重组amelogenin肽促进早期釉质龋的补充矿质陷阱:一个在体外研究

介绍

蛀牙釉质是一种独特的疾病的牙齿硬组织软化,溶解指出由细菌或其他无菌酸性攻击,这是一个重大的公共卫生问题和全球人口中非常普遍的疾病(Selwitz et al ., 2007)。搪瓷成熟之后,不再有一个源生产搪瓷结构单元,它不再是可供自然搪瓷损坏或破坏组织的再生。由于缺乏治疗的细胞修复机制,釉质龋组织依赖于物理化学修复的过程。策略涉及生物玻璃(Bakry et al ., 2014)、钙磷酸盐(科克伦et al ., 2010)和氟化(Majithia et al ., 2016)已经申请了搪瓷再生。氟化,特别是被广泛用于治疗龋齿。然而,氟化再生的矿物晶体在腐烂的病变是无序的。此外,氟可以通过曝光过度(可能是有害的李,2003)。新型生物材料的发展,可以安全地促进龋的病变补充矿质是一个新兴的方法。矩阵的搪瓷仿生补充矿质策略,材料介导的合成HA通过与蛋白质的相互作用或无机材料,被广泛研究王et al ., 2017)。

在牙釉质形成的阶段,造釉细胞组成的细胞表达和分泌釉质细胞外基质蛋白质主要amelogenin和其他蛋白质,包括enamelin ameloblastin和蛋白酶(巴特利特et al ., 2006)。Amelogenin,构成了超过90%的细胞外基质蛋白(大镰刀刀柄,2003),主要由三个功能域:富含酪氨酸amelogenin肽(陷阱),这是疏水性;核心域(包括脯氨酸和谷氨酰胺);和一个亲水糖基(康纳利et al ., 2016)。它已经证明了长篇amelogenin N和c端域对牙釉质的形成至关重要的矿物质。自组装成“簇”或连锁结构主要是由n端结构域。磷灰石晶体必须指向平行对齐在体外通过c端域(王et al ., 2020)。

因为它的仿生矿化能力,搪瓷仿生补充矿质策略使用amelogenin被广泛研究。Diez-Garcia et al。(2022)amelogenin,离子交换树脂(含有钙、磷、氟、锌等离子体),和人工唾液对牛的牙齿成新产品,并发现它诱导牙补充矿质形成氟磷灰石,哪个更耐酸和有可能促进长期补充矿质。我们之前的研究发现,一个amelogenin合成肽(的N - c终端组成的猪amelogenin)诱发早期釉质龋的补充矿质。这一行动机制,肽可能作为监管因素和钙离子载体直接晶体形成的有序数组(楚et al ., 2018)。

除了长篇amelogenin,牙釉质在开发过程中包含大量的肽段。陷阱是一个重要的部分产生全身amelogenin通过蛋白水解剪裁。lectin-binding主题定义为“PYTSYGYEPMGGW”存在于陷阱(佩因和大镰刀刀柄,2005)。这个lectin-binding属性允许装配到团簇的形成方向根据造釉细胞,表明陷阱负责amelogenin能够自组装成“簇”(Ravindranath et al ., 2000)。域“A”位于陷阱,有完整的单独绑定能力(潘恩et al ., 2001)。amelogenin-to-amelogenin交互导致nanosphere自组装需要一个域,而没有一个域抑制自组装过程(主义艺术观et al ., 2020)。陷阱的能力,促进HA表明它可以自组装成一个多重的结构(Moradian-Oldak et al ., 2002)。amelogenin肽中,陷阱区域提供了唯一的磷酸化网站(Se-16),可与矿物质如钙和磷在釉质形成阶段(Le Norcy et al ., 2011)。控制结构、成分、力学和晶体搪瓷的性质在很大程度上依赖于amelogenin的磷酸化。釉质矿化过程的生物调控降低没有amelogenin磷酸化(斯蒂夫勒et al ., 2022)。

在这项研究中,amelogenin肽合成陷阱在体外被用来探索其监管影响早期釉质龋的补充矿质,为了澄清其功能amelogenin促进补充矿质釉质龋。我们假设陷阱的关键功能的主题是自然amelogenin蛋白质补充矿质的牙釉质。

材料和方法

制备仿生肽

本研究中使用的肽由Synpeptide有限公司有限公司(中国南京)使用传统固相肽合成,然后用高效液相色谱法和质分离和鉴定。他们对应的氨基酸序列猪amelogenin P173。在图1研究合成肽1,N -和猪amelogenin c终端;研究了肽2肽合成陷阱。蛋白质首先溶解在去离子水准备肽原液(楚et al ., 2018)。肽原液在搅拌器搅拌24 h在4°C,然后放置在冰箱至少24小时。

样品制备

新鲜牛切牙牙齿后提取(批准郑州大学第一附属医院伦理委员会:2021 - ky - 1050 - 002)了。冠根分开,准备到釉质块(3毫米×3毫米×2毫米)使用金刚石层面带锯下连续水冷(Struers Minitom;Struers,哥本哈根,丹麦)。研究设计了图2。48釉质样本,无裂缝,蛀牙,白垩病变,釉质发育不良,stereological显微镜下选择。釉质表面被地面平坦,各种粗燕麦粉和碳化硅砂纸抛光(320,400,600,800,1200,1500,2000,和2500年的成绩;比勒有限公司)、水冷去除釉质层的厚度约150μm。随后,唇边的牙釉质样本分为三个区域,每一个大小为1毫米×3毫米(a、b和c;图3)。参考窗口与完整的搪瓷窗口,龋齿的基线是窗口b, c和test窗口窗口。

腐烂的病变的形成

样品的表面都覆盖着耐酸指甲油,除了windows b和c。创造人工龋的病变,48块沉浸在192毫升(5.0毫米南去矿化作用的解决方案₃乙酸,50毫米,2.2毫米Ca(没有₃)₂,2.2毫米KH₂阿宝₄,0.2 ppm氟化钠;pH值调整到4.5使用5毫米KOH),在37°C 100 RPM连续3天磁搅拌(十、Duijsters 1983)。去矿化作用的解决方案是补充每24 h。去矿化作用后,所有样本和去离子水冲洗自然干。

补充矿质治疗

搪瓷标本都是随机分为四个不同的remineralizing治疗(每组12标本):A组,remineralizing介质;B组,100μg /毫升研究肽1 + remineralizing介质;C组,100μg /毫升研究肽2 + remineralizing介质;D组,2 ppm氟+ remineralizing媒介。标本每组都沉浸在18毫升对应remineralizing介质(0.9毫米KH₂阿宝₄,1.5毫米CaCl₂,消息灵通的20毫米,130毫米氯化钾,1毫米NaN₃;pH值调整到7.0,5毫米KOH),在37°C和100 RPM连续12天磁搅拌(Almqvist马·拉格乐夫,1993)。remineralizing介质是每天补充一次。牙釉质样本去离子水清洗和风干后补充矿质治疗。

ct机扫描

每个标本的矿物质密度病变(MD)和深度(LD)评估使用ct机系统(Skyscan 1272,力量,德国)补充矿质之后。参数被设置为60千伏的电压,电流160μA,和8.5μm的决议。扫描后,所有样本的资料重建1272年Skyscan使用NRecon软件。MD校准,矿物参考幻影的集合,包括三公顷磁盘(250,和750毫克/厘米³),是扫描。

每个标本的声音,基准和测试windows都检查各自的中心感兴趣的体积(VOI) 300μmµm×300。通过假设一个声音搪瓷最多100卷%的MD, MD概要文件转化为一个相对的MD。重建的三维图像的数据收集釉质块分辨率为1024×1024和8.5μm各向同性体素的大小。医学博士的平均MD值的计算示例。此外,100年的三维VOIμmμm 100××100μm随机选择三个地区的中心。平均密度表示为MDa, MDb,分别和争取民主变革运动。补充矿质率(% R)是使用以下公式计算:

去矿化作用后ΔZde (MDa-MDb)矿物损失;补充矿质后ΔZre (MDa-MDc)矿物损失;和∆Z (∆Zde-ΔZre)矿物补充矿质后获得。

每个样本获得的日冕图像。获得的损伤深度基准和测试windows,评估被随机选择样本的每个日冕图像的中心。平均值是LDb LDc,损伤深度的变化(ΔLD)之前和之后补充矿质,ΔLD = LDb-LDc。

x射线衍射仪测试

釉质样本首先嵌入在丙烯酸树脂,然后纵向切成两半,实现平面抛光和样品厚度100µm。分析了这些部分使用x射线micro-diffractometer (D8发现;力量,德国)。中收集的数据的扫描范围20°-65°的条件下铜目标Kα辐射,40 Kv,管电压和管电流40 mA。数据分析使用玉6.0软件。然后获得x射线衍射模式与标准衍射卡(JCPDS 09 - 0432)。每组(n = 4)。

扫描电镜形貌

釉质样本首先嵌入在丙烯酸树脂,然后横着切成两半。然后样本干sputter-coated用金子包裹。横截面形态扫描电镜观察到(Sigama, 500;德国蔡司)。每组(n = 4)。

偏振光显微镜检查

搪瓷标本是嵌入在丙烯酸树脂。中心的每个标本,薄,平面,并行块μm厚被切割和抛光的约有100。显微镜玻片被用来挂载片,是评估使用偏光显微镜(Al Axio范围、蔡司、德国)。每组(n = 4)。

钙结合测试

Ca的热力学^{2 +}结合肽2进行了研究使用等温滴定量热法(TA仪器,美国)。在37°C和350 rpm, ITC测量进行了一个标准的nanoITC的体积。水放入参比电池。10毫米消息灵通的解决方案包含肽2成立(pH = 7.0)。在玫瑰肽溶液2 0.42毫米12.5毫米CaCl接受注射₂(10毫米)。25单独注射2每个被用来滴定CaClµL₂肽溶液每隔180年代。钙离子结合生成的热量陷阱/注入测量并显示为微分功率(µcal年代⁻¹)和时间(分钟)。下的面积每注入峰值集成和千卡摩尔⁻¹注入物vs的摩尔比(Ca^{2 +})÷(陷阱)。在一个控制实验中,相同数量的CaCl₂滴定到玫瑰(10毫米),结果被扣除的生热量反应得到的有效热量绑定。ITCRun数据采集软件使用美国国际贸易委员会网站模型来计算热力学的一组值的钙结合肽2。钙绑定属性表示为亲和常数,离解常数,焓和熵。

数据分析

实验数据的统计分析是使用IBM SPSS 21.0执行(美国芝加哥,IBM IL)。提出了所有数据的平均值和标准偏差。∆Z、ΔLD和R %是由单向方差分析LSD事后紧随其后。多个比较被用来分析ct机数据,和测试水平α= 0.05。

结果

ct机的数据

图4介绍了ct机的2 d图像釉质样本(a、c、e, g)和矿物质密度的资料与深度从物体的表面(b、d、f、h)。图像(a、c、e, g)包括声音、基线和测试windows(从上到下)。地下病变被证实使用基线资料。矿物质密度增加整个测试配置文件。唯一的媒介(A组),remineralized增强显示的大部分矿物质矿物质密度在0-60µm。深度大于60µm remineralizing基线和测试windows的媒体,矿物质密度逐渐融合。除了只有remineralizing媒体集团,其他组影响表层和深层的病变。

图5显示所有的% R组。% R均值±SD值6.16±23.96%,48.96%±6.06,8.95±48.80%,和61.29%±7.40 remineralizing介质,肽1,肽2和加氟remineralizing媒介组,分别。单向方差分析统计分析显示治疗组之间的显著差异(p< 0.05)。此外,LSD事后测试多个比较显示显著差异% R在治疗组。除了肽1和肽2组(p> 0.05),所有组有显著差异(p< 0.05)。

表1显示∆Z的医学资料补充矿质后所有组。描述的数据使用平均值±标准偏差。单向方差分析的结果显示,所有介质处理差异具有统计学意义(p< 0.05)。此外,治疗组之间的医学根据多个不同的显著对比使用LSD事后测试。然而,之间没有显著差异研究肽1和肽2组(p> 0.05)。

表2在每组的概要说明了ΔLD去矿化作用和补充矿质。描述的数据使用平均值±标准偏差。单向方差分析确定了统计上的显著差异在∆LD测试组(p< 0.05)。LSD事后多重比较分析表明,∆LD最大的加氟remineralizing中等组和成矿介质的至少组。没有显著差异研究之间的∆LD肽1和肽2组(p> 0.05)。

偏振光显微镜检查

图6显示了偏振光概要文件的所有组。所有软化区域增加组织孔隙度似乎积极双折射时切片分析PLM吸入后水(RI = 1.33)。牙釉质损伤有一个完整的表层积极(消极的双折射的面积)双折射损伤身体。在所有组,除了remineralizing媒介集团,表层的厚度和密度补充矿质后明显增加。remineralizing媒介集团,一个小的密度增加表层被观察到。

扫描电镜形貌

图7介绍了横截面扫描电镜图像。良好结合搪瓷棒可以在声音由搪瓷1)。3天后去矿化作用,声音的搪瓷棒搪瓷明显破坏2)。remineralizing媒介集团形成的矿物层截面3)。搪瓷棒是可见的痕迹浅洼地肽1的截面图像组4)。肽2组的横截面图像也显示了类似的inter-rod缺口。此外,一些矿物表面吸附5)。该加氟remineralizing媒介集团获得最明显的搪瓷棒6)。

x射线衍射仪光谱

图8的XRD结果显示表面的自然补充矿质后釉质和牙釉质磁盘。特征峰的补充矿质表面上显示每组比较与标准卡片(JCPDS 09 - 0432)。大约29.0°的衍射峰(210),31.8°(211),32.9°(300),和39.8°(310)与HA的结晶峰特征相一致,表明补充矿质HA后生成的物质。(210)、(211)和(300)峰的XRD发现remineralizing媒体表明,水晶哈开始形成,但只有少量。与remineralizing媒介组相比,(210)和(300)峰的增强,表明其他群体的补充矿质抑制。

钙结合的影响

图9显示热代光谱图和有效的钙离子和肽2之间的绑定等温线。向下的曲线表示一个吸热反应。绑定等温线的热值的变化稳定,在高温下生成异常光谱图从第五下降绑定等温线图,表明绑定饱和。亲和常数的不同的热力学值表示Ca之间两种不同的类型的绑定事件^{2 +}和肽2。一个热力学值分析表明,第二个亲和常数(Ka₂= 5.548×10⁵米⁻¹Ca的)^{2 +}肽是高于第一个亲和常数(Ka₁= 10米⁻¹),第一个离解常数(Kd₁= 1.000×10¹米)低于第二离解常数(Kd₂= 1.803×10⁶米),这表明Ca^{2 +}结合肽2可能会更容易第二种类型的绑定事件。(ΔH焓的值₁和ΔH₂)是106.4千卡摩尔和-106.6千卡摩尔,分别和熵(ΔS₁和ΔS₂)是3.760×10²卡尔摩尔⁻¹°C⁻¹和-2.474×10²卡尔摩尔⁻¹°C⁻¹分别对Ca^{2 +}和陷阱。

讨论

这项研究的结果表明合成肽陷阱的潜力,促进早期釉质龋的补充矿质。此外,补充矿质的趋势的陷阱一样,C -肽组成和N-termini amelogenin。因此,我们的研究结果提供支持的假设合成肽陷阱应该补充矿质的原生amelogenin的关键功能的主题。

一种小型医学CT扫描的CT机有几微米的空间分辨率(Besinis et al ., 2014)。ct机是一种先进的技术,可以量化矿石损失和损伤深度的搪瓷两和三维信息(Zhang et al ., 2021)。在1μm像素的分辨率是准确的。ct机的技术已经被认为是一种无损定量描述表面形貌的替代品。

矿石损失是重要的(图4;a、c、e, g)和相对稳定(表1;∆Zde)在四个实验组,每组去矿化作用后,根据ct机的结果。地下损伤与完好的表面观察层在所有组的样品去矿化作用在PLM显微图(图6)。这些结果表明,人工龋的病变样本成功地准备和类似于自然腐烂的病变。这一发现也报道了黄et al。(2011)。蛋白质分子已被证明促进釉质损伤补充矿质。富亮氨酸amelogenin肽(LRAP)钟等。(2021)自组装与陷阱,被发现有效钙和磷离子稳定在无定形磷酸钙(ACP)和直接的增长ACP沿C-axis成捆的HA晶体。在这项研究中,补充矿质作用的肽2组高于remineralizing媒介集团(图5;表1;表22),表明肽促进釉质龋的补充矿质。调控Amelogenin众所周知公顷增长和釉质矿化。amelogenin的n端是一个重要的领域,协助矿化(主义艺术观et al ., 2020)。通过其酪氨酸浓缩段(陷阱)n端,amelogenin与钙、磷离子相互作用,稳定成一种无形的形式(燕et al ., 2022)。之间没有显著差异补充矿质肽1和肽2中治疗组。这表明,肽陷阱可以用作功能片段的补充矿质amelogenin促进早期釉质龋。

六组的横截面特征的扫描电镜图像(图7)表现出显著差异。补充矿质介质在本研究pH值7.0相当于人工唾液。remineralizing中单独使用时,治疗结果导致矿化层的修复能力软化牙釉质在人工唾液。然而,有限的Ca^{2 +}在补充矿质离子介质抑制了补充矿质。因此,搪瓷棒不明显(Zhang et al ., 2014)。肽1和肽2组显示补充矿质的有序结构。松本et al。(2006)证明了肽可以吸引Ca^{2 +}和阿宝₄^{3 -}离子,从而保持局部过度饱和,最终催化新形成的矿化。这支持了这项研究的结果。矿物的形态形成的肽组和加氟remineralizing媒介集团是不同的。在加氟remineralizing媒介集团,新的搪瓷杆结构接近的声音搪瓷。氟化作用的机理是通过减少新形成的磷灰石的溶解。

x射线显微衍射可以用来获取更具体的信息(雪et al ., 2008)。这是用来检测表面的龋齿病变和补充矿质地区的标本和进一步探索的水晶相结构调控合成肽陷阱的补充矿质釉质龋病变在这项研究。先前的研究已经表明,amelogenin-derived肽的产品申请补充矿质公顷(阮et al ., 2014;彭et al ., 2021)。氨基酪氨酸段amelogenin从LRAP提取和合成使用non-amelogenin模拟仿生釉质基质蛋白。HA表面形成釉质龋,机械性能相似的天然牙釉质(方et al ., 2021)。所示的XRD模式(图8),天然牙釉质晶体的哈。HA的特征衍射峰出现在补充矿质后样品的表面。从哈峰的强度在这项研究中,这是证实了结晶度的HA晶体形成肽2的相似肽1。HA晶体中的天然牙釉质的特点优先生长沿C轴(图8)。然而,HA晶体形成的牙釉质样品后补充矿质每组中没有显示一个明显的峰值(002),优先沿C轴。这种现象可能是由于不同的搪瓷生物矿化机制和补充矿质在体外。生物矿化是受到各种因素的影响,包括生物制剂。然而,这项研究是在进行的在体外条件,缺乏生物基因调控。

我们以前的研究证实,合成肽(的N - c终端组成的猪amelogenin)可以绑定到Ca^{2 +}具有高亲和力。带负电的n端(磷酸化丝氨酸残基)主要是参与绑定(楚et al ., 2018)。在目前的研究中,热力学参数的值改变(图9),ΔH₁> 0,ΔS₁> 0,TΔS₁>ΔH₁,这表明绑定主要是由熵和疏水作用是主要的部队(罗斯和萨勃拉曼尼亚,1981年)。因此,第一种绑定事件是由肽的疏水作用2。第二个参数的值与ΔH变化₂< 0和ΔS₂< 0表明绑定是由之间的氢键和范德华力钙离子和肽2。离解常数(Kd₁> Kd₂常数(Ka)和亲和力₁<卡₂)显示Ca之间的交互^{2 +}和陷阱主要是通过氢键和范德华力。本研究支持从先前的观测证据(王et al ., 2012)。研究了肽2可以与钙离子结合,应与带负电的磷酸基的氨基酸序列的陷阱。因此,从ct机和PLM这一研究获得的结果,我们相信肽作为Ca陷阱可以操作^{2 +}离子载体,传递Ca^{2 +}离子remineralizing解决深层的龋齿病变和促进补充矿质给Ca^{2 +}晶体所需维修。

结论

肽陷阱解决方案的应用程序的一个表层釉质损伤改善矿物增益,降低损伤深度,HA晶体产生。作用机理为钙离子载体支持行动amelogenin肽重组陷阱的搪瓷组织的再生。这项研究提供了令人鼓舞的发现为未来早期釉质损伤的保守治疗。应进行进一步的研究,探讨微观晶体结构的釉质龋的产品补充矿质肽诱导的陷阱。和原位和动物实验模型需要进一步探索的补充矿质肽陷阱。

数据可用性声明

原始的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

道德声明

综述了动物研究和伦理委员会批准郑州大学第一附属医院:2021 - ky - 1050 - 002。

作者的贡献

YL和JC参加本研究的设计,他们都进行了数据分析。YL和我们进行实验,收集重要的背景信息。QB和兆瓦为数据收集和分析提供了援助。DM、YL和YL进行文献检索,数据收集和手稿编辑。所有作者阅读和批准最终的手稿。

资金

我们的研究得到了国家自然科学基金(No.U2004108)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

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