全基因组分析TritipyrumWRKY基因家族的反应TtWRKY256在耐盐
Kuiyin李
小娟刘
方他
从陈
Guangyi周
宵夜王3,
给张
渊源元- 1贵州子中心国家小麦改良中心,学院农艺、贵州大学、贵阳,中国
- 2安顺安顺大学,中国
- 3枣庄,枣庄大学,中国
- 4济南农业科学院、中国济南
- 5烟台,烟台农业科学院,中国
作品简介:WRKY转录因子广泛的植物王国,起着至关重要的作用在植物物种多样化的非生物胁迫反应。Tritipyrum, octoploid源自一个属间的杂交小麦(AABBDD)和Thinopyrum elongatum (EE),是一种宝贵的种质资源引进优良特征的。elongatum t . aestivum。最近发布的完整基因组序列t aestivum和Th。elongatum使我们调查的组织和表达分析Tritipyrum WRKY基因在整个基因组。
结果:在这项研究中,346个WRKY基因,从TtWRKY1 TtWRKY346, Tritipyrum被确定。这些基因的系统发育分析分组为三个亚科(》),和相同的亚科的成员共享一个守恒的图案构成。346年TtWRKY基因在28个染色体分散不均匀,与218重复。同线性分析表明WRKY基因家族可能有一个共同的祖先。来自转录组表达谱数据和qPCR证明54 TtWRKY基因表现出相对高水平的表达在不同盐压力和恢复治疗。Tel1E01T143800对盐胁迫(TtWRKY256)非常敏感,在相同的进化分支耐盐芥基因AtWRKY25和AtWRKY33。从“Y1805”,这部小说AtWRKY25克隆。皮尔森相关分析确定了181个基因,呈正相关(R > 0.9) TtWRKY256的表达,这些基因主要富集在代谢过程中,细胞过程,对刺激反应,生物调控和监管的生物。亚细胞定位和存在分析表明TtWRKY256位于细胞核和根中高度表达,茎,盐胁迫下和树叶。
讨论:上述结果表明,TtWRKY256可能与盐胁迫相关公差在植物和可能是一个有价值的外星人基因提高耐盐小麦。
介绍
土壤盐渍化是主要的非生物胁迫因素之一,盐抑制植物的生长和发展,影响粮食生产力(范Zelm et al ., 2020)。近年来,粮食生产在高收益的领域已经放缓,但绝大多数低收入和medium-yielding农场有很大的发展空间。如何有效利用盐水和其他低收入和medium-yielding地区促进粮食生产总量是一个必须解决的关键问题。盐胁迫会导致基本株像渗透压力和离子毒性,以及继发效应包括氧化应激和营养压力(杨和郭,2018年)。多个压力对细胞生长和代谢活动产生影响,进而影响种子萌发、幼苗生长和作物产量(穆恩一家和检测器,2008年)。植物已经形成一种复杂的机制来应对盐胁迫morphological-structural, physiological-metabolic,和分子水平,包括叶数量和面积减小,气孔关闭,积累渗透调节的物质,Na+和Cl- - - - - -射流和划分,清除活性氧,修改在逆境应答基因表达(戴et al ., 2018;侯et al ., 2018)。逆境应答基因的表达确定的形态结构和生理代谢水平提高,和转录因子发挥着至关重要的作用在调节这个表达式(梁et al ., 2018)。
WRKY特定植物转录因子成员参与广泛的生物学过程,包括形态发生、生物和非生物压力,种子萌发和植物衰老(陈et al ., 2017)。WRKY转录因子家族的所有成员包含了WRKY域(WD) 60个氨基酸残基组成。n端结构域是WRKYGQK序列的一部分,与DNA结合活性有关,和C端域是C的一部分2H2(cx4 - 5cx月22日至23日-H-X1C - h)或2HC (cx7cx23-H-X1- c)锌指结构,参与蛋白质相互作用和辅助DNA结合(Eulgem et al ., 2000;江et al ., 2017 b)。所需的W-box是最短的序列WRKY转录因子与DNA的结合。W-box高度保守的C / TTGACT / C氨基酸残基,其中TGAC是最保守的区域(Ulker Somssich, 2004)。任何核苷酸突变会影响WRKY转录因子结合的能力,也是参与WRKY-W-box绑定通过磷酸化反应,反应和磷酸化过程需要锌的参与2 +(Maeo et al ., 2001;段et al ., 2007)。WRKY转录因子分为三个类根据结构域和结构域的数量差异。类我包含两个WRKYGQK序列,每个包含一个类II和III。一级和二级cx相同的锌指结构4 - 5cx月22日至23日-H-X1- h,而第三类cx的锌指结构7cx23-H-X1- c。基于氨基酸序列的差异,二级可以进一步细分为五个子类:活动花絮,IIb, IIc, IId,国际教育协会(杨et al ., 1999)。
大量salt-responsive WRKY转录因子已确定从不同的植物,与亚IIc WRKY转录因子显示关键角色(陈et al ., 2017)。Salt-responsive WRKY转录因子驱动器或抑制靶基因转录启动子与W-box交互元素,参与阿坝,乙烯,SOS信号通路,充当中间因素之间的相互作用不同的信号通路。在拟南芥,过度的AtWRKY25和AtWRKY33可以提高植物耐盐基因通过调节SOS通路(江和Deyholos, 2009;Rajappa et al ., 2020),而表达AtWRKY8盐胁迫下上调和增强植物抗盐压力通过激活吗RD29A基因(陈et al ., 2013);在棉花,GhWRKY17可以引起干旱、盐、H2O2阿坝,及其在烟草组成型表达抑制ABA-inducible基因的转录水平(包括AREB、含有DREB数控,ERD, LEA)和块ABA信号通路(燕et al ., 2014)。为了应对盐胁迫,植物通常产生活性氧,通过活性氧介导对盐胁迫的响应信号的过程。高粱二色的SbWRKY50可以通过减少负调节盐反应的表达水平拟南芥Na+/小时+逆向转运蛋白基因AtSOS1(歌et al ., 2020)。Fortunella植FcWRKY40,另一方面,可以直接激活的表达FcSOS2丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因在SOS通路,和间接调节的表达FcSOS1和FcSOS3促进Na基因+流出,积极调节对盐胁迫的响应。此外,FcWRKY40反过来受ABA诱导可以表示为一个目标ABA反应的元素绑定因素呢FcABF2,FcWRKY40可能是一个关键的转录因子之间的串音的形成SOS和ABA通路(戴et al ., 2018)。在GhWRKY17overexpressing烟草、活性氧积累的水平、电解液泄漏,和丙二醛的积累显著增加,活性氧清除基因的表达水平,猫和SOD的基因,以及脯氨酸含量和酶活性明显下降,从而减少烟草对盐胁迫的耐受(燕et al ., 2014)。在DgWRKY5overexpressing菊花,ROS清除基因的表达(包括POD、CAT和SOD)差异,提高菊花的抗盐胁迫(梁et al ., 2017)。
t . aestivum中度耐盐作物,盐容忍度高于大米但低于大麦,并在盐水的一个主要栽培作物的土地。Th。elongatum的近亲吗t . aestivum并能生长在海水的盐浓度相似。的octoploidTritipyrum通过属间的跨越t . aestivum(AABBDD)和Th。elongatum(EE)是一个重要的种质资源引进Th。elongatum耐盐基因t . aestivum。的基因组t . aestivum和Th . elongatum已经完全测序的,提供一个坚实的基础的结构和功能研究相关基因(Mayer et al ., 2014;王et al ., 2020)。在这项研究中,基因的结构特点、染色体,基因重复,WRKY基因家族的进化趋异Tritipyrum被调查。此外,54岁的表达谱TtWRKY为了应对盐胁迫基因检查。最后,TtWRKY256是克隆及其亚细胞位置和表达水平在盐胁迫和恢复被确定。这些结果将为如何提高耐盐植物的建议。这些结果将为如何提高植物耐盐的建议。
材料和方法
植物材料
Tritipyrum是一个包含合成octoploid, a、B、D基因组小麦和一组E基因组Thinopyrum elongatum。耐盐“Y1805”是稳定的Tritipyrumoctoploid宽之间的交叉t . aestivum和Th。elongatum。的Tritipyrum蛋白质和核酸序列用于识别WRKY基因在这项研究中获得的t . aestivum基因组数据库(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)和Th。elongatum基因组数据库(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/965/show)。的基因序列拟南芥,大麦芽,栽培稻,玉米,Thinopyrum媒介是位于植物基因组学门户Phytozome13 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)。的Secale麦片从中国获得基因组序列数据库资源库(https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/12832/show)。公开可用的转录组数据集进行了分析研究。这个数据可以在这里找到:https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA769794?reviewer=7v7it5jpc4odu8mlni9frga27g/accessionnumber PRJNA769794]。
基因组原位杂交
种子发芽在25°C湿润滤纸的培养皿,然后保持在4°C约24小时后转移到25°C。根1到2厘米的长度被削减的冰水和治疗前大约24小时固定Carnoy的解决方案。固定后,根技巧被沾carbol洋红,和他们的有丝分裂染色体在显微镜下观察。当植物到达旗叶阶段,峰值采样和花药在减数分裂中期我(MI)被固定在Carnoy的解决方案,在1 M盐酸分离60°C 6到8分钟,和均质acetocarmine 1%。Th。elongatumDNA是由尼克贴上fluorescein-12-dUTP翻译方法和用作探针。剪切基因组DNA来自中国春天(AABBDD, 2 n = 42)被用来阻止DNA。在Vectashield安装介质(向量实验室、美国),幻灯片和碘化propidium复染色(π,0.25毫克/毫升)。
WRKY基因的鉴定Thinopyrum
从数据库(包含了http://www.pfam.sanger.ac.uk/),WRKY蛋白质序列(PF03106)的共识隐马尔可夫模型(HMM)下载。此外,搜索文件图书馆成立于68年报道AtWRKY序列(Eulgem et al ., 2000从UniProt数据库(被收购)www.uniprot.org)。发表了WRKY蛋白质的序列答:芥和他们的WRKY域作为查询序列,我们利用基本的局部比对算法搜索工具软件(BLASTP)寻找ThinopyrumWRKY (TtWRKY)的蛋白质。扑杀副本后,我们使用了包含数据库和智能工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)来验证的有效性剩余候选序列(Letunic et al ., 2012)。ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)是用于生成基因的物理和化学性质。
系统发育分析和守恒的主题的决心
UniProt数据库被用来获得答:芥WRKY蛋白质序列的系统发育树。Clustalx2.0工具被用来调整几个氨基酸序列发现WRKY基因。系统发育树比较Tritipyrum和答:芥建成使用NJ法,与泊松模型和1000引导程序复制特定的参数。MEME的在线工具(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)是用来确定守恒的图案TtWRKY蛋白质,参数设置为最优模式的宽度6到10 200和主题的最大数量。系统发育树显示、编辑、彩色无花果树使用软件和iTOL (http://itol.embl.de/)。
染色体分布和基因的复制TtWRKY基因
映射的方法TtWRKY基因的染色体Tritipyrum根据刘et al。分析执行的吗TtWRKY基因复制事件进行了使用多个共线扫描工具包(MCScanX)使用默认参数。All-vs-all MCScanX所需蛋白质序列比较进行使用钻石v0.8.25 (-max-target-seqs 5安勤科技0.00001)(Buchfink et al ., 2015)。
植物生长条件和压力治疗
在生长室(相对湿度75%和20/15°C明暗photocycle),“Y1805”的种子发芽。幼苗被播种在浮子董事会1/2霍格兰的解决方案与16/8 h光/暗周期,400年μmol m−2年代−1辐照度,同样的温度和相对湿度的发芽室。每三天,解决方案是新的文化。正月十四日(两扇阶段),盐胁迫处理启动与250毫米(1/2霍格兰的解决方案补充生理盐水)。5小时暴露于盐胁迫后,第一根,茎,叶大小一致的样本收集t . aestivum。24小时的盐胁迫后,材料被找到(1/2霍格兰的解决方案没有氯化钠)。第二个样本1小时后恢复。对照和CK2采用并行控制,包括正常(1/2霍格兰的解决方案没有氯化钠)种植材料。所有组织样本都立即在液态氮冷冻,不惜qPCR -80°C,以及基因克隆。三个生物复制利用,至少10幼苗/复制的总和。
WRKY基因的表达分析和qPCR验证下盐压力和恢复
这些数据集RNA-Seq利用盐的压力和恢复表达的调查TritipyrumWRKY基因。使用FeatureCounts v1.5.1,读取相应的WRKY基因统计(廖et al ., 2014)。阅读大量计算每千碱基百万记录(TPM)。R Circlize包是用于记录变换和想象结果(https://cran.r-project.org/web/packages/circlize.html)。注释的任务是利用去实现功能基因注释映射去利用条款(http://www.geneontology.org/)和KEGG (http://www.genome.jp/kegg/在BLAST2GO工具(Biobam生物信息学S.L.)数据库瓦伦西亚,西班牙http://www.blast2go.com/b2ghome/about-blast2go)的价值阈值106。引物5.0被用于设计引物序列(表S2)。作为内部控制,我们利用了肌动蛋白基因,一致表示在每个成长阶段在几乎所有的组织。的肌动蛋白基因是用来校准的检测三个技术重复三个生物学重复,和技术2−ΔΔCt是用来评估表达式。RNA逆转录,WRKY基因扩增,质粒结构
利用PrimeScript™RT试剂盒(豆类),RNA是reverse-transcribed互补。完整的编码序列TtWRKY256被放大的Y1805 cDNA使用吗Bsa我限制site-containing引物5’和3’末端的扩增片段。并给出了扩增引物表S2。制造商的指示后,扩增片段消化了囊/Spe我和BamH我/Kpn我然后插入到pBI121向量使用T4-DNA连接酶(豆类)。这个向量已经改变,包括绿色荧光蛋白(GFP)基因。插入序列是由CaMV的35 s启动子。
序列比对和系统发育分析TtWRKY256基因
DNAMAN执行多个WRKY基因序列的比对。从Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)和运用(http://plants.ensembl.org/Triticumaestivum/Info/Index)服务器,21 DNA序列编码WRKYs检索。大型X和最大似然法和1000引导程序复制,构建系统发育树(Kumar et al ., 2018)。
亚细胞定位TtWRKY256
的重组TtWRKY256gfp和向量pBI121-GFP负控制渗透到烟草表皮细胞通过根癌土壤杆菌介导的转换。孵化24 h后,绿色荧光蛋白(GFP)使用共焦显微镜观察荧光信号(FV1000奥林巴斯Corp .)、东京、日本)。
统计分析
使用SPSS软件进行方差分析(方差分析)研究的数据(IBM公司)。在显著性水平为0.05,平均值比较使用费舍尔最显著差异(LSD)测试。直方图与原点8.0创建程序(OriginLab公司,北安普顿,马萨诸塞州,美国)。
结果
识别的TtWRKY基因在Tritipyrum
细胞遗传学分析表明Tritipyrum“Y1805”56条染色体,其中42t . aestivum(红色)和14Th。elongatum(绿色)(图1一个)。在346年消除重复序列,WRKY基因从检索Tritipyrum基因组使用隐马尔科夫模型(HMM)和BLASTp方法在本研究中。WRKY基因命名为基于他们的位置Tritipyrum染色体(补充表S1)。结果表明,346年WRKY基因中确定Tritipyrum主要分布在D subgenomes和五个同源组(图1 b, C)。预测的WRKY蛋白质Tritipyrum极大地不同长度和分子量(MV)。的TritipyrumWRKY基因编码的蛋白质从135 (TraesCS1A02G348600.1和TraesCS1D02G351600.1)到1482 (TraesCS5A02G344100.1)氨基酸(aa)的长度从14.93 (TraesCS1D02G351600.1)到165.34 (FtPinG0000377600.01) kDa MV。蛋白质的等电点(π)范围从4.64 (TraesCS3D02G289500.1)到10.86 (TraesCS5D02G070700.1) (补充表S1)。
图1WRKY基因的染色体配置和分布Tritipyrum。(一)染色体的配置Tritipyrum“Y1805”;(B)Subgenomes WRKY基因的分布Tritipyrum;(C)WRKY基因的染色体分布Tritipyrum。
系统发育分析,主题的组成TtWRKY基因
根据系统发育树和图案组成,这些基因家族被分成七个亚科(图2一个;图S1)。探讨WRKY家族的进化关系和分类Tritipyrum构建系统发育树使用414中识别潜在的WRKY结构域答:芥和Tritipyrum(图2一个;图S1)。根据AtWRKY分类和主要氨基酸序列特征的生物模型答:芥WRKY家庭成员Tritipyrum可以分成三大组(组》)。其中,52TtWRKY包含2改进算法和1 C2H2-type锌指结构属于我;第二组包含210个成员和1 WD C2H2-type锌指结构在每一个序列,和家庭可以进一步分为5个亚科活动花絮,IIb, IIc, IId,国际教育协会,包含29日,25日,89年,30岁和37成员;84年TtWRKY包含1 WD C2HC-type锌指结构,属于第三组。在这项研究中,第二组是最大的WRKY转录因子家族Tritipyrum,占总数的60.7%,亚科花絮和IIc IId国际教育协会集群的一个分支,分别,这是与以往的研究一致t . aestivum。这是与以往的研究结果一致t . aestivum。箱线图表明遗传距离I_vs_II小于遗传距离I_vs_III II_vs_III,和之间的遗传距离是最小的,表明和IIs更密切相关,是最接近(之间的关系图2 b)。此外,IIs和iii级的遗传距离可比,但IIs的范围是最小的,这表明IIs序列散度低于iii级(图2 b)。
图2WRKY蛋白之间的系统发育关系和距离Tritipyrum和芥。(一)414 WRKY蛋白质之间的系统发育关系Tritipyrum和一个芥;(B)WRKY基因的遗传距离在不同的演化支。箱线图显示中值(黑线),四分位范围(箱),最大和最小的分数(胡须)的每个数据集。
一共有10个不同的主题,主题1 - 10 (图2一个;图S1),确定了使用MEME的在线计划。主题1和6主题都包含的特征序列WRKYGQK WRKY蛋白质,几乎所有标识WRKY蛋白质包含至少一种图案。主题分析表明,WRKY蛋白质相同的家庭或亚科Tritipyrum也有类似的主题组成。例如,主题9组我是独一无二的,而主题8组活动花絮和组IIb是独一无二的。主题特定于一个家庭可能参与植物的生物过程。因此,每个家庭或亚WRKY基因可能与特定的生物过程。亚科IIb花絮和成员的主题分布模式是相同的,表明其功能是相似的。这两个家庭也聚集到同一分支在系统发育树中,和IId及国际教育协会亚科也观察到同样的现象。这些结果进一步验证WRKY的分类Tritipyrum和它的系统发育关系。
染色体分布,基因重复和同线性分析TtWRKY基因
346年的TtWRKY28个染色体基因,345人被本地化,TtWRKY255没有显示在染色体定位地图由于锚定在支架(补充表S1;图3)。大部分的TtWRKY基因分布在染色体5 e(25岁,7.22%)和1 d(21岁,6.06%),而染色体4 b、4 e和e 6只包含4个TtWRKY基因(补充表S1;图1,3)。基于对染色体,在那里,他们的大部分TtWRKY基因末端,只有少数是靠近中心附近的区域(图3)上述结果表明,WRKY基因定位在染色体的非随机分布不均。在这项研究中,共有405名TtWRKY基因重复对被识别,包括218个基因(图3)。这表明,一些基因包含多个重复的基因,可能由于多个复制t . aestivum基因组。串联重复基因对主要分布在第一,第三,第五同源组,与绝大多数的同源基因分布在同一同源组和第四,只有少数第五和第七同源组,这符合自然易位产生的形成和演化过程中常见t . aestivum。
图3分布、重复和WRKY基因的同线性分析Tritipyrum。共线的WRKY相关性Tritipyrum通过圆环基因组显示。Tritipyrum染色体是彩色根据推断祖先染色体在成立大会。在中心,345个WRKY基因的相对位置地图显示在每一个28Tritipyrum染色体。
进化分析WRKY家庭在几个不同的物种
进一步推断进化WRKY基因家族的成员之间的关系Tritipyrum,h . vulgare,o .漂白亚麻纤维卷,美国谷物,Th。媒介,z梅斯,syntenic六种之间的关系进行了研究。五个不同类型的syntenic联系被确定(图4)。255年TtWRKY与基因共享syntenic连接Th。媒介,紧随其后的是z梅斯(251),o .漂白亚麻纤维卷(262),h .寻常的(218)和美国谷物(185)。(图4)。有趣的是,共线双之间被发现Tritipyrum和其他5种,表明这些同源配对可能存在之前,最初的分离。此外,某些WRKY基因共线对之间的发现Tritipyrum和h . vulgare被固定在高度保守的syntenic块,包含超过500个共线的网站。类似的趋势也之间的识别Tritipyrum和美国谷物,这可能归因于进化之间的关系Tritipyrum和其他五个植物物种。值得注意的是,一些TtWRKY基因被发现与至少三个syntenic基因对,表明这些基因可能起到了至关重要的作用在WRKY基因家族的进化。这些结果显示,TtWRKY基因家族是高度保守的,TtWRKY更密切相关的基因h . vulgare比的z梅斯。的TtWRKY基因在一些植物可能由一个共同的祖先。
图4之间的同线性分析Tritipyrum和五个具有代表性的植物物种。灰色的线在后台显示共线块内Tritipyrum和其他植物的基因组,而红线突出syntenic WRKY基因配对。
的表达TtWRKY基因在盐压力和恢复
确认是否表达TtWRKY基因受到不同盐压力和恢复治疗,所有346的转录水平TtWRKY基因在不同盐压力和恢复治疗。在346TtWRKY基因,249TtWRKY在所有11个样品测试基因表达,107个基因显示组成型表达(TPM > 1在所有样本)。这249TtWRKY基因主要来自第三组IIc和组亚科,和对应的聚类分析表明,WRKY基因没有显著相关的亚类型盐胁迫和恢复治疗(图5一个)。87年TtWRKY在所有检测样品基因不表达,这可能是伪基因或不响应盐胁迫和恢复治疗。去249表达基因的注释表明这些基因的生物学过程和分子功能是细胞过程中,代谢过程,对刺激反应,生物过程的监管,生物调控、生物合成的过程中,代谢过程的调节,细胞代谢过程和转录监管机构活动,DNA结合转录因子的活动,有机环状化合物绑定,杂环化合物绑定,DNA核酸绑定,绑定(图5 b, C)。
图5的表达模式TtWRKY基因在盐压力和恢复治疗。(一)249年的天使的表达谱聚类TtWRKY基因表达在11个样品包括盐压力和恢复治疗。(B, C)英国石油公司(B)和曼氏金融(C)249个表达基因分析。
为了进一步验证转录组数据的准确性,54TtWRKY成员的mRNA水平相对较高(日志2FoldChange > 1)在不同的盐压力和恢复治疗,从249年被选中TritipyrumWRKY基因。我们设计了特定的引物对54个基因(补充表S2)。实时定量PCR (qPCR)实验进一步进行分析其表达模式在不同盐胁迫反应和恢复治疗。定量qPCR之间选择基因和转录组变化大致相似(图6 a - c);(r基因表达显著趋势相似2= 0.82)与转录组数据,表明我们的转录组的结果是可靠的(图6 d)。
图6(两者)54 WRKY基因的表达分析在qPCR 11个样本。数据规范化β-actin基因和垂直酒吧表示标准偏差。(D)qPCR之间的关系和54个差异表达基因的转录。值的日志2比(盐压力或恢复治疗/ CK)基因。决定系数(r2)是显示在图中。在三个生物复制所有qPCR反应进行。星号,二重和三重星号显示显著差异(p < 0.05、0.01和0.001,分别组织之间)。
TtWRKY256克隆和序列分析
早期的研究表明,过度的AtWRKY25(AT5G07100)和AtWRKY33(AT2G38470)基因答:芥提高植物耐盐通过调节SOS通路。TtWRKY256(Tel1E01T143800)的基因TritipyrumWRKY基因家族和AT5G07100 AT2G38470位于相同的进化树分支(图S1)和上调不同盐压力和恢复治疗(图5)。使用Tel1E01T143800-specific底漆,1422个基点cDNA片段对应Tel1E01T143800was放大和克隆Tritipyrum“Y1805”通过PCR (图S2)和命名TtWRKY256。的TtWRKY256序列有99.41% Tel1E01T143800身份,他们之间只有7 bp核苷酸的变化(图7)。因此,TtWRKY256类似于Tel1E01T143800根据他们的cDNA序列。基于核酸序列的系统发育树显示,不同的物种TtWRKY256显示最大的同源性Th。elongatum(Tel1E01T143800图7 b)。的遗传距离TtWRKY256与T.aestivum离比T.urartu,T.dicoccoides和A.tauschii。的小麦属植物作物和A.sativa聚集在一起,O.sativa,Z.mays,S.italica,B.distachyon和L.rigidum更远亲,物种之间的遥远的亲和力是一致的(图7 b)。
图7克隆和系统发育的关系TtWRKY256。(一)使用“Y1805”cDNA放大产品;(B)WRKY核酸序列的系统发育树在不同的植物物种。最大似然(ML)生成树使用大型X 1000引导程序复制。
TtWRKY256表达的相关性分析
探索相关的生物过程TtWRKY256表达在盐胁迫和恢复治疗,进行皮尔逊相关分析TtWRKY256和其他基因在转录组数据。结果表明,181个基因(R > 0.9)的表达呈正相关TtWRKY256(图8)。生物过程(BP)和KEGG分析进行这些181个基因Blast2GO软件和KEGG网站(https://www.genome.jp/kegg/)。结果中列出图8 b, C为观察173个基因,其中5个基点,包括代谢过程、细胞过程,对刺激反应,生物调控和监管的生物过程。至于KEGG分析、氨基酸代谢、环境信息处理,碳水化合物代谢,蛋白质家族:新陈代谢、生物的系统,和蛋白质的家庭:信号和细胞过程都包括在内。上述结果表明,TtWRKY256可以与非生物压力在植物耐性有关。
图8表达的相关性分析TtWRKY256。(一)一百八十一个基因正相关(R > 0.9)TtWRKY256的表情;(B, C)英国石油公司(B)和KEGG(C)分析181正相关TtWRKY256表达的基因。
的表达模式TtWRKY256和亚细胞定位
调查的时空表达模式TtWRKY256qPCR分析被用来检查的表达水平TtWRKY256在盐胁迫下根和恢复条件和不同的组织。的TtWRKY256(4.1倍)表达水平显著高于控制盐胁迫下根和恢复(图9)。这些结果与上面的转录组数据一致。此外,的相对表达水平TtWRKY256基因是最高的在盐胁迫下的叶子Y1805,其次是茎,然后根(图9 b)。简而言之,所有上述结果表明Y1805特殊技能TtWRKY256基因是高度敏感表示在整个植物盐胁迫时高。确定的亚细胞定位TtWRKY256暂时,融合蛋白表达35 s -TtWRKY256产生了gfp在烟草表皮细胞。发现发出的荧光融合蛋白是局部核(图9 c)。结果表明,TtWRKY256可能导致转录监管或遗传物质和细胞保护组件。
图9表达和亚细胞定位TtWRKY256。(一)的相对表达水平TtWRKY256在盐胁迫下根和恢复的环境中;(B)的相对表达水平TtWRKY256盐胁迫下根、茎和叶;(C)TtWRKY256蛋白质的亚细胞定位烟草原生质体,比例尺= 20毫米。星号,二重和三重星号显示显著差异(p < 0.05、0.01和0.001,分别组织之间)。
讨论
在众多的植物物种,进化、功能、非生物压力反应,WRKY和其他特性,最大的家庭植物转录因子,研究了。在目前的工作,WRKY基因家族的346个成员被发现Tritipyrum。346年的WRKY基因中发现Tritipyrum可以分为三个不同的组。WRKY基因由每组的比例不同;第二组包含WRKY基因的比例最高。同时,IIs和III级的遗传距离相似,这可能是由于第三组IIb起源于组重复的WRKY基因(品牌et al ., 2013);WRKY转录因子的进化模式也被验证在野生稻(江et al ., 2017 a)。MEME的WRKY蛋白质序列分析发现了明显的组织特异性。集团IIc WRKY蛋白质,例如,是高度保守的,包含一些额外的主题。重复的基因对物种进化至关重要,基因组扩增、基因家族进化(林奇和Conery, 2000年)。全基因组复制、串联重复和节段重复三个主要类型的基因复制(Yu et al ., 2005)。基因复制可能有不同的表情。似乎有些进化等事件重复和多倍体植物已经延长了基因家族成员(Rezaee et al ., 2020;Faraji et al ., 2021)。另一方面,一些基因结构变化包括点突变编码DNA序列地区和监管网站复制成员有影响的新成员的功能(Faraji et al ., 2020;Heidari对伊朗伊斯兰共和国通讯社表示et al ., 2021)。WRKY基因的同线性的六个物种,包括Tritipyrum,h . vulgare,o .漂白亚麻纤维卷,美国谷物,Th。媒介,z梅斯,进行了研究。最syntenic被发现之间的联系Tritipyrum和Th。媒介。这些数据意味着这些类群有着紧密的进化关系,兼容传统的稻科植物类分类。Tritipyrum和美国谷物属于单独的属,决心syntenic链接的数量最少。syntenic五套的关系,1卷WRKY基因被至少三个物种共享,这可能阐明WRKY基因在物种的进化。
盐度是一个重要的环境危害作物生产,因为过度集中的盐在土壤中植物有毁灭性影响性能通过破坏细胞的新陈代谢。这些负面影响的盐度增加主要是由于渗透压力和植物细胞中有害离子的累积。盐度是作物生产的主要环境威胁,因为高浓度的盐在土壤严重影响植物的性能通过干扰细胞的新陈代谢。这样的副作用增加盐度发生主要是由于有毒离子的渗透压力和持续积累在植物细胞(穆恩一家和检测器,2008年)。在植物基因编码TFs差异表达复杂的压力反应系统的一部分。一些转录因子,包括bHLH WRKY, MYC,南汽,MYB,和小块土地/ AP2与耐盐途径(Okushima et al ., 2007;Golldack et al ., 2011;局域网Thi黄平君et al ., 2017;Meraj et al ., 2020)。许多WRKY基因已确定在拟南芥,水稻、玉米、小麦,分别以应对各种逆境的压力。后的过度ZmWRKY106的耐旱基因答:芥是改善。在干旱条件下(王et al ., 2018)。AtWRKY53可以加速淀粉在保卫细胞的新陈代谢,减少H2O2水平,从而促进气孔运动(太阳和余2015人)。TaWRKY44有多个非生物压力在转基因烟草耐性,包括干旱、盐,和渗透压力(王et al ., 2015)。十二GmWRKY基因差异表达出现在盐胁迫下大豆(歌et al ., 2016)。植物通常WRKY基因高表达可能激活下游靶基因的转录,从而调节植物的生长和发展徐et al ., 2016)。WRKY基因的组织表达可能影响目标组织/器官的生长和发育过程通过调节转录过程(唐et al ., 2014)。在这项研究中,249年TtWRKY基因被发现在Tritipyrum根组织显著响应盐胁迫的感应,其中107TtWRKY基因组成型表达特征,这些TtWRKY年代可能参与调节细胞的基本生命过程。其中54个TtWRKY基因进一步选择检查他们在盐胁迫反应中的作用。表达式的结果分析和qPCR分析表明,这些54TtWRKYs积极控制盐胁迫反应吗Tritipyrum根组织。转基因实验将被用来了解确切的生物功能TtWRKYs,他们利用基因工程提高作物的抗逆性和其他农艺性状也会了。
类似于前面的调查t . aestivum,确定了12 TaWRKY盐胁迫响应基因作为候选基因,大部分的TtWRKY基因对盐度压力(Ning et al ., 2017)。过度的AtWRKY33也被证实能增加吗答:芥耐盐压力(保et al ., 2018)。AtWRKY33控制不仅通过盐还通过氧化应激(江和Deyholos, 2009;Birkenbihl et al ., 2012)。此外,基因调控AtWRKY33与活性氧解毒过程,表明WRKY TFs监管机构压力适应(至关重要江和Deyholos, 2009)。的TtWRKY256WRKY基因家族的基因Tritipyrum和AtWRKY33在答:芥位于相同的进化分支,TtWRKY256基因差异在不同盐压力和恢复治疗。作为一个结果,TtWRKY256在这个实验中被选为额外的功能研究。的相对表达水平TtWRKY256基因是最高的叶子Tritipyrum在盐胁迫下,其次是茎,然后根。发现根系直接受损和严重高盐溶液。此外,TtWRKY256表达水平在整个植物盐胁迫下显著高于控制和恢复。这些结果是符合我们的转录组数据和先前的报道(Ning et al ., 2017)。由于这个原因,TtWRKY256高度和敏感表示在整个植物帮助植物应对盐胁迫。去KEGG高度相关基因的分析TtWRKY256证明了高度相关基因与在代谢过程中,细胞的过程,对刺激反应,生物调节,和生物过程的监管,这可能导致的耐盐机制的研究TtWRKY256。
土壤盐渍化是一个日益严重的问题,已成为一个主要因素限制种子萌发、幼苗生长和作物产量。Th。elongatum是一种密切相关t . aestivum可以生长在海水的盐浓度相似。Tritipyrum,之间通过属间的杂交t . aestivum和Th。elongatum,是一个重要的桥梁材料引入耐盐基因的Th。elongatum成t . aestivum(贝克et al ., 2020;麦肯纳et al ., 2020)。提高耐盐植物的主要诱发逆境应答基因的激活,表达产品参与修复的主要和次要的各个方面强调盐胁迫引起的。相比单一的功能基因,转录因子可以调节下游靶基因,进而调节生理和生化过程,以应对盐胁迫(江et al ., 2017 b;局域网Thi黄平君et al ., 2017)。在这项研究中,生物信息学等系统发育分析、主题分析和相关分析被用来进行综合分析WRKY家族的Tritipyrum。RNA-seq被用来寻找WRKY转录因子Tritipyrum盐胁迫响应的转录组分析植物对盐胁迫的反应。的TtWRKY256使用拟南芥基因克隆和鉴定盐胁迫与响应相关的基因AtWRKY33作为参考基因、分析基因表达水平和亚细胞定位TtWRKY256盐胁迫下基因和恢复完成。植物盐胁迫的反应非常复杂,与多种基因参与监管网络和多个通路一起表演。的功能TtWRKY转录因子筛选本文没有transgenically特征。它需要发现如果这些转录因子相互作用,如果他们与其他蛋白质相互作用,如果他们有下游靶基因。发现和广泛使用的盐tolerance-related转录因子候选基因和持续改进的耐盐机制的理解参与转录因子,基因工程将使它更容易种植作物,可以处理盐。
结论
在这项研究中,WRKY基因家族的彻底检查Tritipyrum进行了。346年长篇WRKY基因进一步描述和分类为三个主要类别,用极其相似主题作品在同一组和子组。WRKY基因的同线性分析和系统发育比较从不同的植物物种产生了有益的见解WRKY基因进化的特性Tritipyrum。54个TtWRKY在盐胁迫响应基因发挥重要作用Tritipyrum在不同的组织,它们的表达模式和应对盐胁迫和恢复治疗。此外,TtWRKY256可能是一个潜在的目标基因增强小麦的耐盐吗通过生物技术或分子育种。这些数据提供了一个巨大的资源获得更深入的理解特定的WRKY基因的生物功能Tritipyrum。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
作者的贡献
KL规划和设计研究和分析数据。KL和XL写的手稿。跳频、SC和广州qPCR基因表达的研究。跳频确定了TritipyrumWRKY基因家族和分析基因结构。YW和深圳研究染色体分布和基因重复。YY分析了WRKY基因在不同物种的进化关系。监督研究先生。YY,修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作得到了研究基金从贵州省科技部门,中国(zk2022 - 315, 2109 - 4246, 2109 - 1073,和2017 - 5788年),中国国家自然科学基金(32160474、32160474、32160456、32160456),和山东的关键R & D项目(重大科技创新项目)(2021 lzgc009),从济南农业科学院合作项目(YY201902)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.1042078/full补充材料
缩写
- 脱落酸ABA;AREB ABA-responsive元素绑定;CaMV花椰菜花叶病毒;猫,过氧化氢酶;含有DREB dehydration-responsive元素绑定;ERD、早期反应脱水;GFP,绿色荧光蛋白;格斯,β-glucuronidase;LEA embryogenesis-abundant后期蛋白质;qPCR定量实时聚合酶链反应; NCED, 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase; POD, peroxidase; ROS, reactive oxygen species; SOD, superoxide dismutase; SOS, salt overly sensitive.
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关键词:TritipyrumWRKY、耐盐碱能力TtWRKY256全基因组表达模式
引用:李K,刘X,他F,陈年代,周G,王Y,李,张,任M和元Y(2022)的全基因组分析TritipyrumWRKY基因家族的反应TtWRKY256耐盐碱能力。前面。植物科学。13:1042078。doi: 10.3389 / fpls.2022.1042078
收到:2022年9月12日;接受:2022年11月02;
发表:2022年12月14日。
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