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前面。杂志。,16 May 2022
秒。鸟类生理
卷13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fphys.2022.903491

禽类胚胎文化:一个角度蛋中蛋来前女友蛋和在体外研究

Woranop Sukparangsi ¹

Ampika Thongphakdee ²

Sittipon Intarapat ³*

¹生物学系、理学院、Burapha大学分布利,泰国
²野生动物繁殖创新中心、研究部门、保护和研究、动物园组织泰国莫莱森国王的皇室赞助下,曼谷,泰国
³解剖学系,理学院,Mahidol大学,泰国曼谷

外的禽类胚胎生长天然蛋壳(前女友蛋)观察自19世纪早期,此后小鸡胚胎结构显示达到深入外部和内部解剖的观点,使我们了解守恒的脊椎动物发展。然而,一个蛋壳(内部环境蛋中蛋)仍将是理想的地方执行各种实验的本质理解鸟类开发和应用其他生物技术。随着遗传操作和细胞培养技术,禽类胚胎部分被切割为外植体培养最终生成可扩展的细胞系(在体外细胞培养)。胚胎细胞的扩张让我们解开转录网络了解胚胎多能性和分化机制,结合干细胞技术促进鸟类文化的应用程序到下一个水平转基因技术和野生动物保护。在这次审查中,我们提供一个全景的关系在不同的培养平台蛋中蛋研究前女友蛋以及在体外文化的细胞系在干细胞领域的最新进展。

介绍

在哺乳动物中,它是不可行的观察胚胎在子宫外的发展从受精到出生。可能作为哺乳动物与鸟类能够为我们提供一个很好的模型观察这样的事。他们的优势是低成本不需要喂养的胚胎,易于处理鸡蛋,和简单的可视化的胚胎发育(沃伯特,2004;斯特恩,2005)。几项研究已经观察形态学改变蛋壳内的胚胎发展的窗口或将化合物注入卵子观察孵化率或生理反应的变化蛋中蛋研究中,或从天然蛋壳的胚胎新代理蛋壳semi-shell-less研究;然而,有一个限制在每个方法(1960银,;费舍尔和Schoenwolf, 1983年;Andacht et al ., 2004)。另外,完全消除各种类型的胚胎从天然蛋壳最近开发的人工血管进一步发展变化和观察基因操作前女友蛋研究。提供深入研究鸟类胚胎发生,部分胚胎被送往推导细胞系在体外文化包括胚胎干细胞(ESCs)和原始生殖细胞(包括),并成为一个重要的工具来理解多能性网络调节早期发展(van de Lavoir et al ., 2006;崔et al ., 2010;Aubel和疼痛,2013年;怀特et al ., 2015;Altgilbers et al ., 2021)。在体外文化基因操作还使我们能够研究的收益/损失函数和执行细胞重新编程产生诱导多能干细胞(万能)分化成所有类型的细胞的能力,类似于ESCs (戴et al ., 2014;片et al ., 2018)。因此,在本文中,我们强调技术的最新发展用于研究鸟类胚胎在两种蛋中蛋和前女友蛋培养以及环境参数影响孵化率和同样的角色在体外文化理解鸟类早期发展;特别是,干细胞多能性和细胞系进行了讨论。

蛋中蛋栽培:禽流感发展洞察力必不可少的工具

禽类胚胎发展中的钙carbonate-containing蛋壳提供保护和正常发展的一部分。这个蛋壳的封闭环境提供了足够的营养来自蛋黄和渗透压蛋白生成一个新的生活年轻的小鸡,不像接受继续支持在母亲的身体真兽类哺乳动物。禽卵的孤立和完整的系统发展到全面发展没有进一步的需求从母体材料,低成本和高可用性在家禽市场使我们能够轻松地研究鸟类物种的发展,尤其是国内小鸡(背带吊裤带家)。近年来,研究表明,最大的优点在于使用鸡蛋等生物技术的发展蛋中蛋交付生物补充剂和疫苗接种通过羊膜接种或胚胎体接种了赛义德et al ., 2019)。蛋中蛋喂养也起着重要的作用改善胃肠道的健康和免疫力,提高孵化率和抗病原体(综述Das et al ., 2021)。从4到5天发布了鸡蛋,绒毛膜尿囊的膜(CAM),血管膜负责气体直接交流,蛋壳,这发展蛋中蛋凸轮结构提供了一个很好的平台来研究不同的字段(综述Nowak-Sliwinska et al ., 2014),包括组织工程(如。、生物材料和生物传感器(博尔赫斯et al ., 2003;巴尔德斯et al ., 2003;Azzarello et al ., 2007),测试各种血管生成的化合物(Nowak-Sliwinska et al ., 2014)、药物筛选和治疗肿瘤的生长(Dupertuis et al ., 2015)。

为了解决禽类胚胎发展的机制,小鸡胚胎蛋中蛋被用来理解培养胚胎形态随时间的变化从敞开的窗口的蛋壳(窗口)方法(Speksnijder Ivarie, 2000;Andacht et al ., 2004;Korn和克莱默,2007),图1。发展的关键问题是理解多能性网络编排早期发展和如何保存这些网络跨物种,特别是哺乳动物和鸟类的模型。研究早期事件的时间表多能性收购(表示的存在Pou5f3(PouV),Sox2,Nanog]在鸟类物种是有限的发展由于发病以来已经发生子宫内的开发(汉et al ., 2018)需要牺牲的母鸡。在刚把蛋阶段,多能性已被证明不同雀和小鸡胚胎之间的芬奇胚盘把鸡蛋(EGK V-VIII)基因表达更为naive-like状态类似于天真的小鼠胚胎干细胞(制),而把蛋的鸡胚盘(EGK IX-XI)会令偏见类似于鼠标外胚层干细胞(EpiSC)。这表明,多能性机制在不同的鸟类物种多样性在刚下蛋的早期阶段,不能只依赖一个小鸡模型。最近的一项研究的蛋中蛋种间嵌合现象也显示了惊人的结果突出了多能状态相当于人类之间和小鸡在早期胚胎发育EGK X blastodermal细胞匹配与天真的人类多能干细胞(hPSCs),同时影射hPSCs可以纳入发育小鸡胚胎的外胚层(Akhlaghpour et al ., 2021)(图1)。此外,凸轮用于种间地理解多能性属性。传统上,小鼠模型已经被用来作为平台的肿瘤形成的ESCs或诱导多能干细胞(万能)建立不同种哺乳动物,以确保细胞拥有“多能性”的本质;的方法称为畸胎瘤化验。取代鼠标作为畸胎瘤的动物模型试验,凸轮蛋中蛋栽培作为一个平台用于播种人类则可以在凸轮和形成three-germ层包含肿瘤生长在37°C(9天内韦伯et al ., 2021)。综上所述,蛋中蛋研究仍然是一个重要的工具,一个理想的环境解开发展型国家和可以用来理解哺乳动物生殖发育机制,减少动物的使用,尤其是老鼠,3 r模型。

图1

图1。透视图的禽类胚胎文化前女友ovo-in蛋培养和在体外细胞培养。示意图说明的前女友蛋研究,鸟类胚胎在早期阶段可以收集到文化容器(如培养皿)和培养化学定义解决方案(如中列出表1)。在“无壳的”文化中,实验旨在培养胚胎没有天然蛋壳直到孵化。特定类型的无壳的文化了表1。暂时在“semi-shell-less”文化,早期胚胎培养文化船只,后来转移到代孕蛋壳的瘦蛋白。更大的蛋壳也需要从胚胎系统II, III。环境因素影响的成功和潜在的问题前女友蛋指出文化与胚胎系统》。蛋中蛋文化描绘了早期阶段(EGK X HH28,天0 - 5)的鸟类胚胎使用小鸡作为模型。一只小鸡胚胎的早期胚胎阶段的新鲜鸡蛋和阶段HH4 ESCs可以合并天真和影射,分别为(Akhlaghpour et al ., 2021)。黑红色的圆点在胚胎阶段HH14-19和HH25-28代表原始生殖细胞(包括)循环血管和迁移到生殖器山脊后来成为性腺(中村et al ., 2013)。描述的胚胎蛋中蛋也用于建立多能干细胞在吗在体外文化。特定文化条件支持鸟类ESCs / EGCs还指出,基因表达谱的简要列表片et al。(2018)。成纤维细胞是细胞重新编程的一个常见的来源。重组因子列表,Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K),原癌基因(M), Nanog (N),和Lin28 (L),列出以及细胞因子抑制剂用于禽流感iPSC感应。底部面板显示了连接在体外研究蛋中蛋工作,特别是如何生产转基因鸟类通过的慢病毒载体注射subgerminal腔(国网公司),转基因热解色谱,直接转染质粒成早期胚胎的背主动脉。布朗小鸡表明胚胎发展孵化。黑色的小鸡与红十字会表示不能孵化的胚胎孵化前或终止。Brown-white /棕绿色小鸡表明当前嵌合体的成功和转基因鸟类。缩写:AP +积极的碱性磷酸酶染色;美联社,透螟;艾娃,vasculosa区域;Avi,暗区vitellina;D。,embryonic day; EGC, embryonic germ cells; EGK,Eyal-Giladi和Kochav (1976)小鸡胚胎阶段;HH,汉堡包和汉密尔顿(1951)小鸡胚胎阶段;为,人类胚胎干细胞;GC,生殖能力。

前女友蛋禽类胚胎的培养:环境参数成功孵化

前女友蛋文化是一个系统,在这个系统中删除原来的蛋壳,和胚胎转移到新的文化环境,包括代孕蛋壳、培养皿、人工eggshell-like船只(小野,2000;Borwompinyo et al ., 2005;刘et al ., 2012;Tahara Obara, 2014)。通过移除蛋壳,前女友蛋文化让我们操作发展胚胎在某些阶段为手术方法(Cloney Franz-Odendaal, 2015)。当然,它也铺平了道路,寻求如何胚胎发展没有防护层(Buskohl et al ., 2012)。许多研究已经使用这种技术在血管生成等几个方面(Hockel et al ., 1987)、内渗化验(Uchibayashi et al ., 1992)、移植和肿瘤形成(Dohle et al ., 2009;维拉纽瓦和Sikora, 2022)。此外,该技术可以应用于高中的课程和高级发育生物学研究领域(Buskohl et al ., 2012;多雷尔et al ., 2012;Cloney Franz-Odendaal, 2015)。

因为之前的研究显示,代谢和蛋壳内部环境发生巨大的变化在不同的阶段(Givisiez et al ., 2020),前女友蛋旨在遵循培养胚胎发育直到孵化需要找到最优的平衡几个因素,特别是需氧量,湿度,和钙的需求。一般来说,小鸡胚胎的发展可分为三个阶段:受精胚盘形成(天0-day 1),胚胎发生(天3天),胚胎生长(为期4天21天)(佩里,1988)。迄今为止,三个不同的系统可以用罗马数字分为三个系统:系统我(天0-day 1),系统II(天3天),和系统III(天为期4天21)。不同的技术或修改方法的细节描述在先前的研究进行了总结表1。在这里,我们还提供洞察每个参数(电流-电压)成功所必需的前女友蛋禽流感的研究和孵化率与三个阶段发展图1)。

表1

表1。时间轴的前女友蛋技术开发的理解鸟类物种的胚胎发育。

潜伏期和胚胎阶段

值得注意的是,胚胎时代是操纵的关键因素前女友蛋培养的胚胎。增加生存能力在培养过程中,胚胎转移到新的文化血管后阶段HH15-16 (汉堡包和汉密尔顿,1951年)推荐(Tahara Obara, 2014)。这些胚胎发展不会电影和乳酸钙补充蒸馏水导致生存率90% (Tahara Obara, 2014)。Tahara和Obara (2014)还显示,胚胎转移到培养容器后阶段HH16显示生存能力在8天的孵化。因此,潜伏期的时间之前转移到新的环境起着非常重要的作用在提高生存能力。理想情况下,胚胎应该转移到新的培养瓶在阶段HH19 (罗莱特Simkiss, 1989;Borwompinyo et al ., 2005)。尽管不同蛋之间的预培养时间阶段HH13和16个胚胎存活的影响,高生存能力还观察到前阶段HH15 (Tahara Obara, 2014)。除了胚胎的年龄,有报道称,与卵黄膜必须谨慎,因为它很容易受损而转移到新的培养瓶(Tahara Obara, 2014)。这可以看到尤其操纵after-stage HH17胚胎。Dohle et al。(2009)报道,舞台HH35(约9天的孵化)胚胎不太敏感的风潮相比,那些在早期阶段。此外,的存活率前女友蛋培养的胚胎可以高到90 - 100% HH35当他们到达阶段,但是在后期下降,在阶段HH40-41 (Cloney Franz-Odendaal, 2015)。潜伏期,处理正确的时间获得正确的胚胎阶段推进孵化的至关重要前女友蛋文化技术。

温度和湿度

实际上,孵化器内的温度不应低于38°C,这可能会导致发育迟缓(Dohle et al ., 2009报道),理想的湿度在40% (Cloney Franz-Odendaal, 2015)。然而,据报道,文化容器的顶部覆盖一个聚苯乙烯塑料盖子可以保持100%的湿度,可以是各种38°C,湿度80% (Tahara Obara, 2014)。当凸轮形成,可以认识到在3天的孵化,防止干燥的湿度是至关重要的胚胎结构(Dohle et al ., 2009)。重要的是,系统的湿度在卵黄囊的形成是至关重要的阶段降低湿度,低于60%,这导致了凸轮断裂通过坚持蛋壳(Dohle et al ., 2009)。对于关注与水循环系统,Yalcin et al。(2010)建议文化应该保持在一个最佳的温度。船舶结构的设计不仅防止水分流失,促进氧气供应(Tahara Obara, 2014)。安装一个文化系统中的循环水浴有助于维护开发胚胎的孵化温度(Yalcin et al ., 2010)。此外,也用于调节电阻加热器水温(Yalcin et al ., 2010)。

补充钙

主要是碳酸钙,钙是蛋壳的主要成分之一(扫描和克里斯坦森,2020年),作为三级保护发展中胚胎(信封Bellairs婚礼,2014)。大部分的钙提供给胚胎直到孵化来源于蛋壳(罗莱特Simkiss, 1987;Kamihira et al ., 1998)。此外,还需要从蛋壳钙骨化,和其赤字导致肢体畸形(Cloney Franz-Odendaal, 2015);因此,需要提供钙发展胚胎(艾略特和班尼特,1971年;罗莱特Simkiss, 1987)。在前女友蛋文化,没有蛋壳作为防护结构的胚胎发展导致高死亡率(Tahara Obara, 2021)。因此,添加碳酸钙凸轮的无壳的帮助培养胚胎孵化率增加40%以上(Tahara et al ., 2021)。Kamihira et al。(1998)报道,各种形式的钙包括蛋壳粉和乳酸钙也可以添加到蛋白作为钙源蛋壳后删除。尽管碳酸钙是主要的蛋壳中发现的物质,它未能提高孵化率率无壳的系统(Tahara et al ., 2021)。另外,乳酸钙被证明提高培养胚胎孵化率率较低毒性(Kamihira et al ., 1998;Tahara Obara, 2014)。然而,补充碳酸钙可以提高孵化率高达40%如果是添加到凸轮(Tahara et al ., 2021)。这些表明,钙的补充与发展所需的最低要求是胚胎孵化的无壳的系统。此外,信息理解的细节可用性和钙动力学在胚胎发育期间这个系统仍然需要功能和分子研究。

氧气供应

曝气在文化船只是强制性的存活的胚胎由于胚胎蒸腾水分的损失(Dohle et al ., 2009)。重要的是,孵化率的效率可以提高通过添加纯氧文化容器(Kamihira et al ., 1998;Tahara Obara, 2014)。以前的研究报道,在后期胚胎存活的数量在纯氧文化系统是高于50%,表明孵化率高的成就在这种人工培养容器(Kamihira et al ., 1998;Tahara Obara, 2014)。实际上,这种文化的曝气系统能通风的洞的顶部密封膜(Tahara Obara, 2014)。理想情况下,与纯氧曝气速率塑料管安装在船只应该是500毫升/小时,应该做好充分的准备,孵化的胚胎不能生存没有氧气供应(Tahara Obara, 2014)。罗莱特和Simkiss (1989)报道称,小鸡胚胎培养在人工血管的“薄膜”容易缺氧和低碳酸血。此外,氧曝气的早期文化应该是一个关注由于其毒性作用,可以减少胚胎的发育能力(Tahara Obara, 2014)。明显,后期(HH43-44阶段),在大约17天的孵化,可以发现通过改变氧气不足的颜色CAM血管(多雷尔et al ., 2012;Tahara Obara, 2014;Tahara et al ., 2021),这表明氧曝气的后期是必不可少的前女友蛋文化。

密封膜

有利,前女友蛋文化,一个透明的塑料薄膜的使用允许胚胎驻留摇篮,即吊床(Kamihira et al ., 1998;Yalcin et al ., 2010;Tahara Obara, 2014中提到的)表1。这种材料的粘结力与文化血管相对较低。橡皮筋是小心翼翼地用来加强电影文化船只坚决避免胚胎死亡率在操作(Cloney Franz-Odendaal, 2015)。一项研究报道,鸡蛋和密封材料的文化定位血管影响孵化率率(Borwompinyo et al ., 2005);包括Handi和萨兰塑料薄膜的封口材料能够提高孵化率的百分比(Borwompinyo et al ., 2005)。有不同类型的塑料包装如聚乙烯、聚偏二氯乙烯,不会潮湿。Tahara和Obara (2014)证明这些材料应具备氧气渗透。也会增加生存能力和孵化率的一个重要的一点是造成的膜表面自膜皱纹抚平文化胚胎存活率较低(Tahara Obara, 2014,2021年)。尽管使用透明的电影将有助于促进whole-embryo观察,一些缺点的属性应该改善提高孵化率率。

在体外文化:基本工具包禽流感多能性研究,转基因技术和保护

多能细胞在胚胎被限制在某些时期,在一些胚胎组织,胚胎多能性机制的理解是有限的。的出现在体外文化从禽类胚胎多能性网络使我们能够研究和可能的使用干细胞细胞系(GCSCs)鸟类生物技术,特别是基因编辑、转基因技术和野生鸟类保护(汉et al ., 2015)。有四个主要类型的GCSCs可以来源于在体外禽类胚胎组织文化:blastodermal细胞/胚胎干细胞(ESCs),胚胎生殖细胞(EGCs),原始生殖细胞(包括),和精原干细胞(精原细胞)(汉et al ., 2015)。ESCs的发现小鸡和blastodermal细胞培养强调守恒的网络调节多能性要求至少白血病抑制因子(生活)(蚀刻et al ., 1997;疼痛et al ., 1996细胞因子),一个用于文化ESCs天真的老鼠和万能(丹羽宇一郎et al ., 1998;高桥和山中,2006)。此外,基本成纤维细胞生长因子(bFGF),细胞因子用于培养影射人类ESCs /万能(汤姆森et al ., 1998;高桥et al ., 2007),需要在一些鸟类的ESCs /万能干细胞研究(疼痛et al ., 1996;van de Lavoir et al ., 2006;怀特et al ., 2015;崔et al ., 2016;片et al ., 2018)。因此,这表明多能干细胞从鸟类物种表现出一些偏见naive-primed方向补充剂可能依赖于其他文化。几项研究已经使用(Aubel和疼痛,2013年)协议文化小鸡在DMEM / F12包含其他几个细胞因子的细胞则除了生活和/或bFGF (FGF2)包括IGF1、自洽场,白细胞介素6、sIL6 Rα(戴et al ., 2014;Fuet和疼痛,2017年;Fuet et al ., 2018)。迫使多能细胞倾向幼稚状态,两个抑制剂(我)鸡尾酒包括CHIR99021 (GSK3抑制剂)和PD0325901 (MEK抑制剂),通常用于天真的鼠标ESCs (应et al ., 2008)也可以支持建立小鸡万能干细胞(戴et al ., 2014;片et al ., 2018;元et al ., 2021),如所示图1。在禽类细胞重新编程,交付和表达系统的选择和重组因子诱导万能的成功的关键。外源基因传递可以做到的通过使用病毒(逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒)(戴et al ., 2014;Fuet et al ., 2018)和liposome-based转染piggyBac转座子携带一个多顺反子重组磁带(修改Oct4、Sox2 Klf4,原癌基因,Lin28, Nanog) (片et al ., 2018)(图1)。重组因子用于诱导禽类细胞则不同的一些研究,但至少Oct4 Sox2在所有研究(戴et al ., 2014;Fuet和疼痛,2017年;Fuet et al ., 2018;片et al ., 2018),而Klf4和原癌基因Nanog和Lin28所取代元et al . (2021),赵et al . (2021)。Fuet et al . (2018)还表明,Nanog是至关重要的长期iPSC文化。除了多能干细胞,在体外文化允许勘探的原始生殖细胞(包括)规范机制。它已经表明,鸟类包括不需要的生活自我更新(怀特et al ., 2015),而哺乳动物包括需要它(利奇et al ., 2013)。,而是只包括,它更像哺乳动物发育外胚层(或在体外鼠标EpiSCs),可以支持FGF2下,胰岛素,activin-BMP4诱导SMAD信号(怀特et al ., 2015)。同样,小鸡万能干细胞可以分化成诱导热解色谱(iPGCs)可以移植到另一个小鸡胚胎产生的应变可以存活的后代(赵et al ., 2021)。

在体外文化也支持ESCs的转录组分析的研究建立/ iPSC细胞系和揭示了保护和独特性pluripotency-related鸟类物种的转录网络(琼et al ., 2015;片et al ., 2018)。ESCs的列表/热解色谱与纤维母细胞标记所示图1。最后,关键的优势在体外文化是建立细胞系的应用包括GCSCs回蛋中蛋培养生产种间禽流感嵌合体(在鸟类物种甚至哺乳动物鸟类物种),如图所示图1。转基因鸟类的早期技术,转基因技术在小鸡胚胎是使用virus-dependent方法做的,例如,慢病毒载体注射到subgerminal腔的早期胚胎(查普曼et al ., 2005)。的出现,包括文化可以让我们方便的操纵基因传递通过转染(脂质转染或nucleofection)所示的成功稳定的集成绿色荧光蛋白转基因在宿主基因组,后来转基因热解色谱可以移植的胚胎,最终产生嵌合体和转基因小鸡(公园和汉,2012年)。最近,直接注射质粒携带的基因利益,连同liposome-based试剂,小鸡胚胎的背主动脉包含循环包括执行的成功生产转基因后代鹌鹑(Serralbo et al ., 2020)。总的来说,实现在体外文化与蛋中蛋应用程序和禽类胚胎可塑性接受异种移植细胞提供一个希望使用鸡胚作为平台传播在干细胞保护濒临灭绝的野生鸟类。

未来的建议和结论

为前女友蛋环境,探索可能的途径如何文化禽类胚胎没有自然壳继续成像技术的进一步发展,化学,和nano-biomaterial技术,可以提供更加精巧蛋壳类似自然的和适合深度成像等受欢迎的实验胚胎或与人工转基因胚胎蛋壳完好无损。除了在体外文化,研究细胞重新编程和ESCs推导各种鸟类物种仍然需要理解的本质naive-primed多能性与生殖系competency-the好处的理解是,有一天它能提供长期安全,防止鸟类物种的灭绝。

作者的贡献

WS和SI构思的想法。在WS,如果造成了写作的手稿。所有作者的文章和批准提交的手稿。

资金

这项工作是支持的东南亚联合研究项目(东南亚JRP)是由泰国国家研究委员会(批准号N33A640448)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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引用

Akhlaghpour。,Taei A。,Ghadami S. A., Bahadori Z., Yakhkeshi S., Molamohammadi S., et al. (2021). Chicken Interspecies Chimerism Unveils Human Pluripotency.阀杆移动电话代表。16日,39-55。doi: 10.1016 / j.stemcr.2020.11.014

CrossRef全文|谷歌学术搜索

Altgilbers年代。克莱恩S。,Dierks C., Weigend S., Kues W. A. (2021). Cultivation and Characterization of Primordial Germ Cells from Blue Layer Hybrids (Araucana Crossbreeds) and Generation of Germline Chimeric Chickens.科学。代表。11日,12923年。doi: 10.1038 / s41598 - 021 - 91490 - y