一部分的HSF年代和HSP年代不太热引起的hl761突变体
进一步探索的功能在高铁基因调控NTR1 HS和验证RNA-seq数据,我们量化的表达hsf实时PCR和休克。20个基因(图6)检查相同的治疗RNA-seq样本,19显示一个类似的趋势变化两两基因型之间和不同的处理时间。检查所有的基因被诱导热,特别是点治疗除外HSFA4C。他们中的大多数并不诱导hl761突变体在点控制热处理相比,等HSFA1D,HSFA3,HSFA7A,HSFA7B,HSFA1B,HSP23.5,HSP60,HSP70,HSP89.1,HSP90.7,HSA32(热应力相关的32),ROF1,BAG6(BCL-2-ASSOCIATED ATHANOGENE 6)(图6和图S6)。然而,一些基因等HSFA1E,DREB2A,HSP18.2,HTT1,HTT2,HTT3显示更多的表达hl761点热处理(图6和图S6)。等HSFB1,HSFB2A,HSFB2B,HSFA2,HSP101,HOP3,APX1没有明显的差异(图6和图S6)。在早期阶段(HS下半场治疗),HSFA7A和HSFA7B强烈热引起的背景,但都不太表达吗hl761突变体(图6)。与RNA-seq结果一致,这些数据表明,高铁的mis-expression基因的综合影响,尤其是少诱导hl761HS宽容,导致降低的突变体。
图6很大一部分的HSF年代和HSPs是表达下调,NTR1突变在热应力。基因表达在CK和幼苗hl761在热处理之前,和15分钟和60分钟38°C热处理被量化。表达式是相对的CK在热处理之前。误差线指示三个生物复制的SD。星号显示统计上显著的差异(p < 0.05, * * *在学生t p < 0.01)。CK、背景线hl761。。
NTR1高铁基因的变异放大了mis-splicing海关引起的
作为其重要作用的报道NTR1监管,我们推测NTR1是否在海关也参与控制。我们分析了微分rMATS不同样本之间的。很明显,热处理,特别是点热处理,促进植物,急剧增加的IR和跳过外显子(SE)控制和事件hl761突变体(A3_A2和B3_B2)而更IRhl761对60 -vs。下半场热处理(B3_B2) (图7)。当比较两个基因型之间的事件,发生在许多红外事件hl761没有热处理(B1_A1) (图7),与以前的报告一致(凌et al ., 2018)。点热处理可能诱发所有类型的事件很明显(B3_A3),更多的红外和SE事件(图7)。
图7NTR1变异放大了高铁热应力引起的基因拼接的替代办法。(一)微分之间的事件相比,植物与热处理的不同时间或不同基因型之间。A3SS替代3′拼接网站;投产,替代5′拼接网站;得到,互斥的外显子;红外光谱、基因内区保留;SE,跳过了外显子。(B)维恩图之间的共同基因与不同的事件hl761突变体和CK在不同时间的热处理。(C)维恩图共同的基因与不同的事件和度hl761与CK点后热处理。(D)维恩图之间的共同基因的基因与不同的事件hl761与CK点后热处理和耐热诱发或heat-repressed基因点热处理。(E)维恩图之间的共同基因的基因与不同的事件hl761与CK点后热处理和基因与燥热引起的事件。(F)热应激反应的例子(高铁)基因改变引起的热应力。CK、背景线hl761;作为可变剪接;度,差异表达基因。
考虑基因与微分,就像度,热处理明显夸大了的数量不同拼接基因(B2_A2 B1_A1 341, 622,和1689年B3_A3) (图7 b, F)。去分析这些基因在生物过程hl761点下热处理(B3_A3)显示,除了RNA代谢过程相关的条款,条款对温度刺激响应和反应加热明显丰富图S7)。我们也检查了事件数高铁通过rt - pcr基因。大多数基因研究显示更多的红外光谱hl761比点热处理后的控制,如HSFA2,HSFA4A,HSFA7A,HSFA7B,HSFB1,HSFB2A,HSFB2B(图8),尽管其中一些(HSFA2,HSFB1,HSFB2A,HSFB2B,HOP3,APX1显示没有明显的差异表达hl761或更高的hl761点热处理后(HSFA4A,HTT2,HTT3)。
图8NTR1基因突变改变了的HSF年代和HSP在热应力。三个生物学重复。凝胶以下照片是基因结构的示意图。灰色框表示外显子,黑匣子显示5′和3′utr,注明内含子之间的线,蓝线显示rt - pcr引物的位置。CK、背景线hl761;可变剪接。
因此,有趣的是知道之间的联系和基因转录。我们检查了共同的基因之间的差异五香(B3_A3)和度点热处理hl761与控制(B3_A3 B3_A3下来)。令人惊讶的是,只有一小部分基因差异表达(约20%),也没有明显的偏向于NTR1提升或抑制基因(图7 c)。大多数的转录基因(1322 1689)是相似的两国背景(图7 c)。然而,大约一半的B3_A3作为基因的表达是热响应,超过三倍燥热引起(532 1689)heat-repressed基因(166 1689)(图7 d)。此外,观察高重叠燥热引起的(A3_A1)和NTR1-dependent (B3_A3) (图7 e),这表明在海关,变异的NTR1可能会导致类似的燥热引起的事件。所有这些数据暗示NTR1不仅影响基因转录功能维持正常基因拼接的高铁在海关。
NTR1显示了一个偏爱阻碍intron-containing基因的表达
在拟南芥大约三分之一的基因没有内含子从基因注释TAIR 10(数据)。剪接体的附属组件,NTR1参与pre-mRNA拼接。我们的数据表明,NTR1也影响基因转录,并没有明确的偏见是观察基因镇压或晋升。然后,它是有趣的转录、剪接之间是否有任何联系。我们比较了度hl761离散时间的热处理有或没有内含子的基因。NTR1-promoted基因(B_A下来),更多的基因与基因内区受到影响比没有内含子的基因(比例约为3:1 B1_A1和B3_A3表达下调基因)(图9 a - c)。然而,对于NTR1-repressed基因(B_A), NTR1影响更intron-containing基因(比例超过10:1热处理的所有三个时间点)(图9 a - c),尽管基因影响的完全相似尺度两个方向(调节和表达下调)。因此,NTR1优先为intron-containing抑制转录的基因,这是可以理解的参与NTR1的剪接体拆卸复杂。没有内含子的基因,其中大约一半是蛋白质翻译拟南芥。其中,NTR1有更多影响蛋白编码基因的表达促进和抑制表达,同时促进更频繁(超过10:1没有编码基因的蛋白质编码)(图9 d-f)抑制(比例大约4:1)(图9 d-f)。
图9NTR1显示了一个偏爱阻碍intron-containing基因的表达。(两者)维恩图度之间的共同基因hl761突变体vs。控制植物(CK)在热处理之前(一),下半场(B)和点(C)热处理和intron-containing基因或基因内区。(D-F)维恩图度之间的共同基因hl761突变体vs。控制植物(CK)在热处理之前(D),下半场(E)和点(F)热处理和总没有内含子的基因或蛋白编码基因子集。度,差异表达基因。
HS抑制的表达NTR1和组件的NTR1-associated复杂
NTR1植物至关重要商品的监管宽容和高铁在HS基因表达。我们调查是否的表达NTR1本身是由海关监管。然后,NTR1热处理后表达水平检查。有趣的是,1小时热处理在38°C近三分之二的资金将会减少NTR1表达式(图10、B),这表明NTR1表达式由海关镇压。进一步确认压制效果NTR1HS表达的转基因植物窝藏格斯报告基因的NTR1启动子(pNTR1:格斯)受到热处理1 h 38°C。正如预期的那样,格斯信号明显减少热处理后(数字10 c, D),确认的镇压NTR1通过海关。
图10HS抑制的表达NTR1和其他组件的NTR1-associated复杂。(一)Semi-quantification的表达NTR11小时后热处理在38°C。(B)的表达NTR11小时后热处理在38°C qPCR量化。表达式是相对于未经处理的样品。误差线指示三个生物复制的SD。(* *星号显示统计学意义差异在学生t p < 0.01)。(C)β-Glucosidase(格斯)的染色pNTR1:格斯转基因植物没有(左)(右)和38°C 1小时热处理。酒吧= 1毫米。(D)格斯强度的量化植物面板(C)误差棒代表SD, n = 20。(* *星号显示统计学意义差异在学生t p < 0.01)。(E)相关的表达ILP1,PRP43a,PRP8在38°C 1小时热处理CK和幼苗hl761。CK的表达式是相对于没有热处理。误差线指示三个生物复制的SD。星号显示统计上显著的差异(p < 0.05, * * *在学生t p < 0.01)。CK、背景线hl761;海关,热应力。
与ILP1 NTR1以来参与的复杂,PRP43, PRP8与ILP1密切相关,我们推测其他复杂组件的突变是否也会引起植物的减少HS宽容。毫不奇怪,ilp1突变体表现类似于ntr1突变体与减少公差HS (图S8)。因此,我们推测,海关也会导致其他组件的抑制NTR1-associated复杂。正如预期的那样,就像NTR1,的表达ILP1,PRP43a,PRP8在控制植物显著减少热处理后(图10 e减少),这也被检测到ILP1和PRP43a在hl761背景(图10 e)。此外,这三个基因的表达hl761突变体是高于在控制植物,虽然没有统计学差异PRP8,这表明NTR1阻碍这些基因的转录在HS (图10 e)。因此,海关会抑制NTR1-associated复杂的表达。
讨论
应力诱导植物细胞的转录组的重新编程。冷治疗导致一波快速转录和活动在几个小时内(卡利斯托et al ., 2018)。海关也迅速唤起基因表达变化和植物(事件凌et al ., 2021;丁和阳,2022年)。在这里,我们表明,1小时热处理在38°C足以导致转录变化和成千上万的基因。NTR1剪接体,作为一个附件组成部分,在这一过程中起着重要的作用。
NTR1影响高铁基因的表达在转录和转录后水平在海关。大多数HS-induced基因检查不诱导hl761突变体比控制在60分热处理,和基因反应对温度刺激和反应热量明显丰富共同点燥热引起但表达下调的基因点热处理hl761。此外,NTR1诱变放大商品一样特别是红外事件并造成不同(主要是红外)高铁基因在海关。因此,mis-expression的虚假剪接pre-mRNAs这些高铁的基因ntr1突变体可能占减少HS宽容的突变体。值得注意的是,只有一小部分NTR1-dependent中差异表达的基因hl761点后热处理(图7 c),这表明大部分的这些基因被监管只有在海关。
NTR1据报道在昼夜节律的作用和microrna的生物起源的监管(琼斯等人。,2012年;王et al ., 2019)。有趣的是知道NTR1调节植物HS响应通过microrna的规定。正如所料,NTR1 miR167前体,一个潜在的目标(沈et al ., 2014),发现在表达下调度hl761在热处理(B1_A1下来,表S1)。然而,我们发现,只有两个微rna前体,miR824和miR850表达下调hl7611小时后热处理(B3_A3下来,表S1)。miR850尚未记录的功能,和报道miR824气孔发展和开花的规定(库特et al ., 2007;胡锦涛等人。,2014年;Szaker et al ., 2019)。HS提升miR824的表达(Szaker et al ., 2019在1小时),这是减少感应热处理hl761突变体。因此,它是可能通过miR824 NTR1调整植物发展的途径在海关,这是值得进一步研究。
尽管研究人员注意到,HS刺激,植物,确切的机制还不是很清楚。在海关监管的研究通常集中在作为特定关键TFs事件。剪接因子参与海关应对SR蛋白,主要是相关的表达式是由(赵et al ., 2021)。然而,商品是否调节其他splicing-related因素很少报道。剪接体配件,NTR1对植物维持至关重要的正确拼接pre-mRNAs在海关,因为更多的事件尤其是红外事件被观察到hl761突变体相比,控制植物经过海关。与此同时,HS强烈减少的表达NTR1和其他组件的NTR1-associated复杂。似乎有反馈提出了NTR1复杂的规定在热响应的表达式ILP1和PRP43a高得多hl761突变体在热处理之后。然而,HS的转录抑制NTR1和NTR1复杂需要进一步调查。因此,商品增加了假,尤其是红外抑制的可能导致NTR1-associated复杂。
在转录水平,植物可以快速应对海关。下半场热处理在38°C是足以引发早反应高铁基因的表达变化,例如,激活表达一个小的一部分HSP年代和转录因子等MBF1C,HSFA2,HSFA7A,HSFA7B。在38°C点热处理就足以导致成千上万的高铁基因的表达变化,这意味着一个快速和高要求HS-induced基因的转录。考虑的功能NTR1拼接和了NTR1与RNA聚合酶II (RNA PolII) (Dolata et al ., 2015),很可能NTR1或NTR1-associated剪接体拆卸复杂的物理障碍可能有负面影响在染色质上RNA PolII职业当燥热引起的快速转录基因发生在植物热响应。
根据我们获得的所有数据,我们提出一个模型的策略,植物可能采取应对海关。当遇到海关,大量的高铁基因尤其是hsf和热休克诱导。一方面,NTR1-associated复杂助攻pre-mRNAs的过程。另一方面,伟大的转录事件发生在满足高铁基因产物的高要求,使得存在NTR1或NTR1-associated剪接体拆卸复杂的转录的一个限制性因素。在这种情况下,植物减少NTR1-associated复杂的表达式,确保转录。因此,NTR1机械的减少导致不当拼接产品的积累,最终对植物造成伤害。
数据可用性声明
给出的数据存入NCBI库的研究中,加入号码:PRJNA896322。
作者的贡献
LH、QW YJ, YF进行实验。YW,王寅,HS的构思和设计实验。YW写的手稿。王寅修正它。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号31700216),湖北省自然科学基金(2022 cfb085)。
确认
我们感谢成国栋任教授请为我们提供的种子ilp1-1夫妇Jiajun Lv帮助与基因表达量化。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:热应力(HS),热应力宽容,NTC-related蛋白1 (NTR1), HS响应(高铁)基因,可变剪接(因为),intron-lariat剪接体(ILS)的复杂
引用:他吴Q L,金Y, Y, H,王Y和阳W (2023)NTR1通过中介参与热应力宽容的热应力的基因表达调控和可变剪接拟南芥。前面。植物科学。13:1082511。doi: 10.3389 / fpls.2022.1082511
收到:2022年10月28日;接受:2022年12月14日;
发表:2023年1月10日。
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